食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法(BJS 201904)
实时荧光PCR法检测食品中鸭肉成分说明书
实时荧光PCR 法检测食品中鸭肉成分程 欣，何玮玲，黄 明*(南京农业大学食品科技学院，食品安全与营养协同创新中心，江苏 南京210095)摘 要：以鸭肉细胞核中基因序列(IL-2)为目标序列，设计特异性引物和Taq Man 探针，设计并构建扩增内标，针对内标设计Taq Man 探针，通过对聚合酶链式反应(PCR)反应体系和反应条件的优化，建立用于检测食品中鸭肉成分的添加有扩增内标的的荧光PCR 方法。
通过扩增曲线和Ct 值分析该方法的特异性、检测限和灵敏度。
结果表明：Taq Man 探针实时荧光PCR 法具有很高的特异性，所建立的方法能够检测出0.5ng 的鸭组分DNA ，灵敏度可达0.1%。
应用该方法对市售38份样本进行抽样检测，结果令人满意。
关键词：细胞核基因；扩增内标；实时荧光聚合酶链式反应；鸭肉Establishment and Application of Fluorescent Real-Time PCR for the Detection of Duck Meat in FoodsCHENG Xin ，HE Wei-ling ，HUANG Ming *(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)Abstract ：Fluorescent real-time PCR system for the assay of duck meat in foods was established on the basis of a pair of primers and the Taq Man probe speci fic for duck was designed according to the sequence of duck nuclear gene (IL-2). We also designed and established an internal ampli fication control (IAC) and Taq Man probe for IAC. Results showed that the speci ficity of Taq Man real-time PCR was reliable and it could detect the presence of duck meat even when the concentration of DNA was reduced to 0.5 ng. The sensitivity of this method was 0.1%. Its accuracy was veri fied with 38 food samples from the market.Key words ：nuclear DNA ；internal ampli fication control ；fluorescent real-time polymerase chain reaction ；duck meat 中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)24-0092-05doi:10.7506/spkx1002-6630-201324019收稿日期：2013-03-04基金项目：国家“863”计划项目(2011AA100805-1)；农业部公益性行业(农业)科研专项(201303083-2)；国家农业科技成果转化资金项目(2012GB2C100151)作者简介：程欣(1990—)，女，硕士研究生，研究方向为肉品质量与安全控制。
《食品中5种α受体阻断类药物的测定》补充检验方法发布
15《轻工标准与质量》2019年第1期国内外标准动态四项食品补充检验方法发布《食品中5种α-受体阻断类药物的测定》补充检验方法发布《食品中二甲双胍等非食品用化学物质的测定》、《小麦粉及其制品中氨基脲含量的测定》、《食品中二苯乙烯类阴离子型荧光增白剂的测定》和《食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR 法》4项食品补充检验方法已由国家市场监督管理总局批准发布。
《食品中二甲双胍等非食品用化学物质的测定》规定了食品（含特殊食品）中二甲双胍、苯乙双胍、丁二胍、伏格列波糖、阿卡波糖、维达列汀、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、氯磺丙脲、达格列净、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、醋磺己脲、妥拉磺脲、瑞格列奈、卡格列净、格列齐特、格列波脲、格列本脲、那格列奈、格列美脲、曲格列酮、格列喹酮、莫格他唑、GW501516、环格列酮等27种非食品用化学物质的高效液相色谱-串联质谱测定方法，适用于茶叶、奶粉、饼干、酒、饮料等食品（包括上述类似基质的片剂、胶囊剂等形式的特殊食品）中二甲双胍等27种非食品用化学物质的测定。
《小麦粉及其制品中氨基脲含量的测定》规定了小麦粉及其制品中氨基脲残留的液相色谱-串联质谱测定方法，适用于小麦粉及以小麦粉为主要原料的各种制品中氨基脲残留量的检测。
《食品中二苯乙烯类阴离子型荧光增白剂的测定》规定了食用菌、大米、小麦粉和小麦粉制品、淀粉和淀粉制品中11种二苯乙烯类阴离子型荧光增白剂的高效液相色谱测定方法。
11种荧光增白剂包括荧光增白剂24、荧光增白剂71、荧光增白剂85、荧光增白剂90、荧光增白剂113、荧光增白剂210、荧光增白剂220、荧光增白剂264、荧光增白剂353、荧光增白剂357、荧光增白剂5bm，适用于食用菌、大米、小麦粉和小麦粉制品、淀粉和淀粉制品中11种二苯乙烯类阴离子型荧光增白剂的定量分析。
《食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR 法》规定了肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分检测的实时荧光PCR 方法，适用于肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分的一种或多种成分同时定性检测。
食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法(BJS 201904)
附件4食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法BJS 2019041 范围本方法规定了肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分检测的实时荧光PCR方法。
本方法适用于肉及肉制品中猪（Sus scrofa）、驴（Equus asinus）、山羊（Capra hircus）、绵羊（Ovis aries）、牦牛（Bos grunniens）、鼠源性成分的一种或多种成分同时定性检测。
注：本方法中鼠源性成分包括海狸鼠（Myocastor coypus）、小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、豚鼠（Cavia porcellus）和竹鼠（Rhizomy spruinosus）源性成分。
2原理提取样品DNA，通过特异性引物探针进行动物源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR 扩增反应中产物荧光信号及扩增曲线判定，实现对样品动物源性成分的定性分析。
3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682的要求。
所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
3.1检测用引物和探针(a) 猪cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-3’3’端引物：5’-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3’探针：5’-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACATCTCCTA-BHQ1-3’(b) 驴nad5基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-3’3’端引物：5’-GTGATGAGGATACGTGCT-3’探针：5’-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3’(c) 山羊cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-3’3’端引物：5’-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3’探针：5’-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3’(d) 绵羊cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-CTCATGCTACTAGTACTATTTACG-3’3’端引物：5’-GTACGCGAATAGGAAGTATCAT-3’探针：5’-FAM-TGACTTACTCGGAGACCCAGACAACTACAC-BHQ1-3’(e) 牦牛cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA-3’3’端引物：5’-CGTCTCGGCAGATATGGACA-3’探针：5’-FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-BHQ1-3’(f) 鼠cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-CTCCACGAGACAGGATCAAACAACCCATCAGGACTAAA-3’3’端引物：5’-TCATTCTGGTTTGATGTGGGGTGGGGTATT-3’探针：5’-FAM-TAGTGGGTTAGCAGGTGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-BHQ1-3’3.2 CTAB裂解液：2% (w/v) CTAB，1.4mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，用10%盐酸调节pH至8.0，121℃高压灭菌20 min，备用。
实时荧光PCR和常规PCR方法检测饲料中鸡源性成分
进 口ｌ １ ｌ 为农业 大 国。 国必须加 强对动 物源性 饲料 。作 我 建立能 够快速 、 确鉴别 检测 饲料 中鸡 源性 成分 的方 准
法 。本 研 究 采 用 常 规 Ｐ Ｒ方 法 和 实 时 荧 光 Ｐ Ｒ方 法 Ｃ Ｃ
检 测 饲 料 巾 鸡 源 性 成 分 法 的 灵 敏 度 高 ． 用 性 强 。 方 实
宁 省
采 Ｐ 。公。 Ｍｎ Ａｕｃ ｎ 用 ｇ 司 ａｔ ＮＰｆｉ … “ ｇｉ ……ａ 。６ ’ ｅＤ ｉｔ …“ ｍａ 的 …… … ｃ …“ ｉ。
实 时荧 光 Ｐ Ｒ扩 增 反 应 具 体 条 件 ：５℃ ３ 、 Ｃ ９ ０ Ｓ
穆春、 孙屏、 刘岑杰、 徐建平， 单位及通讯地址同第一作者。 杨滴、 夏元凤， 大连标准检测技术研究中心。 收稿 日 ２ １— ２Ｏ 期：００ ０一 ｌ
引 物合成及 探针合 成 、标 记购 自Ｔ Ｋ Ｒ ａ ａ ａ大连宝
生 物 公 司 ，实 时 荧 光 Ｐ Ｒ 引 物 序 列 及 探 针 的 序 列 见 Ｃ 表 １ 常 规 Ｐ Ｒ 引 物 序 列 及 扩 增 长 度 见 表 ２ ； Ｃ 。 １ 模 板 Ｄ Ａ 的 提 取 ． ５ Ｎ
适 用 于 鸡 源 性 成 分 的检 测
《 饲髑 工 业 》 ２ １ 第 ３ 卷 第 ７期 ・０ ０年 １
实 时荧 光 Ｐ Ｒ和 常规 Ｐ Ｒ方法 Ｃ Ｃ 检测饲料 中鸡源性成分
刘 彦泓 穆 春 孙 屏 杨 滴 刘岑杰 夏元 凤 徐 建 平
摘 要
根 据 鸡 线粒体 Ｄ Ａ序 列 ， 计并 筛选 了鸡源 性特 异 引物及探 针 ， 立 了饲料 中鸡 源性 Ｎ 设 建
应试剂盒（ｒｍ ｘ ｘ ａ Ｔ 、０ Ｐ Ｒ缓 冲液／ Ｔ Ｐｅ ｉ Ｅ ｑ ）１ｘ Ｃ Ｔ Ｍ ｄ Ｐ溶液 、 Ｎ ＥＴ ｑ Ｎ ｘ ａ Ｄ Ａ聚合酶 、０ ｋ ｒ １０ｂ Ｍａｅ（ ｐ 片段大小分别为 １０ ０、
实时荧光定量PCR检测肉制品中牛源性成分及其含量
实时荧光定量PCR检测肉制品中牛源性成分及其含量作者：谭波杨春萍刘小玲来源：《福建农业科技》2023年第10期摘要：建立一種快速、高效、准确且低成本的肉制品中牛源性成分鉴定及量化检测方法。
以细胞核单拷贝基因bosPDE为目的基因，LcoR为内参基因分别合成引物及探针，优化反应条件，评价该方法的特异性和灵敏度。
采用实时荧光PCR相对定量法，以△Ct值与2△△Ct值线性模型分别建立回归曲线，通过人工模拟混合牛肉样品对方法准确性评估。
结果表明：目的基因bosPDE引物仅对牛肉DNA进行扩增，具有特异性，对牛肉DNA扩增的灵敏度可达0.01 ng·μL-1。
以△Ct值与2△△Ct值为定量指标的回归曲线分别为y=-3.096 5x+8.479 7（R2= 0.998）、y=0.712 2x+3.050 4（R2=0.988 7）。
两个方法检测35%～90%牛肉含量的人工模拟混合牛肉样品的回收率为分别为94.30%～102.52%、98.55%～106.30%。
将两种定量方法进行数均处理，回收率的偏差减少。
本研究建立的实时荧光定量PCR方法能够准确对肉制品中的牛源性成分进行定性，并可用于牛肉掺伪制品中的牛肉相对定量分析，对鉴别肉制品掺假以及量化牛肉制品成分含量具有重要参考价值。
关键词：肉制品；牛源性成分；实时荧光定量PCR；相对定量中图分类号：TS 251.5 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2023）10-0006-09DOI： 10.13651/ki.fjnykj.2023.10.002Detection of the Bovine-derived Materials and Their Contents inMeat Products by Real-time Fluorescence Quantitative PCRTAN Bo1，2， YANG Chun-ping3， LIU Xiao-ling1*（1. College of Light Industry and Food Engineering， Guangxi University， Nanning，Guangxi 530004， China;2. Guizhou Research and Application Center of Detection Technology， Guiyang， Guizhou 550014， China;3. Guizhou Institute of Analysis and Testing， Guiyang， Guizhou 550014， China）Abstract： In order to establish a rapid， efficient， accurate and low-cost method for the identification and quantitative detection of the bovine-derived materials in meat products， the primers and probes were synthesized with the single-copy gene of cell nucleus， bosPDE as the target gene and LcoR as the internal reference gene， to optimize the reaction conditions and evaluate the specificity and sensitivity of the method. By using the relative quantitative method of real-time fluorescence PCR， the regression curves were respectively established with the linear model of △Ct value and 2△△Ct value， and the accuracy of the method was evaluated by simulating artificially the mixed beef samples. The results showed that： the bosPDE primer of the target gene only amplified the DNA of beef， which was specific， and the sensitivity of amplification to beef DNA could reach 0.01 ng·μL-1. The regression curves with △Ct value and 2△△Ct value as the quantitative indexes were y=-3.096 5x+8.479 7 （R2=0.998） and y=0.712 2x+3.050 4 （R2=0.988 7）， respectively. The recovery rates of the artificial simulated mixed beef samples with 35%-90% beef content detected by the two methods were 94.30%-102.52% and 98.55%-106.30%， respectively. The deviation of recovery rate was reduced when the number-average treatment was carried out on the two quantitative methods. The real-time fluorescence quantitative PCR method established in this study could accurately characterize the bovine-derived materials in meat products， and could be used for the relative quantitative analysis of beef in the beef adulterated products. It had important reference value for identifying the adulteration of meat products and quantifying the concentrations of components in beef products.Key words： Meat products； Bovine-derived materials； Real-time fluorescence quantitative PCR； Relatively quantitative近年来，随着全球化经济的高速发展，人们的物质需求逐渐提升，各种肉类食品的流通和交易也越来越频繁，这使得一些不法商家为了牟取暴利，以低价肉替代高价肉，导致肉制品掺假事件频繁发生［1-3］。
肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法 编制说明
肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法编制说明一、任务来源本标准由中华人民共和国商务部提出并归口，由商务部流通产业促进中心实验室生物检测室研究小组完成方法的建立优化、标准的起草制定工作。
二、编制依据本标准遵循GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》、GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的编写规则、GB/T6379《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度》第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的方法》。
三、目的和意义随着市场经济的不断深入发展，部分不法商贩为了谋求不正当利益，在肉（制）品中掺杂其他价格便宜的肉种，在肉（制）品市场出现了一种“以次充好、以假乱真”的现象。
通过实验室前期大量的调查研究分析，我们发现肉（制）品中掺杂、掺假的现象已经十分普遍，大部分肉（制）品中掺有标称以外的其他价格便宜的动物源性成分，有的甚至全部为标称以外的其他价格便宜的动物源性成分。
这极大地损害了消费者的利益，扰乱了流通市场秩序和健康发展，同时也对民族宗教信仰造成一定的潜在冲突。
但目前，相应的检测鉴定方法标准的缺失，使得检测监测机构对此无标可依，无法可循，难于判断和裁决。
为了规范国内市场流通秩序，保证市场的正当竞争，保护消费者的经济利益和对所购买商品的选择权、知情权及宗教信仰归属，制定本检测标准。
四、编制过程《肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法》该方法标准由商务部流通产业促进中心起草编写。
经过中国科学院微生物研究所、中国农业科学院饲料研究所、中国农业大学食品科学与营养工程学院三家单位进行了方法的复核验证实验，并提交了具体的复核验证报告。
根据国家有关标准制定和修订工作的要求，商务部流通产业促进中心在《肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法》的起草编制过程中，主要工作包括以下几个方面：1、详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，如食品、化妆品和饲料中牛、羊、猪源性成分检测方法及动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法等国内已申请的相关检验报告，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。
动物源性食品中病原体检测的分子生物学方法
动物源性食品中病原体检测的分子生物学方法动物源性食品是人们日常饮食中重要的食物来源，但质量安全问题一直是备受关注的话题。
近年来，以微生物污染为主的安全问题越来越成为消费者和从业者所担忧的问题。
其中，病原体是食品中一种严重的污染因素，它们可能引起诸多疾病，包括食源性疾病、时效性出血性大肠杆菌感染、鸟流感等，对大众的健康稳定构成巨大的威胁。
因此，开发各种高效地检测方法对保证动物源性食品质量安全具有重要意义。
分子生物学方法逐渐成为一种常用的病原体检测方法，具有高灵敏度和特异性的优点，适用于常见的动物源性食品病原体检测。
本文将介绍几种分子生物学方法及其应用于动物源性食品病原体检测的应用。
1. PCR 检测法PCR 是一种广泛应用的分子生物学方法，可以高效地扩增目标基因序列，并结合不同检测技术以实现快速准确地检测目标序列。
PCR 可以用于检测细菌、病毒、真菌等微生物的基因序列，其主要优势在于检测灵敏度高、特异性好、快速准确。
在食品安全领域，PCR 是其重要检测技术之一。
对于食品中的细菌和病毒，针对性的 PCR 检测方法已经被广泛开发。
例如，针对鸡肉、牛肉肉类的微生物分子扩增方法，以及对禽肉中沙门氏菌、牛肉中肉毒杆菌的 PCR 检测方法，也得到了大力应用。
应用PCR 技术对食品中的病原体进行检测，有利于及时查明食品的质量安全问题，并为后续的食品安全问题预防提供了有力支持。
2. 实时荧光 PCR 检测法实时荧光 PCR 是一种高灵敏度，具有实时监测扩增过程、定量、高通量的检测技术。
与普通 PCR 不同的是，它可以实现扩增过程的同步监测，从而使其产生的信息更加准确、可靠。
通过实时荧光PCR，我们可以有效地检测食品中的细菌、病毒、真菌等病原体。
实时荧光 PCR 检测法可以广泛应用于食品、饮料等领域。
例如，可以用于检测婴儿配方乳粉中的沙门氏菌、12种食源性病毒、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。
还可以对贝类中的细菌和病毒进行检测，如绿藻素毒素样气单胞菌、嗜盐菌和肠道病毒等，这有效地提高了食品安全监管的力度。
肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法 编制说明
肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法编制说明一、任务来源本标准由中华人民共和国商务部提出并归口，由商务部流通产业促进中心实验室生物检测室研究小组完成方法的建立优化、标准的起草制定工作。
二、编制依据本标准遵循GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》、GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的编写规则、GB/T6379《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度》第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的方法》。
三、目的和意义随着市场经济的不断深入发展，部分不法商贩为了谋求不正当利益，在肉（制）品中掺杂其他价格便宜的肉种，在肉（制）品市场出现了一种“以次充好、以假乱真”的现象。
通过实验室前期大量的调查研究分析，我们发现肉（制）品中掺杂、掺假的现象已经十分普遍，大部分肉（制）品中掺有标称以外的其他价格便宜的动物源性成分，有的甚至全部为标称以外的其他价格便宜的动物源性成分。
这极大地损害了消费者的利益，扰乱了流通市场秩序和健康发展，同时也对民族宗教信仰造成一定的潜在冲突。
但目前，相应的检测鉴定方法标准的缺失，使得检测监测机构对此无标可依，无法可循，难于判断和裁决。
为了规范国内市场流通秩序，保证市场的正当竞争，保护消费者的经济利益和对所购买商品的选择权、知情权及宗教信仰归属，制定本检测标准。
四、编制过程《肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法》该方法标准由商务部流通产业促进中心起草编写。
经过中国科学院微生物研究所、中国农业科学院饲料研究所、中国农业大学食品科学与营养工程学院三家单位进行了方法的复核验证实验，并提交了具体的复核验证报告。
根据国家有关标准制定和修订工作的要求，商务部流通产业促进中心在《肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法》的起草编制过程中，主要工作包括以下几个方面：1、详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，如食品、化妆品和饲料中牛、羊、猪源性成分检测方法及动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法等国内已申请的相关检验报告，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。
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附件4
食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法
BJS 201904
1 范围
本方法规定了肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分检测的实时荧光PCR方法。
本方法适用于肉及肉制品中猪（Sus scrofa）、驴（Equus asinus）、山羊（Capra hircus）、绵羊（Ovis aries）、牦牛（Bos grunniens）、鼠源性成分的一种或多种成分同时定性检测。
注：本方法中鼠源性成分包括海狸鼠（Myocastor coypus）、小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、豚鼠（Cavia porcellus）和竹鼠（Rhizomy spruinosus）源性成分。
2原理
提取样品DNA，通过特异性引物探针进行动物源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR 扩增反应中产物荧光信号及扩增曲线判定，实现对样品动物源性成分的定性分析。
3试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682的要求。
所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
3.1检测用引物和探针
(a) 猪cytb基因检测用引物探针序列为：
5’端引物：5’-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-3’
3’端引物：5’-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3’
探针：5’-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACATCTCCTA-BHQ1-3’
(b) 驴nad5基因检测用引物探针序列为：
5’端引物：5’-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-3’
3’端引物：5’-GTGATGAGGATACGTGCT-3’
探针：5’-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3’
(c) 山羊cytb基因检测用引物探针序列为：
5’端引物：5’-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-3’
3’端引物：5’-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3’
探针：5’-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3’
(d) 绵羊cytb基因检测用引物探针序列为：
5’端引物：5’-CTCATGCTACTAGTACTATTTACG-3’
3’端引物：5’-GTACGCGAATAGGAAGTATCAT-3’
探针：5’-FAM-TGACTTACTCGGAGACCCAGACAACTACAC-BHQ1-3’
(e) 牦牛cytb基因检测用引物探针序列为：
5’端引物：5’-AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA-3’
3’端引物：5’-CGTCTCGGCAGATATGGACA-3’
探针：5’-FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-BHQ1-3’
(f) 鼠cytb基因检测用引物探针序列为：
5’端引物：5’-CTCCACGAGACAGGATCAAACAACCCATCAGGACTAAA-3’
3’端引物：5’-TCATTCTGGTTTGATGTGGGGTGGGGTATT-3’
探针：5’-FAM-TAGTGGGTTAGCAGGTGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-BHQ1-3’
3.2 CTAB裂解液：2% (w/v) CTAB，1.4mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，用10%盐酸调节pH至8.0，121℃高压灭菌20 min，备用。
3.3蛋白酶K：20mg/mL，-20℃保存备用。
3.4苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇（体积比25∶24∶1）。
3.5异丙醇，优级纯。
3.6 70%乙醇。
3.7实时荧光PCR预混液。
以2×预混液为例，成分为：PCR 缓冲液（终浓度1×），氯化镁（终浓度2.5 mmol/L），dNTP（终浓度0.2mmol/L），Taq DNA聚合酶（终浓度1 U）。
3.8TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA （pH8.0）。
4仪器和设备
4.1 组织研磨器。
4.2 核酸蛋白分析仪。
4.3 恒温水浴锅。
4.4 离心机（最大离心力≥12000g）。
4.5 微量移液器（0.1μL~2.5μL，0.5μL~10μL，10μL~100μL，100μL~1000μL）。
4.6 实时荧光PCR仪。
4.7 涡旋振荡器。
4.8 电子天平：感量0.01 g。
4.9高压灭菌锅。
4.10 pH计。
5分析步骤
5.1 试样选取与制备
多点采取肌肉组织，选取适量具有代表性的样品进行均质处理。
所用器皿应为一次性耗材，或经过彻底清洗和高压消毒并单独使用。
用过的器皿应采取措施消除核酸的污染，否则不可重复使用。
5.2DNA提取
称取解冻后的均质样品0.1g~0.2g，置于2mL离心管中，加入600 μL CTAB裂解液和20μL 蛋白酶K，振荡混匀，65℃孵育1h~2h，期间每隔10min振荡混匀；加入500 μL的苯酚：三氯甲烷：异戊醇（25∶24∶1），充分振荡混匀，12000g离心5min；小心吸取上清液至洁净的1.5mL离心管内，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，12000g离心5min；弃去上清液，500μL70%乙醇洗涤2次，12000g离心5 min，弃上清液，晾干；加入50µL~100µL TE缓冲液或无菌双蒸水，溶解DNA，-20℃保存备用。
同法提取阳性对照、阴性对照及空白对照。
也可用等效商品化的试剂盒提取DNA。
5.3DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度及纯度，DNA浓度在1ng/μL~100ng/μL之间，
A260/A280值在1.7~2.0之间时，适宜于本方法。
5.4实时荧光PCR扩增
各动物源性成分PCR扩增均采用20μL的反应体系，包括PCR反应预混液（2×）10μL，5’端、3’端引物（10μmol/L）各0.2μL，探针（10μmol/L）0.1μL，DNA模板（1ng/μL~100ng/μL）1μL，用无菌双蒸水补足20μL。
每个样品设置两个平行反应体系。
PCR扩增反应程序为：95℃5min；35个循环（95℃ 15s，58℃ 1min，收集荧光）。
也可用等效的商品化试剂盒进行扩增。
5.5实验对照
实验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。
用相应动物源性成分生鲜肉样品作为阳性对照，用不含相应动物源性成分的生鲜肉样品作为阴性对照，用等体积的无菌双蒸水代替模板DNA作为空白对照。
6结果判断与表述
6.1 质量控制
(a)空白对照：无FAM荧光信号检出；
(b)阴性对照：无FAM荧光信号检出；
(c)阳性对照：有FAM荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值≤30.0。
否则判定为实验无效。
6.2 结果判定
(a)如有FAM荧光信号检出，Ct值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，则判定为被检样品阳性；
(b)如Ct值≥35或无Ct值，则判定为被检样品阴性；
(c)如有FAM荧光信号检出，且30.0＜Ct值＜35.0，则重新进行实验。
如再次扩增后Ct值仍＜35.0，且有典型的扩增曲线，则判定被检样品阳性；否则判定被检样品阴性。
6.3 结果表述
结果为阳性者，表述为“检出XX源性成分”。
结果为阴性者，表述为“未检出XX源性成分”。
7污染判定
在DNA浓度相对差值在20%以内的情况下，本方法所检测生鲜肉与阳性对照差值＞6，或肉制品与阳性对照差值＞10，且结果可独立重复，提示该源性成分含量低于2%。
8防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。
本方法负责起草单位：成都市食品药品检验研究院、中国科学院成都生物研究所、北京维德维康生物技术有限公司。
验证单位：山东省食品药品检验研究院、中国检验检疫科学研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、河北省食品检验研究院、国家副食品质量监督检验中心，广州质量监督检测研究院。
主要起草人：梁恒兴、尚柯、段庆梓、唐卓、张彪、马立才。