镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)说明
镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书
一、简介
金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。
镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。
二、性能参数：
特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便
基质6%的交联琼脂糖凝胶
配体 Ni2+
配体密度20-40μmol /ml
吸附载量15mg蛋白/ml
介质颗粒大小45-165μm
最大流速600cm/h
pH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11
保存温度+4-8℃
保存液体20%乙醇
三、适用范围
分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。四、应用实例
实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白
实验步骤：
1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；
2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；
3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为
1ml/min；
4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；
5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，
收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4-8℃环境中保存。
缓冲液组成：
缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH
2PO
4
19ml，0.5M Na
2
HPO
4
81ml，NaCl 29.3g,
加适量水溶解后定容到1000ml。
缓冲液2：50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH
2PO
4
19ml，0.5M
Na
2HPO
4
81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g, 加适量，水调pH后定容到1000ml。
缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液B配制：
咪唑浓度缓冲液1量(ml) 缓冲液2量(ml)
10 mM 98 2
20 mM 96 4
50 mM 90 10
100 mM 80 20
200 mM 60 40
300mM 40 60
400 mM 20 80
SDS-PAGE流程：
1、BCA法测量样品蛋白浓度
2、根据测定样品的蛋白浓度，算出5~10μg/孔所需的体积。
3、向1.5ml EP管中加入含5~10μg蛋白的样品溶液，若体积小于10μl，则加20mM PBS pH7.4补足10μl；若体积大于10μl，则要加入1ml无水乙醇，－20℃下浓缩1h。
4、取浓缩样品10000rpm离心15min，除去上清，37℃烘箱10min去除残余的乙醇。
5、在样品加入20mM PBS pH7.4和2×loading buffer各10μl，100℃下10min。取出后冷却30s，4000rpm离心1s。
6、点样，电泳。
实验结果：
（1）使用Ni-NTA Agarose纯化His标签重组蛋白
His标签重组蛋白的上样量为20ml，用分别含20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲
液B进行洗脱，色谱结果见图1，色谱各组分的SDS-PAGE结果见图2。
图1. Ni-NTA Agarose纯化带His标签重组蛋白色谱图
图2. SDS-PAGE 图谱
1、标准蛋白，
2、上样液，
3、流穿液， 4：20mM洗脱液， 5：50mM洗脱液，
6：100mM洗脱液， 7：200mM洗脱液， 8：300mM洗脱液， 9：400mM洗脱液。（2）使用Ni-NTA Agarose纯化His标签重组蛋白包涵体
条件和前面的方法基本相同，只是缓冲液中加了8M的脲，溶液配方如下表，其纯化色谱图和电泳图分见图3、图4。
要注意的是不同的包涵体溶解度不同，也可以用6M盐酸胍代替8M脲，因为盐酸胍溶解包涵体更完全。
缓冲液组成：
缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH
2PO
4
19ml，0.5M Na
2
HPO
4
81ml，NaCl 29.3g
和脲480 g，加热溶解后定容到1000ml。
缓冲液2：50mMpH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH
2PO
4
19ml，0.5M Na
2
HPO
4
81ml，
NaCl 29.3g，咪唑34g和脲480 g，加热溶解后定容到1000ml。缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液B配制：
咪唑浓度缓冲液1量(ml) 缓冲液2量(ml)
50 mM 90 10
400 mM 20 80
图3. Ni-NTA Agarose纯化His标签重组蛋白包涵体色谱图
图4.SDS-PAGE图
1：包涵体，2：流穿液，3：50mM咪唑洗脱液，4：400mM咪唑洗脱液。
（3）不同金属离子及洗脱条件对纯化效果的影响
使用Ni-NTA Agarose，His标签重组蛋白的上样量为10ml，用含有20、50、100、200、500mM 咪唑的缓冲液3洗脱，缓冲液1和2均加入终浓度为1%的吐温80，其结果表明加入表面活性剂可以降低杂吸附。此外分别螯合铜钴金属离子做同样的纯化实验，结果表明在回收率和纯度上都以螯合镍离子的效果最好，其分离纯化的纯度可以＞90%，而目标蛋白的回收率高达80%，所以建议首选镍离子螯合填料，别的可以不用考虑。
五、应用注意事项：
镍离子金属螯合亲和层析介质最经典的配体是IDA。镍离子有六个螯合价数，Ni-IDA螯合了三价，剩余三价；而Ni-NTA螯合四价，剩余两价，因此Ni-IDA琼脂糖凝胶作用力要比Ni-NTA 琼脂糖凝胶的强。也正因为这个原因，在同样条件下Ni-IDA洗杂质和目标蛋白的要比Ni-NTA 的咪唑浓度高，但是NTA的填料更稳定，耐受更强的还原剂，更不容易脱落；而IDA的载量要比NTA高，可以反复利用，更加经济。具体用哪个填料完全看个人的习惯以及纯化的条件而决
定。
六、有关操作说明
1、色谱柱装填
（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。
（2）在柱下端加入蒸馏水，以除去柱中空气，关闭柱出口，在柱内保留少量蒸馏水。
（3）将介质连续倒入柱子时，要用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让介质自然沉降。
（4）柱压不超过0.3MPa，如果装柱系统中无法测柱压，则控制流速高于300cm/h，但是在使用中一般只用最大流速的75%。
2、固定金属离子
（1）金属离子的固定必须用过滤好的金属离子溶液，以防止金属盐在介质上沉淀。
（2）用2-5倍柱床体积的蒸馏水充分平衡柱子。
（3）选择合适的金属离子（Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+等），溶解在中性或弱酸性的溶液中，浓度为0.1~0.3M。如果是Fe3+必须在低pH下螯合（pH 3），以防止Fe3+产生沉淀。
（4）用2-5个柱床体积的金属离子溶液上柱，再用不少于5倍柱床体积的蒸馏水洗涤色谱柱，洗去未螯合的金属离子。（当然也可以把洗净没有螯合的填料直接和需要的金属离子溶液在摇床上震荡过夜，这样螯合效果更好，Ni-NTA Agarose尤其适合用这样的方法。）
（5）用2-5倍柱床体积的起始缓冲溶液平衡柱子，再上样。
（6）如果是螯合铁离子，要注意的是在中性条件下，Fe3+很容易被还原而生成沉淀，所以Fe3+溶液的pH最好是3-5。螯合Fe3+的色谱柱不能长时间保存在中性溶液中。建议每次用完后都要将螯合的Fe3+用50 mMEDTA溶液洗净，下次使用时再重新螯合。如果洗不干净，也可以将介质浸在50mM的EDTA中过夜后再清洗保存。
3、上样
（1）样品通溶解在pH5.5~8.5的缓冲液中，提高上样缓冲液的pH值，可以增大载量。
（2）选择起始缓冲液，主要是依据金属离子的特性及样品与金属离子的结合特性。
（3）缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，也最好不含巯基乙醇等还原剂。
（4）常用缓冲液有10~20m M磷酸钠盐缓冲液和50mM醋酸钠缓冲液
（5）在缓冲液中要加入0.15~0.5M的NaCl，以消除离子交换作用。
（6）使用金属螯合层析有一个通常的法则，如果不了解蛋白的结合特性，建议先选用Zn2+，缓冲液可以选择中性的磷酸盐或者醋酸盐缓冲液，NaCl的含量为0.15-0.5M，作为起始缓冲液。
（7）缓冲液中的去污剂一般不会影响对蛋白的吸附作用。
（8）蛋白被吸附时，经常会有一部分的螯合金属离子被替换，这种现象通常是可见的，尤其是使用有色的金属离子时，比如Cu2+，所以使用几次后可以先把金属离子洗下来，然后再重新螯合金属离子。
4、洗脱
（1）线性降低或一步降低pH，大多数蛋白在pH6~4会被洗脱下来，也可以在pH3~4，缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸、磷酸盐缓冲体系。
（2）竞争性洗脱：线性增加或一步增加与金属离子有亲和力的物质，如0~0.5M咪唑，0~50 mM 组氨酸，0~2M NH
4
Cl。梯度洗脱最好在起始缓冲液的恒定pH下进行。
（3）EDTA、EGTA等螯合剂会与金属离子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来，这种方法不能使不同的蛋白分离，此外会影响蛋白吸附，导致融合蛋白不能挂柱。
（4）所有上述情况中，缓冲液中必须加入0.15~0.5M的NaCl 以消除离子交换作用。
（5）当螯合离子配基是Cu2+时，有以下的三种操作方式：
降低pH：
上样缓冲液：50 mM Na
2HPO
4
， 0.5M NaCl， pH 7.4
洗脱缓冲液：50 mM Na
2HPO
4
， 0.5M NaCl， pH 3.5
竞争洗脱：
上样缓冲液：50 mM Na
2HPO
4
， 1M NaCl， pH 7.4
洗脱缓冲液：50 mM Na
2HPO
4
， 1M NH
4
Cl， pH 7.4
脱落洗脱：
上样缓冲液：50 mM Na
2HPO
4
， 0.5M NaCl， pH 7.4
洗脱缓冲液：50 mM Na
2HPO
4
， 0.5M NaCl， 50 mM EDTA， pH 7.4
使用降低pH和脱落洗脱都会使金属离子掉下来，下次使用就得重新螯合金属离子。
七、再生、清洗、保存
1、凝胶的再生
（1）螯合一种新的金属离子之前，必须将胶再生。用5~10倍体积的50mM EDTA淋洗柱子，再用2~3倍体积的0.5M NaCl洗掉残留的EDTA。
（2）金属离子的重新固定的方法如前文所述。在一些操作中，变性蛋白和脂质不能在柱子的再生过程中被洗脱下来，他们可以通过在位清洗被除去。
2、在位清洗
（1）除去因离子交换作用吸附的蛋白，用2~3倍柱床体积2M NaCl溶液淋洗柱子，再反向淋洗。（2）除去蛋白沉淀、疏水性蛋白，用1M NaOH以100cm/h的速度淋洗柱子1h。
（3）所有操作中，都要用至少3倍柱床体积的初始缓冲液洗柱子。
（4）除去强的疏水性蛋白和脂质等，用4倍柱床体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇洗柱子，再反向淋洗。
八、保存
在20%乙醇中，4℃下长期保存。
金属螯合层析介质
金属螯合层析介质（征求意见稿） 编制说明 《金属螯合层析介质》 国家标准起草工作小组 二〇一九年一月
《金属螯合层析介质》国家标准 编制说明 （征求意见稿） 一、任务来源 本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会专项《国家质量基础的共性技术研究与应用》项目《生物产业共性技术标准研究》中课题《海洋生物产品质量控制与检测技术标准研究》，项目编号“2016YFF0202304”。本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2019年完成。本标准起草工作组由中国科学院过程工程研究所等单位共同组成。 二、目的和意义 金属螯合层析是近40年来出现的一种亲和层析技术，也称固定化金属离子亲和层析。它于1975年首先被Porath和他的合作者们成功用于分离纯化人血清蛋白，并在此后的三十年里迅速发展。该法利用蛋白质表面的某些氨基酸和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而实现蛋白质分离。高流速琼脂糖金属螯合层析介质是将亚氨基二乙酸（IDA）、次氮基三乙酸（NTA）等配基键合在高流速琼脂糖微球上，并螯合金属离子Ni2+（或其它金属离子）而形成的一种亲和层析介质[1]（图1）。该类层析介质具有吸附容量大、选择性好、分辨率高、易于再生以及成本较低等优点，在标签蛋白等生物大分子纯化领域具有极为广泛的应用。 图1 金属螯合层析介质（IDA）结构示意图（X可以是H2O、缓冲液中离子以及蛋白配体等） 目前国内外已有多家企业进行金属螯合层析介质的生产，由于缺乏相应的国家标准，金属螯合层析介质的性能要求没有统一标准，从而对其应用造成很大困
扰，严重阻碍该类介质和层析技术的应用发展水平，对我国生物产业产生不利影响。以金属螯合层析介质的载量测定方法为例，一种方法是将介质装柱并连在层析仪上，平衡后经含有His-乳酸脱氢酶的样品上样，上样结束后，依次经淋洗和洗脱，收集洗脱液，根据洗脱液中蛋白含量计算洗脱载量；另一种方法是用纯His-乳酸脱氢酶上样，依次经平衡和洗脱，收集洗脱液，根据洗脱液蛋白含量计算洗脱载量。这两种方法测定同一介质样品得到的结果具有明显差异。类似问题也出现在其他的参数测定上。因此建立关于金属螯合层析介质的国家标准具有重要意义。在此基础上，通过标准化工作提高介质及相关技术发展水平，促使我国相关产业在国际贸易方面取得话语权，推动我国层析介质及相关产业在国际上占有一席之地。 三、标准制定原则 （一）标准编制原则 金属螯合介质属于生物体系分离材料，重点围绕介质的主要性能要求，设定相应技术内容。在确保产品质量的基础上，充分体现产品的特点。 （二）标准制订主要依据 1、标准编写遵循GB1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的有关要求。 2、标准编写内容参考我国与化学品相关的法规、标准，包括GB/T 601 化学试剂标准滴定溶液的制备、GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备等等。 四、标准主要技术内容 （一）标准适用范围的说明 本标准规定了金属螯合层析介质的质量要求、检测方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存的标准。 本标准适用于骨架为琼脂糖微球的金属螯合层析介质的生产与检测。 （二）内容提要 金属螯合层析介质的主要理化性质包括外观、粒径、流速、配基密度、动态载量、微生物污染和化学稳定性等。
酶工程复习材料 简述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析.
酶工程复习材料 1.简述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析的原理和操作要点？ 离子交换层析原理：根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。 操作:a上样：上样体积不十分严格。b洗脱:增加溶液的离子强度c梯度洗脱法:改变溶液的pH d再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl 处理。 凝胶层析原理：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。大分子 物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最 先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出 层析柱。 操作：a凝胶的选择和处理,根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。 将干胶悬浮于5-10倍的蒸馏水中，充分溶胀，抽气，装柱。b柱的 选择:采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。c加样: 体积不能过多，不超过凝胶床体积的5％，脱盐时可在10％左右。d 洗脱:洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。e 胶的保存:洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。亲和层析原理:利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子.体通过适当的化学反 应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。 2.酶的分类： 根据酶的化学组成可将酶分为：1.单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分；2.结合蛋白酶类（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子） 全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子 根据酶蛋白结构特点可将酶分为 单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。 寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。 多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。 3.酶合成调节的类型 诱导: 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。 阻遏:分解代谢物阻遏和反馈阻遏
镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)说明
镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书 一、简介 金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。 二、性能参数： 特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便 基质6%的交联琼脂糖凝胶 配体 Ni2+ 配体密度20-40μmol /ml 吸附载量15mg蛋白/ml 介质颗粒大小45-165μm 最大流速600cm/h pH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11 保存温度+4-8℃ 保存液体20%乙醇 三、适用范围 分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。四、应用实例 实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白 实验步骤： 1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml； 2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min； 3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为 1ml/min；
实验十一 金属螯合亲和层析分离蛋白质
实验十一金属螯合亲和层析分离蛋白质 【实验目的】 1．学习亲和层析的原理。 2．掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。 【实验原理】 亲和层析是以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这样的方法称为金属螯合亲和层析。蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质，在碱性pH时，使吸附更有效，但选择性降低。金属螯合亲和层析行为在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 本实验室纯化的目的蛋白是用IPTG诱导表达的pGFPuv,该蛋白是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标记物，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。 【试剂与器材】 〈一〉试剂 1. 0.05mol/L EDTA—0.5mol/L ，NaCL溶液100mL 2. 2mol/L NaCL 溶液50mL 3. 1mol/L NaOH溶液50mL 4. 0.2mol/L NiSO4溶液50mL 5. 平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，pH7.0 500mL 6. Ni2＋Chelating Sepharose Fast Flow 5－10 mL 7. 重组pGFPuv质粒大肠杆菌工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白样品20—50ml 8. 洗涤液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaC,pH 7.0 9. 洗脱液：300mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL.pH7.0 10 20%乙醇溶液50ml 〈二〉器材 1. 1.5cm X 50cm层析柱 2. 蠕动泵 3. 紫外检测仪 4. 自动收集器 5. 伍豪色谱工作站 【操作方法】 1. 样品的制备 细胞的培养及荧光蛋白表达看实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25 ℃用细胞培养液，8000r/min，离心5min，去上清液，菌体用平衡缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积的平衡缓冲液充分悬浮，冰浴下进行高压破菌处理。然后8000r/min。离心30min，取上清液。放冰箱备用。 2. 亲和层析柱的安装
金属螯合亲和层析技术及其应用
金属螯合亲和层析技术及其应用 摘要:固定化金属螯合亲和层析是一种有效的生物分子分离纯化技术,它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点。因此,其在蛋白质纯化、复性和空间定位以及酶的固定化和金属离子清除等方面具有广泛的应用。 关键词:固定化金属螯合亲和层析;纯化;应用 固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromato-graphy,IMAC)是一种亲和纯化技术,它是由Porath于1975年首次提出并用于吸附牛血清蛋白[1],至今用IMAC已成功分离纯化出数百种生物大分子。该法是基于蛋白质表面的一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力不同而对蛋白质进行分离纯化。它因配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点而被广泛应用。随着研究的进一步深入,IMAC的新应用也不断地被发现。 1金属螯合亲和层析作用原理 固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和力不同对蛋白质进行分离。过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合,金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点,在溶液中被水分子或阴离子占据。当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时,氨基酸残基的供电原子将取代与金属离子结合的水分子或阴离子,与金属离子形成复合物,从而使蛋白质分子结合在固相介质表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基,以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子都能参与螯合反应,由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同,因而与金属配基的亲和力大小不同,从而可选择性地加以分离纯化[2]。 2金属螯合亲和层析技术的应用 2.1金属螯合亲和层析用于生物分离纯化 IMAC在生物分子纯化方面具有很多优点:(1)结合力强,蛋白结合容量大,可用于工业生产,如采用IMAC吸附介质的扩张床吸附(EBA)技术可从哺乳动物细
镍离子金属鳌合亲和层析介质使用说明
镍离子金属鳌合亲和层析介质使用说明 简介 金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 镍NTA亲和层析介质具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。 性能参数 特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便 基质6%的交联琼脂糖凝胶 配体Ni2+ 配体密度10-15μmol/ml 吸附载量20-40mg蛋白/ml 介质颗粒大小45-165μm 最大流速150cm/h pH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11 保存温度+4-8℃ 保存液体20%乙醇 适用范围 分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。 应用实例 实验名称：Ni-亲和介质分离带His标签的重组蛋白
实验步骤： 1、Ni-亲和介质装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml； 2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min； 3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min； 4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min； 5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度； 6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存。 缓冲液组成： 缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH 2 PO 4 19ml，0.5M Na 2 HPO 4 81ml，NaCl 29.3g,加适量水溶解后定容到1000ml。 缓冲液2：50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH 2 PO 4 19ml， 0.5M Na 2 HPO 4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g,加适量，水调pH后定容到1000ml。 缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液B配制： 咪唑浓度缓冲液1量(ml) 缓冲液2量(ml) 10mM 98220mM 96450mM 9010100mM 8020200mM 6040300mM 4060400mM 20 80 SDS-PAGE流程： 1、BCA法测量样品蛋白浓度
金属螯合预装柱5ml说明书-Ni-20120202
金属螯合预装柱（5ml）说明书 1. 简介 金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC）。该法利用蛋白质表面的某些氨基酸（如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等）和金属离子（Cu2+、Zn2+、Ni2+等过渡金属离子）发生特殊的相互作用的原理，从而实现蛋白质的分离。琼脂糖金属螯合介质（Ni-IDA QZT 6FF）是将亚氨基二乙酸（IDA）键合在高流速、高强度的琼脂糖微球上，并螯合金属离子Ni2+而形成的一种亲和层析介质，广泛用于蛋白质、核酸及多肽，尤其是组氨酸标签蛋白质的分离纯化。 2. 产品概述 金属螯合预装柱预装了5 ml的Ni-IDA QZT 6FF亲和介质，可直接用于组氨酸标签蛋白质等生物分子的分离纯化，具有使用方便、操作简单、分离纯化效率高的特点。 Ni-IDA QZT 6FF亲和介质具有良好的稳定性、生物相容性和溶剂相容性，这不仅有利于保持产品的生物活性和提高产品的收率，还有利于扩大层析操作条件的选择范围。Ni-IDA QZT 6FF亲和介质的理化性质和溶剂相容性分别如表1和表2所示。 表1. Ni-IDA QZT 6FF预装柱的理化性质及特征参数 参数指标 基质6%交联琼脂糖凝胶 配基-N(CH2COOH)2 (IDA) 形状球形 平均粒径90 μm (45~165) 金属离子密度~40 μmol Zn2+/ml wet gel 动态载量a~25-30 mg蛋白(LDH)/ml wet gel 柱体积1ml或5ml 柱尺寸（内径x高度）0.9*1.57 cm (1ml柱子) 0.9*1.57 cm (5ml柱子) 推荐流速b1ml/min (1ml柱子)或5ml/min (5ml柱子) 地址：北京市海淀区中关村北二条1号中国科学院过程工程研究所
固化金属离子亲和层析富集磷酸化多肽方法的选择及优化
收稿日期:2009-03-23;修回日期:2009-04-27 作者简介:李耀军,男,博士生,研究方向蛋白质组学,E 2mail:yaojunxh@1631com; 通讯作者:郑德先,男,教授,博士,研究方向分子生物学与生物化学,E -mail:zhengdx@pumc 1edu 1cn 。 基金项目:国家自然科学基金(No 130623009、30721063);国家重点基础研究项目特别基金(No 12007CB507404)资助项目 doi ∶1013969/j 1issn 11008-9632120101011001 固化金属离子亲和层析富集磷酸化 多肽方法的选择及优化 李耀军1 ,罗元明2 ,武淑珍1 ,高友鹤1 ,刘彦信1 ,郑德先 1 (11中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院,北京100005; 21中国科学院微生物研究所,北京100101) 摘 要:在磷酸化蛋白质组学研究中,根据是否需要对待富集样品进行甲酯化处理,可将固化金属离子亲和层析(I M AC )方法分为两类,即需要甲酯化处理的I M AC 方法(ME 2I M AC )和不需要甲酯化处理的I M AC 方法(Non 2M E 2 I M AC )。要实现对磷酸化多肽的有效富集和鉴定,就必须对富集方法进行选择和优化。利用基质辅助激光解析离子化串联飞行时间质谱(MALD I 2T OF 2MS )对两种方法富集的磷酸化多肽进行了比较研究。结果表明,M E 2I M AC 方法容易发生样品丢失,质谱结果的分析也比较复杂,而Non 2ME 2I M AC 方法则不仅操作简单而且富集效果理想。另外,优化了Non 2M E 2I M AC 方法的实验条件,指出最佳的结合溶液是8%ACN /013%TF A,最佳的洗脱溶液是011mol/L E DT A (pH 值810),从而建立了一套完整而简单有效的磷酸化多肽富集方法。关键词:磷酸化多肽;甲酯化反应;固化的金属离子亲和层析;质谱中图分类号:Q331 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2010)01-0001-04 M ethod for selecti on and opti m i zati on of phosphopepti de enr i ch ment by i m mobili zed 2met al i on affi n ity chro matography L I Yao 2jun 1 ,LUO Yuan 2m ing 2 ,WU Shu 2zhen 1 , G AO You 2he 1,L I U Yan 2xin 1,ZHENG De 2xian 1 (1.Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College,Beijing 100005; 2.I nstitute of M icr obi ol ogy,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China ) Abstract:I n phos phop r oteom ics,according t o whether the sa mp le treated with methyl esterificati on (ME )necessarily or not,i m mobi 2lized 2metal i on affinity chr omat ography (I M AC )can be divided int o t w o kinds,M E 2I M AC and Non 2M E 2I M AC 1I n order t o find out bet 2ter one of the m,they were compared byMALD I 2T OF 2MS 1The results firstly showed thatME 2I M AC method could cause ads or p tive l os 2ses easily and comp licate the MS analysis and data inter p retati on;in contrast,Non 2ME 2I M AC method was a si m p ler and more efficient strategy f or phos phopep tide enrich ment 1I n additi on,the op ti m izati on of experi m ental conditi ons of Non 2M E 2I M AC showed that the best binding buffer was 8%ACN /013%TF A and the best eluting buffer was 011mol/L E DT A (pH 810)1The Non 2M E 2I M AC method re 2ported here is a good reference t o more and more researchers in phos phop r oteom ics 1 Keywords:phos phopep tide;methyl esterificati on;i m mobilized 2metal 2i on affinity chr omat ography;mass s pectr ometry 固化金属离子亲和层析(i mmobilized 2metal i on af 2finity chr omatography,I M AC )作为一种快速、简单易用和经济的纯化技术,近年来被研究者广泛应用于磷酸化多肽的富集[1-4] 。该方法的关键就是要降低带酸性氨基酸(谷氨酸和天门冬氨酸)的非磷酸化多肽在 I M AC 柱上的非特异性吸附[4]。Ficarr o 等[1] 通过对提 1
镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用2
镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用 摘要：蛋白质纯化是进行基因工程中最重要的环节，选取纯化蛋白的工具对纯化结果影响巨大。镍离子亲和层析柱具有特异性高、纯度高、成本低、产量大等优点，镍离子亲和层析柱的国产化将极大促进蛋白质纯化产业的发展并会产生巨大的市场效益。 关键词：镍离子亲和层析柱、蛋白质纯化、国产化 亲和层析（Affinity chromatography，AC）是利用生物大分子和固定相表面的亲和配基之间可逆的特异性相互作用，进行选择性分离的一种液相层析分离方法。常用的亲和层析方式为金属螯合亲和层析,又称固定化金属离子亲和层析( Immobilized metal lchelated affinity chromatography, IMAC)，利用金属离子(Ni2+，Cu2+等)与氨基酸表面的残基(如组氨酸的咪唑基)的配位鳌合作用，来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。由于IMAC 具有螯合介质制备简单方便，吸附容量大，选择性及通用性较好，易于再生，成本低等优点, 逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。镍离子亲和层析柱成为金属螯合亲和层析的代表产品。目前，国外有3-4家镍离子亲和层析柱产品在国内销售，但价格昂贵，国内已有数家公司开展了镍离子亲和层析柱产品的销售，其中，广州精达公司采用最新的镍离子亲和层析柱的制备技术，顺利完成了该种产品的国产化。 I、镍离子亲和层析柱的制备工艺 1、Ni2+吸附融合蛋白原理 Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有His（组蛋白）标签的碱性蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸（碱性氨基酸）。同时Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，利用咪唑梯度洗脱，从而获得纯度较高的融合蛋白。而利用基因工程技术制备的融合蛋白常携带6个组氨酸的标签，因6个组氨酸标签因肽片段小，故对目标蛋白质的生物活性影响较小，因此被广泛用于重组蛋白的制备及纯化。 2、固相载体的选择 常见的固相载体包括为普通琼脂糖颗粒及GE公司生产的Sepharose琼脂糖系列产品。普通的琼脂糖颗粒具有造价低，但结合蛋白不稳定，易造成镍离子脱落的重大缺点。而GE公司生产的Sepharose琼脂糖系列产品采用交联琼脂糖，具有高吸附力、高化学物理稳定性、快流速、强抗压力等特点，因此十分适合作为亲和层析柱中的固相载
离子交换层析说明书
离子交换层析说明书 CM Bestarose Fast Flow DEAE Bestarose Fast Flow Q Bestarose Fast Flow SP Bestarose Fast Flow CM, DEAE, Q and SP Bestarose 快速离子交换剂属于分离介质的一部分,主要为色谱工作服务，所有的介质都经过严格的控制生产从而保证其能够满足工业生产的需求。 为了正确操作以便得到最好的分离效果，请在使用前阅读该手册。
目录 1. Bestarose 快速离子交换剂的特性 3 2. 装柱指南12 3. 装柱评价14 4. 保养17 5. 疑难解答17-19
1.Bestarose Fast Flow离子交换剂的特性 Bestarose Fast Flow离子交换剂是以高度交联的琼脂糖为基质，它的化学、物理性质稳定，即离子载量、洗脱情况、反压及流量等特性不受层析和清洗过程中溶液的影响，详见下表。高物理稳定性使它能在低背压下提供快速液流，在柱高15cm，1 bar压力下，它的流速可达300-700cm/h，见图1。另外，刚性介质体积基本不因pH和离子强度的变化而变化。 线性 流速 图1. Bestarose 快速离子交换剂典型的压力/流速曲线。
CM Bestarose Fast Flow离子交换剂的特性 CM Bestarose Fast Flow是一种弱阳离子交换剂，离子交换基团是羧甲基，如下：-O-CH2COO- 表一. CM Bestarose Fast Flow 特性。 项目指标 离子交换剂类型弱阳离子 总离子载量0.09-0.13mmol/ml 排阻限4×106（球形蛋白） 骨架6%交联琼脂糖 颗粒类型球形，45-165μm 流速300–600 cm/h* 工作温度4–40°C 工作pH 见图2 pH稳定性2-14(短期，CIP) 4-13（长期） 化学稳定性适合所有的缓冲体系 1M NaOH 8M Urea 6M GuHCl 70%乙醇 避免事项氧化剂 长期暴露（1星期，20°C） pH<4 *15cm柱高，1 bar压强，25℃，XK 50/30 柱。
离子交换层析
离子交换层析（色谱） 一、原理 离子交换层析(Ion exchange chromatography, IEC)是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的层析法。 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示： I — 流动相的离子强度，A 和B 为常数， 为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。 离子交换基： 阴离子：DEAE （二乙胺乙基）； QAE （季胺乙基） 阳离子：CM （羧甲基）；SP （磺丙基） 对于蛋白质等两性电解质，在物理意义上，B 为溶质的静电荷数与离子价数之比。在pH 偏离等电点的溶液中，蛋白质溶质的静电数常为两位数以上，故B 值较大，即蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感。在同一离子强度下，不同蛋白质的分配系数相差非常大（几个数量级）。 洗脱方式： 恒定洗脱法：洗脱液（流动相）的离子强度不变； 缺点：对于在吸附柱上分配系数相差较大的蛋白质很难实现很好的分离。 线性梯度洗脱法或阶段梯度洗脱法： 除GFC 以外的层析操作均采用此种方法。 在洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大或阶段梯度增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大，使恒定洗脱条件下难于脱附的溶质得到洗脱。 线性梯度洗脱和阶段梯度洗脱法的优缺点如下： （1）线性梯度洗脱法： 优点：流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的调配浓度梯度的设备。 （2）阶段梯度洗脱法： 优点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗 脱，不需要特殊梯度设备，操作简单； 缺点：因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰。 此外，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此洗脱操作参数（如盐浓度体积）的设计较困难。 离子交换(IEC)的应用及特点 GFC — 主要用于产物的初步纯化和中后期脱盐 IEC — 是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化手段 IEC 分离的特点： （1）料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作； （2）应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长较短； （3）产品回收率高； （4）商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低于亲合吸附剂。 疏水作用层析（色谱） 一、原理 疏水作用层析(Hydrophobic interaction chromatography, HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团的疏水吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。 二、疏水性吸附剂：将下表所列的各种凝胶过滤介质偶联上疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。 常用的疏水性配基：苯基、短链烷基（C 3~C 8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 吸附特点： 疏水性吸附作用的大小与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修∞+=m I A I m B )(∞m
亲和层析
亲和层析 亲和层析原理 生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。 被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。 亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。 亲和层析的应用 点击次数：692 发表于：2008-08-28 21:05转载请注明来自丁香园 来源：互联网 亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。 1.抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低,用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离,而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原,经动物免疫后制备抗体,将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂,就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强,其解离常数为10 8-10? 12M,所以洗脱时是比较困难的,通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力,以便于洗脱。 另外金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能够与免疫球蛋白G(Ig G)结合,可以用于分离各种Ig G。 2.生物素和亲和素 生物素(biotion)和亲和素(avidin)之间具有很强而特异的亲和力,可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强,其解离常数为10 15M,洗脱通常需要强类的变性条件,可以选择biotion的类似物,如