实验十一 金属螯合亲和层析分离蛋白质
金属螯合亲和色谱中固定金属与蛋白质的作用
说明蛋白质和固定金属的结合主要是较强的配位键起作用 。用纯粹组氨酸 ( His) 和甘氨酸 ( Gly) 的缓冲 液蛋白质也不被洗脱 ,仅在其中加入一定量的 NaCl 后蛋白质才被洗脱 ( 表 2) 。这个事实表明蛋白质和
表2 在 IDA2Cu 柱上竞争洗脱剂对蛋白质保留的影响 Table 2 Influence of competitive eluent on protein retention on IDA 2Cu column
1 引 言
金属螯合亲和色谱是最近二十几年发展起来的一种新的分离技术 。此法是基于蛋白质与固定金 属的亲和作用进行分离 。因此 ,研究蛋白质和金属离子的作用 ,对于提高金属螯合色谱的选择性和实现 最佳分离十分重要 。关于蛋白质在金属螯合色谱中的保留机理迄今还没有一个完满的结论 ,多数学者 认为蛋白质在金属螯合柱上的保留是由于蛋白质和固定金属的配位作用 。但是 ,对于配位作用的大 小与哪些因素有关 ,静电作用对蛋白质保留产生什么影响以及不同色谱条件下各种力所起的作用研究 较少 。本工作通过考察不同 pH 下蛋白质在裸柱和金属螯合柱上的保留特征 , 探讨了固定金属与蛋白 质间的相互作用 。
不流出 no 不流出 no 不流出 no 不流出 no
流动相 (mobile phase) :A. 0. 02 molΠ L KH2 PO4 ,B. 0. 02 molΠ L KH2 PO4 + 0. 5 molΠ L NaCl ; 梯度洗脱 (gradient elution) :20 min B 从 (from) 0 到 (to) 100 % ; 流速 (flow rate) :1 mLΠ λ= 280 nm) ; 进样量 ( size of sample) :20 μ min ; 检测器 (detector) :UV( L ; 各蛋白浓度 (concentration of each protein) 3. 0 gΠ L ; IDA :iminodiacetic acid ; RNase :ribonucleas ; Cyt2C : cytochrome ; Lys :lysozyme
金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究
李淑娟等：金属萱台亲和层析介质用于六聚组氨酸融台蛋白的纯化研究度测定结果可粗略计算：２００血裂解液纯化后所得ｃＤｌ５５Ｄ１融合蛋白量约为２００旭。
２．５ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ－ｓｅｐｈａｒ∞ｅ用于六聚组氨酸融合蛋白大量纯化的初步研究根据小量纯化的优化条件，将介质体积放大２５倍纯化六聚组氨酸融合蛋白ｃＤｌ５５Ｄｌ，取５０％的ｃｏ－ｃＭ．Ａ叩一ｓｅｐｈａｒ姻ｅ悬浮液１．５ｍＬ与５ｍＬ含ｃＤｌ５５Ｄｌ的细胞裂解液孵育，ｃｏ．ｃＭ．Ａ８ｐ．ｓ８ｐＩｌ哪ｓｅ悬浮液装入层析柱中，洗柱后用５ｍＬ含２００ｍｍｌ，Ｌ咪唑的ｃ液洗脱蛋白，收集洗脱液５ｍＬ。
用Ｂｍｄ州法测定蛋白浓度并计算可知蛋白质总量为４．６ｎ蜗。
２．６Ｃｏ・ＣＭ－Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏ辨与Ｎｉ・ＮＴＡ・Ａ辨ｒｏ辨的比较将ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ—ｓｅｐｈ删ｓｅ与商品化Ｎｉ—Ｎ１俳Ａｇａｒｏｓｅ进行蛋白纯化的比较，取５０％的ｃｏ－ｃＭ．Ａ８ｐ．ｓｅｐｈａｌｏｓｅ悬浮液和５０％的Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａ静ｒｏ特悬浮液各６０皿分别与２００ｆｔＬ含六聚组氨酸融合蛋白ｇｐ４ｌ（分子量３６ｋＤ）的细胞裂解液孵育，并按各自清洗溶液对介质清洗后洗脱蛋白，对纯化后的剩余液和洗脱液进行ｓＤＳ．ＰＡＧＥ，结果如图６所示。
从图６中可看出经ｃ０．ＣＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏ∞与Ｑｉａｇｅｎ公司的Ｎｉ．Ｎ１ｒＡ．Ａ∞”介质纯化后剩余液中蛋白质的组成几乎一样，洗脱得到卵４１蛋白的量相当，说明两者蛋白结合容量差别不大。
但是，以Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａ朗ｆ０８ｅ纯化后的洗脱液电泳结果中可见有少量杂蛋白的条带，而且与ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ．ｓ印ｈａｒ∞ｅ相比，Ｎｉ，ＭｒＡ．Ａｇ啪眈介质纯化后剩余液泳道中杂蛋白减少较多，说明有较多的杂蛋白非特异性结合到Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａｇｍ”介质上，便影响了纯化后所得蛋白的纯度。
这与文献中报道含镍螯台介质可与不含六个组氨酸残端的蛋白结合，因而会表现出一定非特异性吸附的结果一致““。
而以ｃｏ－ｃＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏｓｅ纯化的洗脱液电泳条带中不存在杂蛋白，可见ｃｏ—ｃＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｍｓｅ对融合蛋白选择性高，非特异性吸附降低，因而表现出较好的纯化效果。
纯化可溶蛋白实验报告
一、实验目的1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法；2. 掌握利用金属螯合亲和层析（Metal Chelating Affinity Chromatography，MCAC）纯化可溶蛋白的操作步骤；3. 了解蛋白质纯化过程中的关键参数和注意事项。
二、实验原理金属螯合亲和层析是一种基于蛋白质与金属离子特异性结合的纯化方法。
在实验中，利用带有组氨酸尾的融合蛋白与镍离子特异性结合的特性，通过金属螯合亲和层析柱进行分离纯化。
三、实验材料1. 培养基：M9ZB/氨苄青霉素/氯霉素培养基、IPTG；2. 菌株：大肠杆菌BL21（DE3）pLyaS；3. 试剂：MCAC-EDTA、Triton X-100、蛋白酶抑制剂、NiSO4、去离子水、50mmol/L MCAC-0缓冲液；4. 仪器：摇床、离心机、层析柱、分光光度计。
四、实验步骤1. 接种：将含pET载体表达带组氨酸尾融合蛋白的大肠杆菌BL21（DE3）pLyaS菌株接种于10 ml M9ZB/氨苄青霉素/氯霉素培养基中，37℃摇荡培养过夜。
2. 转接：取1 ml过夜培养物转接至100 ml M9ZB/氨苄青霉素/氯霉素培养基中，37℃摇荡培养至OD600为0.7~1.0。
3. 诱导表达：加入1 ml 0.1 mol/L IPTG，37℃继续培养1~3 h。
4. 收集菌体：4℃、4000 g离心10 min，弃上清，收集菌体沉淀。
5. 重悬菌体：将菌体沉淀加入冰浴中冻融，加入5 ml MCAC-0缓冲液和33 μl 150蛋白酶抑制剂混合液，用吸管吹打重悬，超声破菌或匀浆。
6. 纯化：将重悬的菌体加入装有1 ml NTA介质的层析柱中，用去离子水、50 mmol/L NiSO4、MCAC-0缓冲液依次洗柱。
7. 收集目的蛋白：收集结合在层析柱上的目的蛋白，用适当缓冲液洗脱。
8. 蛋白质浓度测定：利用分光光度计测定洗脱液中蛋白质浓度。
五、实验结果与分析1. 通过金属螯合亲和层析，成功纯化了带组氨酸尾的融合蛋白。
融合蛋白纯化实验报告
1. 学习并掌握融合蛋白的纯化方法；2. 掌握金属螯合亲和层析技术；3. 提高蛋白质分离纯化操作技能。
二、实验原理融合蛋白是指将目的蛋白与另一个蛋白（如载体蛋白、酶等）通过化学键连接在一起形成的蛋白质。
融合蛋白的纯化可以通过多种方法实现，其中金属螯合亲和层析是一种常用的纯化技术。
该方法利用目的蛋白与载体蛋白之间特定的相互作用，将目的蛋白从混合物中分离出来。
三、实验材料1. 融合蛋白样品；2. 金属螯合亲和层析柱；3. 亲和层析介质（如Ni-NTA）；4. 洗脱缓冲液；5. 蛋白质检测试剂；6. 离心机；7. 其他实验试剂。
四、实验步骤1. 准备亲和层析柱：将亲和层析介质加入层析柱中，用洗脱缓冲液平衡层析柱。
2. 样品上柱：将融合蛋白样品加至层析柱中，让其自然流出。
3. 洗脱：用洗脱缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱液。
4. 收集目标蛋白：将收集到的洗脱液进行蛋白质检测，确定目标蛋白的存在。
5. 离心分离：将收集到的目标蛋白样品进行离心，分离出纯化的融合蛋白。
6. 蛋白质检测：对纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE、Western blot等检测，验证纯化效果。
1. 亲和层析柱平衡后，样品顺利上柱，洗脱过程中目标蛋白得以分离。
2. 蛋白质检测结果显示，纯化的融合蛋白在预期位置出现条带，证明纯化效果良好。
3. SDS-PAGE结果显示，纯化的融合蛋白纯度较高，未发现其他杂蛋白。
4. Western blot结果显示，纯化的融合蛋白与特异性抗体结合良好，进一步证明纯化效果。
六、实验讨论1. 在实验过程中，应注意控制层析柱的流速，避免样品过快通过层析柱，导致目标蛋白丢失。
2. 亲和层析介质的装载量对纯化效果有较大影响，需根据实验需求调整。
3. 洗脱缓冲液的pH、离子强度等参数对目标蛋白的洗脱效果有较大影响，需根据实验需求优化。
4. 实验过程中，应注意蛋白质的稳定性，避免蛋白质降解。
七、实验结论本实验成功纯化了融合蛋白，验证了金属螯合亲和层析技术在融合蛋白纯化中的应用。
生化分析实验金属螯和层析MCAC_XP
• Column: Glutathione Sepharose 4B, pre-packed • Binding: PBS + 1% Triton X-100 • Elution: 5 mM Glutathione, 50 mM Tris.HCl,
金属螯合层析的介质通常是在惰性 支持物上接有固定化的金属离子， 组氨酸与金属离子具有螯合作用， 对于具有不同组氨酸含量的不同蛋 白质分子对于一定金属离子的亲和 力大小不同 ，因而可通过柱层析进 行分离。
二、金属螯合剂
在Sepharos上接有亚氨基二乙酸 Iminodiacetic acid , IDE 将氯化锌或硫酸铜等溶液通过该柱时即
Affinity tag
Ligand
Glutathione-S-Transferase (GST) Glutat
Nickel ions
E tag sequence
Anti-E antibody
ZZ (domain B of protein A) IgG
M GuHCl (depends on tag) • A protease cleavage site allows the tag to be
removed after purification • Purity typically >90% in one step
Elution with Competing free ligand
四、实验方法
20mM, pH8.0 PBS+0.5M NaCl + CuSO4 平衡Buffer平衡 上样 改变 pH 或 离子强度洗脱 50mM EDTA 再生除去金属离子
金属螯合亲和层析
金属螯合亲和层析金属螯合亲和层析是一种高效的分离纯化生物大分子的方法，广泛应用于蛋白质纯化，DNA/RNA纯化等领域。
下面将分步骤介绍金属螯合亲和层析的原理及操作流程。
第一步：构建亲和基质金属螯合亲和层析的分离原理是利用某些高亲和力的金属离子与其相应的配体与靶分子结合，从而使靶分子被捕获。
这种配体常常固定于亲和基质表面，构建亲和基质的关键是选择合适的金属离子和其配体。
常见的金属离子有Ni2+、Co2+和Cu2+等，这些离子可以与其持有的受体配体如亚胺啉、六联苯等形成螯合配合物，以 Ni-NTA、Ni-IDA、Co-IDA、Cu-IDA 等形式固定于亲和基质表面。
第二步：样品制备亲和层析在蛋白质纯化中的应用最为广泛，因此这里以蛋白质为例进行说明。
样品制备是成功的亲和层析关键之一，通常需要选择合适的缓冲液及添加剂，使得靶蛋白的活性、溶解度、稳定性得到最大保留，常用的缓冲液体系包括Hepes、Tris、phosphate等，而添加剂可以选择二甲基亚砜（DMSO）、尿素（Urea）、磷酸胆碱（chaps）等。
第三步：亲和层析操作样品处理之后，接下来就可以进入亲和层析的实验操作。
实际操作中主要分为以下几步：1. 平衡柱子：向亲和柱子填充亲和基质后，需要先平衡柱子，以充分溶解亲和基质表面的螯合金属离子，以避免在样品加入前柱子失去充分活性。
2. 样品加入：将样品注入柱子中，使其充分与亲和基质表面的螯合金属离子发生作用，然后充分洗涤以去除非特异性相关结合物。
3. 目标蛋白的洗脱：将目标蛋白从亲和基质柱中洗脱，这一步操作通常是使用间断性洗脱或温度递降洗脱方法，以脱离目标蛋白并消除杂质、副产物等。
4. 制备纯度较高的目标蛋白：获得目标蛋白后，还需要通过蛋白质纯化的其他方法如离子交换层析、凝胶过滤等的多次层析，才能最终得到纯度超过90%的目标蛋白。
综上所述，金属螯合亲和层析技术已经成为了分离纯化生物大分子的重要方法之一，从缓冲液的制备到柱子等操作都十分关键。
金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究
!"卷#期$%%%年&月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12’()*!"+(*#,-).!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!$%%%金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究孙旭东李红旗隋洪艳沈忠耀（清华大学化工系北京!%%%1#）摘要金属螯合亲和层析是近$%年发展起来的一项新型分离技术。
它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。
本文从单组分蛋白质入手，考查了23值、铵离子浓度、不同铵盐等对蛋白质洗脱的影响，并进行了分析。
还对不同的金属螯合柱和不同性质蛋白质的洗脱性能进行了研究，比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别，为实际体系的分离研究打下了基础。
关键词金属螯合亲和层析，牛血清白蛋白，血红蛋白，分离中图分类号41!5文献标识码6文章编号!%%%07%"!（$%%%）%#0%#/50%5金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析（899(:;);<=>?=@A)8(B6C C;B;@.D E F(9A@(0 G F A2E.，简称8?6D），是近$%年发展起来的一项新型分离技术。
最早由H A F(@E等人［!，$］提出。
该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸，例如组氨酸、色氨酸、赖氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而对蛋白质加以分离［7］。
由于它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一［#］。
本文主要以单组分蛋白质牛血清白蛋白（I J6）和血红蛋白为研究对象，考查了23值、铵离子浓度及阴离子等不同洗脱条件对出峰时间的影响。
对不同的金属螯合柱的性能和不同单组分蛋白质的洗脱性能进行了研究，比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别，为实际生物产品的分离奠定了基础。
亲和层析法离纯化蛋白质的方法
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
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实验十一金属螯合亲和层析分离蛋白质
【实验目的】
1．学习亲和层析的原理。
2．掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。
【实验原理】
亲和层析是以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这样的方法称为金属螯合亲和层析。
蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。
已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。
过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质，在碱性pH时，使吸附更有效，但选择性降低。
金属螯合亲和层析行为在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。
本实验室纯化的目的蛋白是用IPTG诱导表达的pGFPuv,该蛋白是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标记物，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。
【试剂与器材】
〈一〉试剂
1. 0.05mol/L EDTA—0.5mol/L ，NaCL溶液100mL
2. 2mol/L NaCL 溶液50mL
3. 1mol/L NaOH溶液50mL
4. 0.2mol/L NiSO4溶液50mL
5. 平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，pH7.0 500mL
6. Ni2＋Chelating Sepharose Fast Flow 5－10 mL
7. 重组pGFPuv质粒大肠杆菌工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白样品20—50ml
8. 洗涤液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaC,pH 7.0
9. 洗脱液：300mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL.pH7.0
10 20%乙醇溶液50ml
〈二〉器材
1. 1.5cm X 50cm层析柱
2. 蠕动泵
3. 紫外检测仪
4. 自动收集器
5. 伍豪色谱工作站
【操作方法】
1. 样品的制备
细胞的培养及荧光蛋白表达看实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25 ℃用细胞培养液，8000r/min，离心5min，去上清液，菌体用平衡缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积的平衡缓冲液充分悬浮，冰浴下进行高压破菌处理。
然后8000r/min。
离心30min，取上清液。
放冰箱备用。
2. 亲和层析柱的安装
把层析柱固定在铁支架上，上端的柱头拧下，柱下端出口用夹子封闭。
加入少量的无离子水，排去下端的空气泡。
取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶5－10mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和凝胶剂随水流自然沉下。
亲和层析剂为5—10mL。
然后，将上端的柱头拧紧，并将顶端和下端用软管连接封闭备用。
3. 层析系统的安装、调试
（1）蠕动泵的调试：打开背后电源开关，按下start按钮，上下箭头调节流速为15rpm（约2ml/min），将软管充满去离子水。
（2）系统的连接：将蠕动泵的出水管与层析柱上端管相连，层析柱的下端管与紫外检测仪的进样端连接，将紫外检测仪的out端与自动收集器相连。
（3）紫外收集器的调试：打开紫外背后开关，调节灵敏度旋钮（ABS－Range），调节调零旋钮。
（4）自动收集器的设置：打开电源开关，按“复位”键，确定出液管的位置，按“手动”按钮，进行设置，如选择120seconds一管进行收集，按“自动”即开始计时收集。
（5）伍豪色谱工作站的使用方法：点击桌面的“伍豪色谱工作站“图标打开程序，点击左上角的图标，选择A或B通道，点击“▲”即开始采样，采样结束后点击“■”即结束采样，然后载入A 或B通道谱图，保存结果，并打印结果。
4. 层析柱的使用前处理：
（1）用5X柱床体积去离子水清洗乙醇封存的Ni 2＋-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱，去除乙醇
（2）用2X柱床体积的0.2M NiSO4过柱，注意观察现象
（3）用10X柱床体积的去离子水清洗，用5X柱床体积平衡缓冲液平衡柱子
5. 上样：
先从20 mL裂解上清液中取出50 µL用于电泳，作为亲和层析分离前上清液中的总蛋白区带对照图谱。
然后以每分钟2 mL的流速上层析柱，分部收集流出液，每管3 mL（记录的紫外吸收峰为穿流峰，取最高的一管样品液用作电泳）。
平衡缓冲液过层析柱，直到紫外吸收峰不再下降（达到平台期为止）。
6. 洗涤：
用含50 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液25 mL冼脱，分部收集洗脱液，每管5 mL，取紫外吸收最高的一管用于电泳。
7. 洗脱：
用含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液10 mL洗脱，自动收集洗脱液。
每管收5 mL，当紫外吸收达最高峰时取样用于电泳及Western blotting实验。
8. 层析柱的后处理及封存：
（1）用2X去离子水清洗柱子
（2）用10X0.5M NaCl，50mM EDTA (pH 8.0) 洗去结合的镍离子
（3）用10X去离子水清洗柱子
（4）用10X1M NaOH洗柱，去残留蛋白
（5）用大约10X去离子水清洗柱，去除NaOH，直到pH值低于9
（6）用大约2X柱床体积乙醇过柱，拆除柱子，保存柱料于20％乙醇中
9. 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：
分别取50μL穿流峰流出液、50mmol/L咪唑缓冲液洗涤的流出液和300mmol/L咪唑缓冲液洗脱的流出液。
外加一个上柱前的样品液和蛋白Marker作比较。
进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和层析分离纯化的结果。
【注意事项与提示】
1. 不管是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过程中，水或溶液面都不能低于凝胶柱平面。
否则，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效果。
2. 样品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分离效果才好。
3. 亲和层析剂可回收，经再生可循环使用。
该亲和层析剂用20%乙醇浸泡于冰箱保存。
4. 亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色都有明显变化（白、蓝、绿），只要细心操作，样品是否被吸附上去或被洗脱下来？都能观察到从而作出判断。
5. IPTG诱导表达的荧光蛋白经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如下：
1为蛋白分子量标准Marker
2为没有表达产物荧光蛋白的细菌总蛋白区带。
3为诱导表达产物的细菌总蛋区带。
明显多出一条区带。
4为样品上层析柱时的流出液（穿流峰）蛋白区带。
5、6、7为含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱出来的荧光蛋白带。
【实验安排】
1）细胞的破碎及总蛋白质的收集需半天。
2）金属螯合亲和层析柱的处理及分离荧光蛋白需半天。
3）12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测需一天，但可在样品上柱层析分离时制备好凝胶，层析分离完成后即可进行凝胶电泳。
【实验报告要求与思考题】
1. 要求提交IPTG诱导表达的荧光蛋白经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图；
2. 亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色有何变化？为什么？
3. 要达到好的分离效果要注意哪些问题？。