如何运用实时荧光定量PCR技术进行动物源性成分检测共25页文档
实时荧光PCR法检测食品中鸭肉成分说明书
实时荧光PCR 法检测食品中鸭肉成分程 欣，何玮玲，黄 明*(南京农业大学食品科技学院，食品安全与营养协同创新中心，江苏 南京210095)摘 要：以鸭肉细胞核中基因序列(IL-2)为目标序列，设计特异性引物和Taq Man 探针，设计并构建扩增内标，针对内标设计Taq Man 探针，通过对聚合酶链式反应(PCR)反应体系和反应条件的优化，建立用于检测食品中鸭肉成分的添加有扩增内标的的荧光PCR 方法。
通过扩增曲线和Ct 值分析该方法的特异性、检测限和灵敏度。
结果表明：Taq Man 探针实时荧光PCR 法具有很高的特异性，所建立的方法能够检测出0.5ng 的鸭组分DNA ，灵敏度可达0.1%。
应用该方法对市售38份样本进行抽样检测，结果令人满意。
关键词：细胞核基因；扩增内标；实时荧光聚合酶链式反应；鸭肉Establishment and Application of Fluorescent Real-Time PCR for the Detection of Duck Meat in FoodsCHENG Xin ，HE Wei-ling ，HUANG Ming *(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)Abstract ：Fluorescent real-time PCR system for the assay of duck meat in foods was established on the basis of a pair of primers and the Taq Man probe speci fic for duck was designed according to the sequence of duck nuclear gene (IL-2). We also designed and established an internal ampli fication control (IAC) and Taq Man probe for IAC. Results showed that the speci ficity of Taq Man real-time PCR was reliable and it could detect the presence of duck meat even when the concentration of DNA was reduced to 0.5 ng. The sensitivity of this method was 0.1%. Its accuracy was veri fied with 38 food samples from the market.Key words ：nuclear DNA ；internal ampli fication control ；fluorescent real-time polymerase chain reaction ；duck meat 中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)24-0092-05doi:10.7506/spkx1002-6630-201324019收稿日期：2013-03-04基金项目：国家“863”计划项目(2011AA100805-1)；农业部公益性行业(农业)科研专项(201303083-2)；国家农业科技成果转化资金项目(2012GB2C100151)作者简介：程欣(1990—)，女，硕士研究生，研究方向为肉品质量与安全控制。
基于实时荧光PCR方法的牦牛肉源性成分鉴别
基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第10期，第4426-443丨页研究报告Research Report基于实时荧光P C R方法的牦牛肉源性成分鉴别郭华麟1明玥1李轲2时淄航1尤祯丹u蒋玉涵陈传君徐超2韩国全y1四川农业大学食品学院，雅安,625014; 2郑州海关检验检疫技术中心，郑州,450003; 3四川农业大学食品加工与安全研究所，雅安，625014* 通信作者，*********************.cn摘要为了建立牦牛肉源性检测的实时荧光PCR方法,本研宄基于比较牦牛与黄牛、鸡、猪、羊、鸭等动物 的C y A基因序列差异，设计其特异性引物。
特异性实验结果表明，猪肉、鸡肉和黄牛肉的DNA均不与引物发 生交叉反应；灵敏度实验表明方法的最低检出限可达0.004 ng/jxL;抗干扰实验结果表明，当牦牛肉的添加量 为1%时仍可检出；对市场上的20份不同种肉样进行检测，除牦牛肉样品检测结果呈现阳性外，其余肉样均 为阴性。
本实验所建立的实时荧光PCR方法为牦牛源性成分鉴别提供一种快速、准确、专属性强的检测方法。
关键词实时荧光PCR,牦牛肉，鉴别Identification of Yak Beef Origin Components Based on Real-time PCRGuo Hualin 1Ming Yue 1Li Ke2Shi Zihang1You Zhendan 1,3Jiang Yuhan u Chen Chuanjun u Xu Chao2Han Guoquan1Food Science College of Sichuan Agricultural University, Ya'an, 625014; 2 Zhengzhou Customs of the People's Republic of China, Zhengzhou, 450003; 3 Institute of Food Processing and Safety of Sichuan Agricultural University, Ya'an, 625014*Correspondingauthor,*********************.cnDOI: 10.13417/j.gab.039.004426Abstract In order to establish a real-time PCR method for detection of yak beef origin,the specific primers are designed based on comparing the sequence differences of Cytb gene between yak cattle,chickens,pigs,sheep,and duck.Specificity test shows that the DNA of pork,chicken and yellow beef do not have a cross react with the primers;sensitivity test shows that the minimum detection limit of the method is 0.004 ng/jxL;anti-interference experiment shows that it can still be detected when the addition of yak is 1%. 20 different meat samples on the market are tested.Except yak meat samples show positive results,other meat samples are negative.The real-time PCR method established in this experiment provides a rapid,accurate and specific detection method for identification of y ak derived components.Keywords Real-time PCR,Yak,Identification牦牛肉的蛋白质含量丰富，营养成分优于其他 种类的牛肉，作为一种优质肉类而广受消费者喜爱 (邱翔等，2010; Doosti et al.，2014; Iwobi et al.,2015)。
实时荧光PCR在虹鳟源性成分鉴别中的应用
650201,Yunnan, China) Abstract: To identify rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss ) —derived components in food, the ATP6 mitochon drial gene was selected as the target to design rainbow trout—specific primers and probes for polymerase chain reaction (PCR). Real-time fluorescent PCR enabled the rapid identification of rainbow trout-derived compo nents・ The assay was used for 17 common commercially available fish species. No amplification reaction was ob served. The DNA concentration sensitivity was 0.1 ng/|xL and was accompanied by good specificity. The assay was also used to test 22 commercial salmon and their products. Ten of these commodities contain rainbow trout ingredients. The developed detection method can be applied to identify rainbow trout components in commercial products. Rainbow trout was one of the main species of some commercially available salmon. Key words: rainbow trout (Oncorhynchus mykiss ); real-time fluorescence polymerase chain reaction; authen ticity identification; specificity; sensitivity
实时荧光定量PCR检测肉制品中牛源性成分及其含量
实时荧光定量PCR检测肉制品中牛源性成分及其含量作者：谭波杨春萍刘小玲来源：《福建农业科技》2023年第10期摘要：建立一種快速、高效、准确且低成本的肉制品中牛源性成分鉴定及量化检测方法。
以细胞核单拷贝基因bosPDE为目的基因，LcoR为内参基因分别合成引物及探针，优化反应条件，评价该方法的特异性和灵敏度。
采用实时荧光PCR相对定量法，以△Ct值与2△△Ct值线性模型分别建立回归曲线，通过人工模拟混合牛肉样品对方法准确性评估。
结果表明：目的基因bosPDE引物仅对牛肉DNA进行扩增，具有特异性，对牛肉DNA扩增的灵敏度可达0.01 ng·μL-1。
以△Ct值与2△△Ct值为定量指标的回归曲线分别为y=-3.096 5x+8.479 7（R2= 0.998）、y=0.712 2x+3.050 4（R2=0.988 7）。
两个方法检测35%～90%牛肉含量的人工模拟混合牛肉样品的回收率为分别为94.30%～102.52%、98.55%～106.30%。
将两种定量方法进行数均处理，回收率的偏差减少。
本研究建立的实时荧光定量PCR方法能够准确对肉制品中的牛源性成分进行定性，并可用于牛肉掺伪制品中的牛肉相对定量分析，对鉴别肉制品掺假以及量化牛肉制品成分含量具有重要参考价值。
关键词：肉制品；牛源性成分；实时荧光定量PCR；相对定量中图分类号：TS 251.5 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2023）10-0006-09DOI： 10.13651/ki.fjnykj.2023.10.002Detection of the Bovine-derived Materials and Their Contents inMeat Products by Real-time Fluorescence Quantitative PCRTAN Bo1，2， YANG Chun-ping3， LIU Xiao-ling1*（1. College of Light Industry and Food Engineering， Guangxi University， Nanning，Guangxi 530004， China;2. Guizhou Research and Application Center of Detection Technology， Guiyang， Guizhou 550014， China;3. Guizhou Institute of Analysis and Testing， Guiyang， Guizhou 550014， China）Abstract： In order to establish a rapid， efficient， accurate and low-cost method for the identification and quantitative detection of the bovine-derived materials in meat products， the primers and probes were synthesized with the single-copy gene of cell nucleus， bosPDE as the target gene and LcoR as the internal reference gene， to optimize the reaction conditions and evaluate the specificity and sensitivity of the method. By using the relative quantitative method of real-time fluorescence PCR， the regression curves were respectively established with the linear model of △Ct value and 2△△Ct value， and the accuracy of the method was evaluated by simulating artificially the mixed beef samples. The results showed that： the bosPDE primer of the target gene only amplified the DNA of beef， which was specific， and the sensitivity of amplification to beef DNA could reach 0.01 ng·μL-1. The regression curves with △Ct value and 2△△Ct value as the quantitative indexes were y=-3.096 5x+8.479 7 （R2=0.998） and y=0.712 2x+3.050 4 （R2=0.988 7）， respectively. The recovery rates of the artificial simulated mixed beef samples with 35%-90% beef content detected by the two methods were 94.30%-102.52% and 98.55%-106.30%， respectively. The deviation of recovery rate was reduced when the number-average treatment was carried out on the two quantitative methods. The real-time fluorescence quantitative PCR method established in this study could accurately characterize the bovine-derived materials in meat products， and could be used for the relative quantitative analysis of beef in the beef adulterated products. It had important reference value for identifying the adulteration of meat products and quantifying the concentrations of components in beef products.Key words： Meat products； Bovine-derived materials； Real-time fluorescence quantitative PCR； Relatively quantitative近年来，随着全球化经济的高速发展，人们的物质需求逐渐提升，各种肉类食品的流通和交易也越来越频繁，这使得一些不法商家为了牟取暴利，以低价肉替代高价肉，导致肉制品掺假事件频繁发生［1-3］。
黄牛和猪源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法 编制说明
编制说明项目名称：黄牛和猪源性成分同步检测方法实时荧光PCR法项目编号：内质监标函〔2018〕307号编制单位：锡林郭勒职业学院一、工作简况本项目来源于2018年第3批内蒙古自治区地方标准制修订项目（内质监标函〔2018〕307号）。
起草单位为锡林郭勒职业学院，协作单位为锡林郭勒食品检验检测和风险评估中心。
主要起草人：郭梁、雅梅、海小、钱俊平、刘国强、罗建兴。
二、制定标准的必要性和意义牛肉和猪肉深受消费者的喜爱，是农畜产品市场中重要组成部分。
市场中存在用低价肉冒充牛肉等高价肉的欺诈违法行为，而且牛肉和猪肉涉及民族文化和宗教信仰，亟需制定针对肉乳制品的黄牛和猪源性成分同步检测方法。
目前，已经存在八项黄牛和猪源性检测方法标准：饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法（GB/T 20190-2006）；明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法（GB/T 25165-2010）；动物源性饲料中反刍动物源性成分(牛,羊,鹿)定性检测方法PCR方法（GB/T 21104-2007）；饲料中牛羊源性成分检测实时荧光聚合酶链反应法（NY/T 1946-2010）；食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法（SN/T 2051-2008）；动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法（SN/T 2980-2011）；动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法（GB/T 21101-2007）；食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第8部分：猪成分检测实时荧光PCR法（SN/T 3730.8-2013）。
在采用上述检测标准后发现：目前缺乏基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的黄牛和猪源性成分同步检测方法的相关标准。
本标准是基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的黄牛和猪源性成分同步检测方法的相关标准，具有快速、高通量以及去除假阴性等特征。
实时荧光PCR检测食品肉类种源的方法探讨
分析与检测1 PCR检测技术概述1.1 PCR技术简介PCR技术始于1985年，其用于特定的DNA片段的快速检测，与传统的检测方法相比，能够对特定的成分进行快速检测，并能够快速检测出目标物质中的不同成分，因此，该技术在目前的食品成分检测和致病菌检测等多方面均得到了越来越广泛的 应用[1]。
1.2 PCR技术的优势传统的成分检测环节往往需要大量的人力物力，且操作的复杂程度高，由于各种成分的生物特性和化学性质都有着一定的区别，对各个成分进行分别鉴定时，经常需要多次调整环境的pH、温度等参数，任何一个环节的失误都可能导致前功尽弃，而PCR技术的应用，有效解决了上述问题[2]。
具体来看，PCR技术主要表现出以下两方面的优点：①便利性好，与传统方法相比，PCR技术只需使用较少的设备和常规的操作步骤即可实现检测，整个过程更加便捷；②速度快，可以短期进行大量的检测[3-4]。
2 食品中肉类种源的实时荧光PCR检测2.1 实验材料2.1.1 实验试剂实验试剂包括琼脂糖、GelRed染色剂、50 bp DNA Ladder、无水乙醇、DNA提取试剂盒、DreamTaq PCR Master Mix，以及市售的牛肉卷样品和牛肉。
2.1.2 实验仪器实验仪器包括高速冷冻离心机、恒温水浴槽、涡旋振荡器、电子天平、生物分光光度计、制冰机和实时荧光PCR仪。
2.2 实验方法2.2.1 样品处理及基因组模板制备首先，采用剪刀和研钵，将所购买的样品剪碎和研磨，以进行匀质处理，其中，牛肉样品需要先在105 ℃下烘干，而后再进行均质处理。
两种样品的均质处理，应当保持一定距离，分开进行，避免交叉污染。
在均质处理步骤完成后，按照DNA试剂盒上的说明进行后续操作，以获取OD260/OD280比值处于1.7～2.0区间内的动物组织DNA。
2.2.2 引物与探针的合成及有效性验证根据Genbank所公布的基因序列，并通过Meglign软件进行对比分析，选取匹配度低和差异大的序列片段，并使用primer express2.0软件，在引物探针设计原则指导下，设计牛源成分的特异性引物和探针。
利用PCR法检测熟牛肉的肉源性
科技文苑May 2020 CHINA FOOD SAFETY 551 引言随着社会的发展，人们的生活水平不断提高，对肉制品的要求也越来越高。
但是，肉制品市场存在肉类掺假、以次充好等欺骗消费者的行为，不法商贩为了追求自身利益以“挂羊头卖狗肉”的方式用劣质肉冒充高质量的肉制品。
利用常规的检测方法只能从感官及形态上鉴别肉类，无法从溯源层面解决肉类掺假的问题，例如对于腌制加工的熟牛肉，消费者就很难通过肉眼辨别其是否为牛肉。
随着分子生物学的发展，以DNA 为基础的PCR 技术被广泛应用于动物源性成分的检测[1-4]，即聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）溯源是以DNA 遗传物质为基础鉴别肉及肉制品。
聚合酶链式反应是一种在体外特异性扩增DNA 序列的技术，其基本过程为3个阶段的多次循环——模板双链DNA 的变性、引物与模板DNA 的退火、在DNA 聚合酶引导下的链延伸反应，且每一次循环后的扩增产物均可作为下一轮循环的模板。
就理论而言，扩增产物量呈指数形式上升，即经过n 个循环后，产物量增加到2n 倍。
此方法在动物源性成分检测、肉类掺假鉴别等应用上已有多个报道[7，8]。
本研究针对菏泽市市场上销售的肉及肉制品进行抽样检测，利用实时荧光PCR 方法鉴别牛、猪、马源性成分，以期发现是否存在掺假的情况，旨在为肉制品掺假检测提供一定的参考依据。
2 材料和方法2.1 材料12份市售熟牛肉。
2.2 仪器绞肉机，小熊电器股份有限公司；金属浴，杭州奥盛仪器有限公司；Rotor Gene Q 荧光定量PCR 仪，德国凯杰。
利用PCR 法检测熟牛肉的肉源性□ 贾南南 李建平 范美霞 菏泽市食品药品检验检测研究院摘 要：本文旨在建立实时荧光PCR 检测熟牛肉中牛、猪、马等动物源性成分的方法。
通过对菏泽市市售熟牛肉进行采样检测，提取熟牛肉中总DNA 后进行实时荧光PCR 检测，确定Ct 值，分析样品熟牛肉中牛、猪、马源性成分。
实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术的研究进展及其在水产养殖中的应用M140101006 高金伟摘要：实时荧光定量PCR的是继常规PCR之后分子生物学方法学研究的一大飞跃，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，在人类和动物疾病的快速检测、食品安全检测、定量分析、基因分型、基因表达研究、以及疫苗效力测定中广泛应用，已成为分子生物学研究的重要工具。
本文从实时荧光定量PCR技术的原理、荧光标记技术、定量方法以及实时荧光定量PCR技术在水产养殖研究领域的应用现状作了一个综述。
关键词：荧光定量；PCR；荧光标记；水产养殖实时荧光定量PCR技术（Real-time fluorescent quantitative PCR, real-time FQ-PCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。
在荧光定量PCR技术发展的过程中，两个重要的发现起着关键的作用：一是Taq DNA多聚酶的5’端核酸外切酶活性被发现，它能降解特异性荧光标记的探针，使得间接检测PCR产物成为可能；另一个是荧光双标记探针被使用在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。
在1996年由美国Applied Biosystems公司推出了一种实时荧光定量PCR 技术，它是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析[1]。
该技术不仅实现了PCR从定性到定量检测的飞跃，而且所有反应均在同一溶液中进行，不需任何后处理过程，具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高、能实现多重反应、定量结果具实时性和准确性等特点[2]。
目前已得到广泛应用, 包括对mRNA表达的研究、各种基因定量分析、点突变分析和等位基因分析、单核苷酸多态性分析、DNA甲基化的检测及对各种传染病进行定量定性分析。
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如何运用实时荧光定量PCR技术进行 动物源性成分检测
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、பைடு நூலகம்个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿