优选动物性食品卫生学实验
动物性食品卫生学课件：公共卫生实验教案
实验教案（首页）第一学期第1周至第8周实验教案（课时备课）课程名称：兽医公共卫生学课程类型：必修第1次课学时：4上课日期：1、教学内容（按章、节）：实验一大肠菌群最近似数（MPN）的测定2、教学目的：掌握动物性食品的大肠菌群最近似数的测定方法，了解各类动物性食品大肠菌群数的国家标准。
3、教学重点和难点：学会查大肠菌群最近似数(MPN)的检索表，并科学、合理报告检测结果。
拟解决方法：5、主要参考资料：动物性食品卫生学实验指导陈明勇主编中国农业大学出版社动物性食品卫生学实习指导徐克成主编中国人民解放军兽医大学6、教学进程：实验一、大肠菌群最近似数（MPN）的测定一、实验目的：掌握动物性食品的大肠菌群最近似数的测定方法，了解各类动物性食品大肠菌群数的国家标准。
二、实验准备：温箱、超净工作台、显微镜、乳糖胆盐发酵管、伊红美兰琼脂等。
三、实验内容：（一）大肠菌群测定的操作方法1、检样稀释（1）制备样品稀释液：以无菌操作将待检样品25ml（或25g）防于含有225 ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，充分振摇制备1:10的均匀稀释液。
（2）倍比稀释：用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混匀后，即制成1:100的稀释液。
同样方法在稀释1倍，制成1:1000的稀释液。
（3）根据待检查样品的污染情况，选择三个稀释度，每个稀释度各接种3管。
2、乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，每一个稀释度各接种3管，37℃培养24h左右，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；否则，如有产气者，则按下列程序进行。
3、分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，37℃培养18-24h后，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。
4、证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，37℃温箱内培养24h左右，观察产气情况。
动物性食品卫生学试验指导PPT课件
实验方法
• 感官检查 1 样品的采取 2 色泽与透明度 3 气味
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判定标准：食用猪油的感官指标
级别 项目
特级
一级
二级
色泽
在15-25℃凝固 时，呈白色， 溶化时透明
在15-25℃凝固 时，呈白色或略 带淡黄色阴影，
溶化时透明
在15-25℃凝固 时，呈白色或略 带淡黄色阴影， 溶化时透明或浑
5
判定标准 按食品卫生标准的要求，冻猪肉、冻羊 肉、冻鸡肉、鲜猪肉等挥发性盐基氮含量 （mg/kg）一级鲜度≤ 15，二级鲜度 ≤ 25
（三）pH值测定
将以上处理好的样品液用pH试纸测定其pH值。
6
（四）硫化氢反应
原理 肉类在腐败过程中，含硫氨基酸进一步分解，释放出 硫化氢，硫化氢在碱性条件下与可溶性铅盐发生反应，生成 黑色的硫化铅。
• 计算
V×N×56.1
X=
m
X-样品的酸价（mg）;V-样品消耗氢氧化钾标准溶液的体积（ml）;N-氢氧化 钾标准溶液的当量浓度；m-样品质量（g）；56.11-1N氢氧化钾标准溶液1ml 相当于氢氧化钾的毫克数。
判定标准：使用猪油酸价指标 特级≤1.0；一级 ≤2.0；三级≤3.0
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过氧化值测定
碘瓶中，加30ml三氯甲烷-冰乙酸混合液，使样品完 全溶解。加入1.0ml饱和碘化钾溶液，立即塞好瓶盖， 并轻轻振摇0.5min，然后再暗处放置3min。取出加 100ml水，摇匀，加1ml淀粉指示剂，立即用0.002N 硫代硫酸钠标准溶液滴定至蓝色消失为终点，取相同 量三氯甲烷-冰乙酸、碘化钾溶液、水，按同一方法， 做试剂空白试验。
试剂 1饱和碳酸钾溶液 2 水溶性胶 3 吸收液 4 混合指示剂 甲基红指示液和次甲兰指示液 5 0.0100N的盐酸标准溶液
实验二、动物性食品化学污染物检验
加入0.5mL盐酸萘乙二胺，加水稀 盐酸萘乙二胺， 加入 盐酸萘乙二胺 释至刻度，混匀、静置15分钟 释至刻度，混匀、静置 分钟
测定OD538 测定
X
m ′ V1 = m V2
式中： -样品中亚硝酸盐的含量， 式中：X-样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg； ； m-样品质量，g； -样品质量， ； m′-测定液中亚硝酸盐的质量，ug; -测定液中亚硝酸盐的质量， V1-样品处理液总体积，mL; -样品处理液总体积， ; V2-测定用样液体积， mL。 -测定用样液体积， 。
动物性食品卫生学实验
兽药残留 农药残留 工业“三废” 工业“三废” 食品添加剂
酸度调节剂、拮抗剂、抗氧剂… 酸度调节剂、拮抗剂、抗氧剂… 着色剂、护色剂：硝酸盐、 着色剂、护色剂：硝酸盐、亚硝酸盐
发色机理
亚硝基与肌红蛋白反应生成亮红色的亚硝基肌红蛋白。 亚硝基与肌红蛋白反应生成亮红色的亚硝基肌红蛋白。
毒副作用
亚硝酸盐毒性较强， 亚硝酸盐毒性较强，摄入量大可使血红蛋白变成高铁 血红蛋白，失去输氧功能，引起肠还原青紫症。 血红蛋白，失去输氧功能，引起肠还原青紫症。
样品经沉淀蛋白质、除去脂肪， 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪，在弱酸条 件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后， 件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与 盐酸奈乙二胺偶合形成紫红色染料。 盐酸奈乙二胺偶合形成紫红色染料。
制备亚硝酸钠标准 使用液（ 使用液（5ug/mL） ）
分别按下表取使用液加入到 25mL比色管，制成含亚硝酸钠 比色管， 25 比色管 制成含亚硝酸钠 不同氨基苯磺 加入1mL对氨基苯磺 酸溶液+0.5mL +0.5mL盐酸 酸溶液+0.5mL盐酸 萘乙二胺 6 7 8 9
动物性食品卫生检验
动物性食品卫生检验动物性食品的生物性污染指：微生物、寄生虫和昆虫等生物对动物性食品的污染。
内源性污染：动物在生活过程中，由其自身带染的微生物或寄生虫所造成的食用产品污染，又称一次污染。
内源性污染的主要途径有：1、非致病性和条件致病性微生物2、致病性微生物3、寄生虫外源性污染：指动物性食品在生产加工、运输、储藏、销售等过程中，受到外界环境中微生物或寄生物的污染，又称二次污染。
外源性微生物污染动物性食品的主要途径：1、通过水源、空气、土壤污染2、生产加工过程中的污染3、储运过程中的污染4、有害动物的污染动物性食品生物性污染的危害：食品的腐败变质、食源性疾病食品腐败变质:指在以微生物为主的各种因素作用下，所发生的食品成分和感官性质的变化，结果使食品的品质降低或变为不能食用的状态。
食源性疾病：凡是通过摄取食物而使病原体及其毒素或其他有害物质进入人体，引起的感染性疾病或中毒性疾病，统称为食源性疾病。
食源性疾病的分类：食源性感染、食源性中毒食源性感染：指人们食用了患人畜共患病动物的肉、孚L、蛋等或被病原微生物污染的食品而引起的感染性疾病。
食源性中毒（“食物中毒”）：指人们食用了某些被微生物及其毒素、有毒化学物质污染的食品或者有毒生物组织，致使人们发生急性中毒性疾病。
动物性食品生物性污染的评价指标：菌落总数、大肠菌群数、致病菌、细菌菌相菌落总数：只能作为判定食品被细菌污染的标志，反映食品受微生物污染的程度，但不能区分细菌的种类。
大肠菌群数：指一大群在37℃、24h内能够发酵乳糖，产酸，产气，需氧或兼性厌氧的革兰阴性无芽抱杆菌。
细菌菌相：指共存于食品中的细菌种类及其相对数量的构成。
其中相对数量较大的细菌称为优势菌种（属、株）。
沙门杆菌食物中毒机制与临床表现:大量活菌经肠系膜淋巴结进入血液循环，引起全身感染；活菌在肠系膜淋巴结和网状内皮系统被破坏时，释放出内毒素；活菌+内毒素共同作用于胃肠道，引起黏膜充血、水肿和出血，使患者出现一系列中毒症状，表现为头痛、恶心、呕吐、腹泻、体温升高等急性胃肠炎症状。
动物性食品卫生学实验
实验一肉新鲜度的检验一、实验目的1.掌握肉新鲜度的感官检查和实验室检查方法；2.学会几种肉新鲜度的简易快速测定方法。
二、主要仪器设备及其配套数笔式酸度计（1套）、微量酸式滴定管、天平、剪刀、镊子、漏斗架、漏斗（各5套）；烧杯、试管（7支）、锥形瓶（100ml）、量筒、玻棒、表面皿（各8套）；肉两块，一块新鲜，一块不新鲜；纳氏试剂、醋酸铅碱性溶液、滤纸、10%醋酸溶液、10%硫酸铜溶液、显色液、分光光度计、比色皿、95%酒精、甲醇、草酸铵结晶紫、碘液、吸水纸、蕃红染色液（稀）、显微镜油镜、载玻片三、实验项目内容1.感官检查；2.鲜肉pH值测定；3.粗氨的检测；4.硫化氢试验；5.球蛋白沉淀反应。
四、实验结果根据实验要求测定出肉pH值、粗氨的含量，结合感官检查、硫化氢试验、球蛋白沉淀反应的结果对肉的新鲜度进行综合评定，写出实验报告。
肉类含有丰富的营养物质，但不易久存。
在其加工、贮藏、销售过程中，由于受温度、光线、酸度、肉本身的含水量及细菌污染程度等影响，肉的新鲜度也会出现不同程度的变化，最为严重的是自溶过程之后的腐败过程，它不仅使肉的营养价值下降，而且产生对人体有害的产物(如吲哚、尸胺、腐胺、硫化氢等)，为了保障食肉卫生，必须进行肉新鲜度的检验。
肉的新鲜度检验，一般从感官性状、腐败分解产物的特性和数量及细菌的污染程度等三方面来进行的，采用单一的方法很难获得正确的结果。
因为肉的变质是一个渐进性过程，其变化又很复杂，很多因素都影响着人们对肉新鲜度的正确判断。
所以一般都采用感官检验和实验室检验结合的综合检验方法。
通常先进行感官检验，其感官性状完全符合新鲜肉指标时，可允许出售。
当感官检验不能确定是否为新鲜肉时，则应做实验室检验，并综合两方面的结果做出卫生评定。
1.感官检验肉在自溶、腐败变质的过程中，由于蛋白质的分解，因而引起肉的色泽、粘度、弹性、气味等感官性状的改变，可借助人的嗅觉、视觉、触觉、味觉来鉴定肉的卫生质量。
动物性食品卫生学实验PPT课件
三、检验程序
检样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质
10倍系列稀释
选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液 各取1 mL分别加入无菌培养皿内
每皿中加入15 mL～20 mL 平板计数琼 脂培养基，混匀
培养
计数各平板菌落数
计算菌落总数
报告
实验一、菌落总数测定
四、操作步骤
（一）样品稀释 1、 固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐 缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000~10000 r/min 均质 1~2 min，或放入盛有 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击 式均质器拍打 1~2 min，制成 1:10 的样品匀液。 2、 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷 酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无 菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。
每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条 件及其他生理条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质等）去 满足其要求才能将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般 都只用一种常用的方法去做。细菌菌落总数的测定，所得结果， 只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总数 。
实验一、菌落总数测定
（一）菌落总数的计算方法
3、 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度 最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平 均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 4、若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度 最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 5、 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则 以小于 1乘以最低稀释倍数计算。 6、 若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300 CFU之间， 其中 一部分小于30 CFU或大于300 CFU时，则以最接近 30 CFU或 300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
实验一、动物性食品的新鲜度检验
测定原理： 测定原理：
油脂在氧化过程中，氧与不饱和碳链化合而 生成过氧化物。碘化钾与过氧化物反应可释放出 碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘以求 得析出的碘量，间接得知油脂的过氧化物的含量。
R—CH—CH—R'+2KI → R—CH—CH—R'+I2+2CH3COOK+H2O O O O
I2+2Na2S2O3=Na2S4O6+2NaI
标准氢氧化钾溶液进行滴定至溶液出现浅红色，30s不 褪色为止。
V × N × 56.1 酸价(mgKOH/g油) = 酸价 油 W
式中： ——滴定消耗的氢氧化钾溶液体积 滴定消耗的氢氧化钾溶液体积， 式中： V——滴定消耗的氢氧化钾溶液体积，ml; ——氢氧化钾溶液当量浓度 氢氧化钾溶液当量浓度； N——氢氧化钾溶液当量浓度； 56.1——氢氧化钾的毫克当量； ——氢氧化钾的毫克当量 56.1——氢氧化钾的毫克当量； ——试样重量 试样重量， W——试样重量，g。 双试验结果允许差不超过0.2mg KOH/g油 求其平均数，即为测定结果， 双试验结果允许差不超过0.2mg KOH/g油，求其平均数，即为测定结果， 测定结果取小数点后第一位。 测定结果取小数点后第一位。
置于冷凝管下端并插 入吸收液的液面下 通入蒸汽
第一滴冷凝水时开始计时， 第一滴冷凝水时开始计时， 蒸馏5 min即停止 蒸馏5 min即停止
关闭蒸汽出口管
mol／ 用0.01 mol／L盐酸终点至蓝紫色
Z=
(V1—V2) × C × 14 m × (5／100) ／
样品中挥发性盐基氮的含量，mg／ g； 式中 ： Z ------ 样品中挥发性盐基氮的含量 ， mg ／ 100 g ； ------测定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液的体积 mL； 测定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液的体积， V 1 ------ 测定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液的体积 ， mL ； 试剂空白消耗盐酸或硫酸标准溶液的体积， mL； V 2 ---------试剂空白消耗盐酸或硫酸标准溶液的体积 ， mL ； -------盐酸或硫酸标准溶液的浓度 moI/L 盐酸或硫酸标准溶液的浓度， C ------- 盐酸或硫酸标准溶液的浓度 ， moI /L 14-------与 1.0mL盐酸标准溶液 [C(HCI)=0.1000 mol／ L]相当的毫克表示的氮的质量 14-------与 1.0mL盐酸标准溶液[C(HCI)=0.1000 mol／ L]相当的毫克表示的氮的质量 ------盐酸标准溶液 -------样品质量 样品质量， m ------- 样品质量 ， g 。
动物性食品卫生学实验实习指导
1
增加，pH 值下降，故新鲜肉的 pH 值低于 6.2。肉腐败时，由于肉中蛋白质在酶、细菌的
作用下，被分解为氨和胺类化合物等碱性物质，因而使肉趋于碱性，pH 值显著增高。测
定肉中 pH 值，在一定范围内可以反映肉的新鲜度及宰前健康状况，但不能作为判定肉新
（七）过氧化物酶反应 ［原理］新鲜健康的畜禽肉中含有氧化物酶。不新鲜肉、严重病理状态的肉或濒死 畜禽肉，过氧化物酶显著减少，甚至完全缺乏。因此，测定过氧化物酶有助于测定肉的 新鲜度及牲畜宰前是否健壮。 过氧化氢在过氧化物酶的作用下，可以分解放出新生态氧，它们可以使易氧化的联 苯胺指示剂氧化为二酰亚胺代对苯醌，后者与尚未氧化的联苯胺形成淡蓝色或蓝绿色化 合物，经过一定时间后变为褐色。 ［方法］取 2ml 肉浸液注入清洁的试管中，滴加５滴 0.2%联苯胺乙醇溶液，再加入 新配制的 1%过氧化氢溶液３滴，稍加振荡后，立即观察在３min 内颜色变化的速度及程 度，同时做空白对照试验。 ［判定标准］ 健康畜禽新鲜肉：肉浸液立即或在 30s 内呈蓝色或蓝绿色（30s 后变为褐色），为阳 性反应； 次鲜肉、过度劳累、衰弱、患病、濒死期或病死的畜禽肉：肉浸液在２～３min 后出 现淡青棕色，或完全无变化的为阴性反应； 变质肉：肉浸液无变化，或呈浅蓝色、褐色。 （八）细菌学镜检 ［触片制备］ 以无菌手段分别从肉样的表层（表层下约 2mm），中层（表层下 1～
撕下一条精密 pH 试纸，以其长度的 2/3 紧贴肉面，合拢剖面并夹住试纸 5min，然后取出
试纸与标准比色板比较，该法简便而快捷。
3．电位法（电化学法）：电位法使用的仪器称酸度计，因此又称酸度计测定法。测
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优选动物性食品卫生学实验
实验一、菌落总数测定
二、实验说明
菌落总数（aerobic plate count）是指食品检样经过处理，在 一定条件下培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总 数。
菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用 这一方法观察细菌在食品中繁殖动态，以便对被检样品进行卫生 学评价时提供依据。
五、结果与报告
（一）菌落总数的计算方法
N=∑C/（n1+0.1n2）d
式中： N——样品中菌落数； ∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度） 。
实验一、菌落总数测定
五、结果与报告
实验一、菌落总数测定
五、结果与报告
（二）菌落总数的报告
1、 菌落数小于 100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数 报告。 2、 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3位数字采用“四舍五入” 原则修约后，取前 2位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的 指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效 数字。 3、 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 4、 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 5、 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单 位报告。
（一）菌落总数的计算方法
稀释度 菌落数（CFU）
1:100（第一稀释度） 232，244
1:1000（第二稀释度） 33，35
N=∑C/（n1+0.1n2）d =（232+244+33+35）/【2+（0.1×2）】×10-2 = 544/0.022
= 24727
实验一、菌落总数测定
五、结果与报告
实验一、菌落总数测定
四、操作步骤
（三）菌落计数
菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
1、选取菌落数在 30~300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计 数菌落总数。低于 30 CFU的平板记录具体菌落数，大于 300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平 板的平均数。 2、 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以 无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不 到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半 个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 3、当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单 链作为一个菌落计数。
实验一、菌落总数测定
四、操作步骤
（一）样品稀释 3、 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL， 沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或 吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管 反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。 4、 按 3 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释 一次，换用 1 次1 mL 无菌吸管或吸头。
6、 及时将 15~20 mL 冷却至 46 ℃的平板计数琼脂培养基（可 放置于 46 ±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿 使其混合均匀。
实验一、菌落总数测定
四、操作步骤
（二）培养 1、待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ±1 ℃培养48±2 h。水产 品 30 ±1 ℃培养 72±3 h。 2、 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时， 可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约 4 mL）， 凝固后翻转平板，按 1 条件进行培养。
实验一、菌落总数测定
五、结果与报告
（一）菌落总数的计算方法
1、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计 算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数， 作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。 2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时， 按公式（1）计算：
实验一、菌落总数测定
实验一、菌落总数测定
四、操作步骤
（一）样品稀释
5、 根据对样品污染状况的估计，选择 2~3 个适宜稀释度的样 品匀液（液体样品可包括原液），在进行 10 倍递增稀释时， 吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。 同时，分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白 对照。
每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条 件及其他生理条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质等）去 满足其要求才能将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般 都只用一种常用的方法去做。细菌菌落总数的测定，所得结果， 只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总数 。
实验一、菌落总数测定
三、检验程序
检样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质
10倍系列稀释
选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液 各取1 mL分别加入无菌培养皿内
每皿中加入15 mL～20 mL 平板计数琼 脂培养基，混匀
培养
计数各平板菌落数
计算菌落总数
报告
实验一、菌落总数测定
四、操作步骤
（一）样品稀释 1、 固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐 缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000~10000 r/min 均质 1~2 min，或放入盛有 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击 式均质器拍打 1~2 min，制成 1:10 的样品匀液。 2、 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷 酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无 菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。