斑马鱼胚胎整体原位杂交_6.22
鱼藤素对斑马鱼胚胎中细胞周期蛋白D1基因下调的作用：整胚原位杂交检测
海 洋 ，女 ，１ ９ ９ １ 年 生 ，山 西 省运 城 市人 ，汉 族 ，硕 士 ，主要 从 事 肿瘤 药 物作 用 机制 研 究。
斑 马鱼 ：鱼藤 羁 ；缅 跑两 期
基 金资助 ：
广 东省 自然科 学基金 Ｉ 摘 要
３ ｏ ２ Ｑ 叭４ ８ ６ ．课 题 名称 ：零 ｊ ｝ 角 斑 马鱼模 型研 究鱼鼹 素 的抗聃 瘤 作甬 靶 点
通讯作者：昊新荣，博士， 主任药师，博士生导师 ， 华南理工大学轻工与食品 学院，广 东省广州市 ５ １ ０ ６ ４ １ ；解放 军 广州军 区 广 州总 医院 药剂 科 ，广 东
省 广州 市 ５ １ ０ ０ １ ０
背 景 ： 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 早 期 ， 细 胞 分 裂 增 殖 快 速， 低 浓 度 的 鱼 藤 素 可以 延 缓 斑 马 鱼 胚 胎 发 育。
Ｄｅ ｇｕ ｅ ｌ ｉ ｎ ｄ ｏ ｗｎ － ｒ ｅ ｇ ｕ ｌ ａ ｔ ｅ ｓ ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ｙ ｃ ｌ ｉ ｎ Ｄ１ ｇ ｅ ｎ ｅ ｉ ｎ ｚ ｅ ｂｒ ａ ｆ ｉ ｓ ｈ ｅ ｍｂ ｒ ｏ ｙ ｓ
ｔ ｈ ｒ ｏ ｕ ｇｈ ｔ ｈ ｅ ｗｈ ｏ ｌ ｅ ｍ ｏｕ ｎ ｔ／ ｎ ｓ ｉ ｔ ｕ ｈ ｙ ｂ ｒ ｉ ｄｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏｎ
鱼藤素对斑马鱼胚胎中细胞周期蛋白Ｄ １ 基因下调的 作用： 整胚原位杂交检测
海 洋’ ， 吴新荣’ ， （ ’ 华南理工大学轻工与食品学院，广东省广州 Ｉ 市 ５ １ ０ ６ ４ １ ； 解放军广州军区广州总医院药剂科 ，广东省广州市 ５ １ ０ ０ １ ０ ）
文 章 亮点 ： 斑马鱼胚胎发育早期，细胞分裂增殖迅速，有着与肿瘤细胞相似的特征。实验利用斑马鱼整体胚胎原位杂交 这 一技 术 ，研 究鱼藤 素对 ｃ ｙ ｃ ｌ ｉ ｎ Ｄ１ 基 因 的调控 表 达 ，从 而探 究鱼 藤 素调节 细 胞周 期信 号通 路 的相关 抗肿 瘤机 制 。实验 验证 了鱼 藤素 对 ｃ ｙ ｃ ｌ ｉ ｎ Ｄ １基 因的表 达下 调作 用 。 关键 词 ： 组织 构建 ：组 织Ｉ程 整 胚 啄位 杂 交 ：鱼藤 素；斑 马鱼 ：细跑 两期 蛋 白 Ｄ１ ：细 跑周 期 ：广 东雀 自然 科 学基金
2021正向遗传筛选斑马鱼肝脏、肠和胆囊发育缺陷突变体范文1
2021正向遗传筛选斑马鱼肝脏、肠和胆囊发育缺陷突变体范文 肝脏、胆囊、肠等是重要的消化器官，在食物消化、贮存、营养吸收、排泄和内分泌等方面都有着重要的作用[1].斑马鱼是常用的脊椎模式动物，它的消化器官组成结构和发育分子机制类似于哺乳动物[2].斑马鱼具有体外发育、胚胎透明、胚胎发育周期短、产卵量大等优点，突显其在遗传学研究上的优势，也使得斑马鱼成为目前唯一适合于大规模遗传筛选的脊椎模式动物[3].构建斑马鱼消化器官发育缺陷突变体有助于研究消化器官发育的分子机制，并可能用于人类相关先天性疾病的研究。
本课题通过在斑马鱼中进行无基因差别的正向遗传筛选，获得不同消化器官发育缺陷的突变体，为后续消化器官发育分子机制的研究奠定基础。
1材料与方法 1.1 材料 1. 1. 1 实验动物1突变体遗传诱变及传代。
1.1. 2 实验试剂多聚甲醛、氯化钾、磷酸氢二钠、氯化钠、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、氯化镁、柠檬酸、去离子甲酰胺（上海生工生物工程股份有限公司） ; PTU （ 1-phenyl-2-thiourea ）、 ENU （ N-ethyl-N-nitrosourea ）、 Tris（ pH 9. 5）、蛋白酶 K、BSA、NBT（ nitrotetrazolium bluechloride ）、BCIP （ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phos-phate）、肝素、tRNA（ Sigma） ; BES-H2O2-Ac 过氧化氢荧光染料（日本和光纯药工业株式会社） . 1.1. 3 实验器材斑马鱼养殖系统（北京爱生科技发展有限公司） ; 荧光体视显微镜（ Zeiss SteREO DiscoveryV20 ） ; 全自动荧光正置显微镜（ Zeiss AxiolmageZ2） ; 移液器（ Gilson 10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 mL） ; 恒温培养箱（ MemmentINE800） ; 盘旋混合仪（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司 KB-3-D） ;分子杂交箱（ UVP HL-2000 hybrilinker hybridizationOven / UV cross linker） ; pH 计及精密电子天平（ Mett-ler Toledo） ; 圆周式摇床（ GFL 3005 型） ; 24 孔细胞培养皿（ Costar） .1.2 方法 1.2. 1 胚胎收集及处理斑马鱼交配产生的受精卵收集于 0. 03% 的海盐水中，并于28℃恒温箱饲养。
(标准)斑马鱼胚胎原位杂交material&protocol
公司产品；
１ 显微注射用针，由Ｄｕｍｎ 公司 １ 毛细玻璃管拉制而成； ３ ． ｒｍｏｄ ０ 川
１． ４拉针仪 （ＥＡ Ｐ ） ＨＫ Ｐ ５ ，日本 ＨＫ 公 司产 品； Ｉ ＥＡ １． ５荧光解剖镜 （Ｘ－２ ，日本 ＯＹＰＳ ＳＺ １） ＬＭＵ 公司产 品； １． ６数码相机 （９５ ， 本 ＮＫＮ Ｅ９ ） Ｆ Ｉ ＩＯ 公司产品 ； 主要试剂、试剂盒 、酶 、载体和菌株
１ ．各种限制性内 切酶、 ４ＤＡ Ｔ－Ｎ 连接酶、 ｌ ｏ 片段均为Ｎｗ ｇａｄ ｌｂ 公司 Ｋｅ ｗ ｎ ｅ Ｅ ｌｎ Ｂｏａｓ ｎ ｉ
产 品；
２ ＰＲ 应试剂， ． 反 Ｃ 包括： ａ 酶、 应缓冲液、 ＮＰ Ｔｑ 反 ｄＴ 等均购 自 上海申 能博 彩生物公司： ３ 位杂交试剂：Ｓ６ ．原 Ｐ ＲＡ聚合 （ ５ 反应缓冲液和 ｌ ｍ Ｄ Ｎ 酶含 ｘ ０ Ｍ ０ Ｔ Ｔ溶液） Ｔ Ｒ 、 ７ Ｎ Ａ
Ｓ Ａ Ｔ ｇｎｃ ｏｄ 部分序列 ５ Ａ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｔ３ Ｍ Ｒ Ｏｉ ｕｌｔｅ ｌｏ ｅ ｉ ＇ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ ＴＴ Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ －’ － 作为５ ＇ 端
Ｐ Ｒ引物 ，进行 Ｐ Ｒ扩增 ｃ Ｎ Ｃ Ｃ Ｄ Ａ． Ｐ Ｒ反应 体系： Ｃ Ｆｒ－ｔｎ ｃ Ａ ｄ Ｎ ｉｔ ｒ ｓ Ｓａ Ｄ １１ ４ １Ｘ Ｒ ｅ ｂｆ ｒ ０ Ｃ ｕ Ｐ ５１ ４ ５ Ｘ Ｔ Ｍｉ Ｐ ｘ ０ Ｎ ｄ １１ ４
斑马鱼平滑肌特异性基 因 Ｓ ２ 的克隆 、表达和功能研究 Ｍ２ ａ
Ｌｎ，９７０ ｏｇ １９） Ｐ Ｒ产物克隆到 Ｔ ｅａ ｖ ｃｏ Ｃ － ｓｙ ｔｒ上，通过连接 、转化 、小量抽提 、限制性 内切酶 ｅ 酶切、电泳 鉴定出正确克 隆，具体步骤参考 《 子克 隆实验 指南 （ 分 第三版 ） ，并通 过测序 验证 其正确性 。大量抽提 Ｇ Ｔ －ｃ Ｎ Ｔ质粒 ，分 别采 用 限制性 内切 酶 Ｓｌ ＡＡ １ Ａ－ Ｄ ａ ｌ
p21基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达
p21基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达宋锦;姬牧远;吴西军;周艳华;舒莉萍;何志旭【摘要】目的：探究p21基因在斑马鱼早期发育过程中的表达。
方法：Trizol法提取野生型斑马鱼胚胎总RNA，RT-PCR法扩增p21基因片段，与pCS2﹢载体重组构建p21-pCS2﹢重组质粒，以T3 RNA 聚合酶制备地高辛标记的反义mRNA 探针，通过斑马鱼全胚胎原位杂交检测p21基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达。
结果：成功构建了p21-pCS2﹢重组质粒，并制备反义mRNA 探针；原位杂交结果显示野生型斑马鱼0.5~18 hpf的胚胎均未发现p21基因阳性杂交信号，24~36 hpf 胚胎可在脊索部位观察到阳性信号，48~72 hpf 胚胎可在头部胸腺附近观察到阳性信号，表达量均较低。
结论：成功制备了p21-pCS2﹢重组质粒及斑马鱼p21基因反义mRNA 探针，p21基因在野生型斑马鱼胚胎不同发育时相中表达水平不同。
%Objective:To explore the expression of p21 in zebrafish. Methods:Extract 0. 75 hpf~120 hpf wild-type Zebrafish embryos in multiple phase and total RNA by Trizol,amplificating p21 gene by RT-PCR,and constructing p21-pCS2﹢plasmid. Preparing antisense mRNA probe with T3 RNA pol-ymerase,using zebrafish whole-mount in situ hybridization to examine the p21 expression pattern in early embryo development. Results:Successfully constructed p21-pCS2﹢plasmid,preparing antisense mRNA probe;within situ hybridization,there is no expression of p21 in wild-type zebrafish at 0. 5 hpf~18 hpf;positive signal in notochord was found in 24 hpf~36 hpf of the wild-type Zebrafish embry-os,and positive signal could be found near head and thymus,but indicating low expression. Conclu-sion:In this research,it has beensuccessfully constructed p21-pCS2﹢ plasmid,antisense mRNA probe preparation,and have a preliminary observation in the expression of p21 gene in Zebrafish em-bryos in different periods.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2016(041)007【总页数】5页(P765-769)【关键词】p21;斑马鱼;胚胎;发育;探针;质粒【作者】宋锦;姬牧远;吴西军;周艳华;舒莉萍;何志旭【作者单位】贵州医科大学免疫学教研室，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学附院儿科学教研室，贵州贵阳 550004;贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学免疫学教研室，贵州贵阳550004; 贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学实验动物中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学免疫学教研室，贵州贵阳550004; 贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学附院儿科学教研室，贵州贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R394.3p21 基因表达产物是细胞周期的一种抑制因子，是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子CKI 中细胞因子诱导的蛋白/激酶相互作用蛋白Cip/Kip (cytokine-inducibleprotein/kinase inhibition protein,Cip/Kip) 家族的一员。
斑马鱼原位杂交实验方案
斑马鱼全胚胎原位杂交技术Form Dr. Kevin第一节原位杂交技术的历史Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）。
自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。
Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。
ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。
同年, Nusslein-Volhard 等将Cox 建立的RNA 原位杂交技术进行了改进, 用地高辛（digoxin）标记的RNA 在斑马鱼胚胎中检测基因表达。
2008 年, Bernard Thisse 等将该技术进一步优化, 使之更敏感, 也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 –69）。
第二节原位杂交技术的原理原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
斑马鱼的原位杂交技术
斑马鱼的原位杂交技术整理人邵明:将特定时期的斑马鱼胚胎在多聚甲醛中C4%4o固定过夜第一天：、洗1PBST2x5min、剥膜2、洗3PBST5min可选步骤蛋白酶处理前的胚胎不处理(: K: 24hpf, 24hpf-的胚胎蛋白酶处理分钟以后的胚胎处理半小时48hpf10ug/ml K15, 48hpf,然后洗PBST3x5min)、C5min4hyb- 65o孵育、C4h（可选步骤: 可将胚胎置于hyb+中-20oC长期储存）5hyb+ 65o孵育、加探针(探针孵育置于冰上65oC10min, 5min, 655oC-孵育过夜65oC先将然后使用).第二天：、回收探针, I2x30min1（探针可以重复使用10次以上）洗液孵育探针的温度、洗液孵育探针的温度2II 1x15min、洗液孵育探针的温度3III 2x30min、室温4MABT 3x5min、封闭液孵育室温5 4h、AP, 4oC (-20oC, 61:2500 Anti DIG-稀释于封闭液中孵育过夜稀释好的抗体保存于可重复使用3次以上。
)第三天、回收抗体1、2MABT 2x30min3、PBST 2x30min、平衡缓冲液左旋咪唑4+0.5mg/ml （60mg/ml左旋咪唑储液稀释120倍）孵育10min、显色液中孵育直到信号足够强为止。
5试剂配方固定液: 4% 多聚甲醛（paraformaldehyde）in 1XPBSWeigh 2 g PFA and dissolve it in 50 ml 1XPBS. (PFA is hard to dissolve.) Incubate the mixture at 65oC for around 2 hours. Shake the mixture during the incubation). After dissolved, the solution is stored at 4oC.10XPBS stock solution: mix 76 g NaCl, 9.9 g Na2HPO4, 3.6g NaH2PO4. Dissolve them in less than 1 liter nanopure water, adjust to pH7.0 and a final volume of 1 liter. Autoclave for 35 minutes to sterilize.130 mM NaCl = 10 X 0.13 X 58.44=76 g NaCl7 mM Na2HPO4 = 10 X 0.007 X 142 = 9.9 g Na2HPO43 mM NaH2PO4 = 10 X 0.003 X 120 = 3.6 g NaH2PO4Paraformaldehyde (PFA) (Mallinckrodt 2621).（注意所用的试剂有没有结晶水）Proteinase K (Sigma P-2308); Stock solution (10 mg/ml = 10 ug/ul): weigh 10 mg proteinase K and dissolve in 1 ml nanopure water. Aliquot 50 ul each and store at -20oC. Thaw at room temperature before usage. Long storage may appear to see white precipitate after thawing. V ortex the tube and make sure the precipitate be mixed evenly.20XSSCFor 1 liter: 1 X 3 mol = 3 X 58.44 =175.3 g NaCl1X 0.3 mol = 0.3 X 294.1 = 88.2 g Na3.Citrate.2H20adjust pH=7 using HCl. autoclave 35 minutes for sterilizeization.（注意所用的试剂有没有结晶水）Yeast RNA: dissolve 50 mg RNA in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oC肝素（Heparin） (Sigma H3393): dissolve 50 mg heparin in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oCMAB X 2 liters pH7.5100 mM Maleic acid (Sigma M-0375) = 23.2 g (2 X 0.1 X116.1)150 mM NaCl = 17.5g (2 X 0.15 X 58.44)add solid (? g) to adjust pH=7.5, autoclave for 35 minutes to sterlize.Blocking regent (1096 176, Boehringer Mannheim, now Roche?). 10% stock solution. Weigh 10 g blocking regent and dissolve it in 100 ml MAB, shaking and heating in a microwave oven for 1 minutes (?), autoclave for 25 minutes and then aliquot into 14 ml and store at -20oC.50mg/ml 酵母RNA：称取2g酵母RNA干粉（生工），加入40ml去离子水，超声振荡溶解，-20oC保存。
斑马鱼相关实验操作
斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育一、实验目的了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。
二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。
在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。
斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。
最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。
为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。
斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。
2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。
3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。
4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。
5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。
6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。
因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。
三、实验器材和材料斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。
曝气水10L。
性成熟雌、雄性斑马鱼。
四、实验内容和程序实验前一天的准备：1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。
2、曝气水将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。
3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。
选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。
Le 斑马鱼nanos1基因在配子发生中的原位杂交研究
遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!"!#"#$%&!$&#$!’’$研究报告收稿日期!!’’#(((’"修回日期!!’’$’(!’基金项目!国家%)*计划!国家高技术研究发展计划项目"!编号#!’’(++!!!’"("和国家自然科学基金项目!编号#*’!"’)"$"资助%,-../01234567892:2;<18/9<=>0/?0<@:A /0B 8?7C 2D 79/=/?5E 2:2<0D 7<93F 2G 2=/.@291!;/H !’’(++!!!’"("$;<18/9<=;<1-0<=,D 829D 2I /-93<18/9/A 6789<!;/H *’!"’)"$"&作者简介!陈云贵!(&""’"$男$硕士研究生$研究方向#鱼类分子遗传学通讯作者!宋!平$J K @<8=#.89?:/9?.:"5<7//H D /@H D 9!"斑马鱼#$#%&’基因在配子发生中的原位杂交研究陈云贵(!宋!平(!吕道远(!周!伟(!桂建芳!!(H 武汉大学生命科学院发育生物学教育部重点实验室$武汉#*’’"!(!H中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室$武汉#*’’"!"摘!要!利用组织原位杂交技术$以地高辛标记的反义E ;+为探针$检测了斑马鱼!$/-+01*1+0"-/-02(基因在卵子发生及精子发生中的表达分布特点$初步探讨了该基因在斑马鱼配子发生中可能的功能)结果表明#在斑马鱼卵子发生中$-/-02(@E ;+均匀分布于卵原细胞和各时期卵母细胞的胞质中(在卵原细胞和#*$期卵母细胞中$-/-02(@E ;+的杂交信号十分强烈$而较晚期卵母细胞中信号明显减弱)在斑马鱼精子发生中$-/-02(@E ;+可在精原细胞和初级精母细胞中检测到)-/-02(@E ;+的阳性信号在精原细胞中极为强烈$在初级精母细胞中较为微弱$而精子细胞中没有阳性信号)结果初步表明$斑马鱼-/-02(基因对生殖干细胞K 卵原细胞和精原细胞的维持和正常功能可能起着重要作用)关键词!原位杂交(斑马鱼(-/-02((卵子发生(精子发生(生殖干细胞中图分类号!L &$*!!!文献标识码!+!!!文章编号!’!$*M &""!!!’’$"’#M ’$%&M 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6:"中的-/-02($-/-02!和-/-02*%"$%&$以及人类!!*E02/F+*-2"中的-/-02(%&&$并对其功能展开了广泛研究)果蝇的J/-02蛋白?G末端具有两个在进化上高度保守的锌指结构域$对于J/-02蛋白结合E;+活性及其功能是必需的%(’&)在果蝇中$因富集于受精卵末端的母源-/-02E;+翻译$产生一个从后到前逐渐降低的J/-02蛋白梯度%((!(*&)J/-02蛋白与K:E+6+0蛋白共同作用$抑制母源5:-45A/4L@E;+在胚胎后部的翻译$从而指导腹部发育%(#$($&)缺少-/-02基因仍可形成极细胞$但这些极细胞不能迁入胚胎性腺$不能分化为具有功能的生殖细胞%()$("&)在线虫与斑马鱼中$-/-02(基因同样不为原始生殖细胞!>O6:$.08@/038<=?20@D2==:"形成必需$但若缺少该基因的功能$>O6:也不能迁入胚胎性腺$过早地分化并死亡$说明-/-02(基因的功能在于指导>O6:正常迁移并且维持其生殖细胞命运%#$)&)在爪蟾中$H4/=K!E;+是生殖质组分$定位于成熟卵母细胞的植物极皮层$在卵子发生中不翻译)\D<1蛋白在体外能结合E;+$可能调控某些>O6:专一E;+的翻译%$$(%&)在小鼠中$-02(基因的合子在中枢神经系统中表达$不为正常发育所必需%"&)-02!基因敲除雄鼠精巢发育不良$精巢中完全缺失生殖细胞)-02*基因敲除小鼠>O6:的形成不受影响$但精*卵巢同样发育不良$完全缺失生殖细胞%%&)为了进一步探讨该基因在脊椎动物生殖细胞增殖和分化中的功能及其意义$本研究以斑马鱼的精巢和卵巢为材料$以F V O!地高辛"标记的-/-02基因的反义E;+为探针$通过组织切片原位杂交的方法$对该基因在斑马鱼卵子发生和精子发生过程中的表达及可能的功能进行了分析)(!材料和方法’@’!实验用鱼实验用斑马鱼购于武汉市武胜路花鸟虫鱼市场)’@A!重组质粒根据已发表的斑马鱼-/-02(基因的D F;+序列%)&$设计>6E引物$正向引物$]K O6CC C CC6C 6C C6C6K*]$反向引物$]K C6+66+C O CC O+C C C K *])以斑马鱼精巢D F;+为模板$扩增出一段#""4.的片段)将该片段克隆于.O J^K C载体!>0/K @2?<"中$作为合成E;+探针的模板)’@B!主要试剂与药品;C>,21$,>)+C"E;+./=5@20<:2均为^_V 公司产品)F V O K((K T C>和:722.<918K F V O K+>I<4 A0<?@291:为E/D72公司产品);_C+_6V>检测试剂盒为华美公司产品)’@C!实验方法(H#H(!质粒载体的转化!扩增与抽提按文献%(&&操作)(H#H!!质粒载体的酶切线性化在)’%Q的总反应体系中$带有目的基因核糖探针模板的重组质粒均为(%?)对于J2+#的酶切反应$含有#T J2+#!华美公司"(对于(F5#的酶切反应$含有#H$T(F5#!华美公司")酶切反应在*"‘保温#7后$异丙醇沉淀过夜)经"’a乙醇洗涤空气干燥后$溶于!’%Q F J>6K B!P$琼脂糖凝胶电泳检测其浓度)(H#H*!地高辛标记核糖探针的体外转录合成体外转录地高辛标记核糖探针按文献%!’&$并稍加修改进行)(H#H#!性腺组织切片的原位杂交!("冰冻切片的制备#在M!$‘$将性腺切片成(’!(!%@的切片$贴于载玻片上)!!"性腺组织切片的预杂交和原位杂交#在预杂交液!$’a甲酰胺的#b,,6"中*"‘预杂交($@89以上)滴加*’!#’%Q含$!(’9?探针的杂交液$盖上盖玻片)#!‘温盒杂交过夜)!*"杂交后漂洗#!b,,6和(b,,6各漂洗*次$每次(’@89)再用E;<:2+在*"‘消化未杂交E;+探针*’@89)再’H(b,,6漂洗#次$每次(’@89)!#"杂交信号的免疫检测!染色"#_-A A20 V!(’’@@/=+QC08:K B6=$.B"H$$($’@@/=+Q;<6="漂洗!次$每次(’@89)经抗体封闭液!_-A A20V c’H (a C081/9b K(’’c!a羊血清"浸泡*’@89)然后免!"#遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!’’$!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!疫结合#<918K F V O K+>按(d$’’稀释于稀释于封闭液中$滴加于切片上$湿盒中孵育!7)_-A A20V洗*次$每次(’@89)在_-A A20$!(’’@@/=+QC08:K B6=$ .B&H$$(’’@@/=+Q;<6=$$’@@/=+Q^?6=!"中浸泡(’@89)每片覆盖$’-Q显色液$湿盒中暗处显色’H$至#7)终止反应#用_-A A20&!(’@@/=+QC08:K B6=$.B%H’$(@@/=+QJ F C+"浸洗!次$每次$@89)最后系列乙醇’二甲苯脱水透明)中性树脂封片$显微镜检)!!实验结果A@’!斑马鱼卵子发生中#$#%&’9D E<的原位杂交检测结果斑马鱼-/-02(@E;+在卵原细胞和#*$*&*’期卵母细胞的胞质中均能检测到$但不存在于细胞核中!图($+")在卵原细胞和#*$期卵母细胞中$-/-02@E;+的杂交信号非常强烈$均匀地分布于整个胞质中!图($+*($F*($J")随着卵母细胞的生长发育及卵黄的积累$&*’期卵母细胞胞质中-/-02(@E;+的杂交信号明显减弱$但仍然是均匀地分布于整个胞质中!图($+*($J")A@A!斑马鱼精子发生中#$#%&’9D E<的原位杂交检测结果斑马鱼-/-02(@E;+的杂交信号可在精原细胞和初级精母细胞中检测到!图!+*!F")在精原细胞中$-/-02(@E;+的阳性信号极为强烈$初级精母细胞中信号较为微弱$而精子细胞中没有阳性信号!图!F")图’!斑马鱼#$#%&’基因在卵子发生中的原位杂交分析+#-/-02(基因反义链探针杂交结果(_#-/-02(基因反义链探针杂交结果(6#-/-02(E;+杂交信号在卵原细胞和#期卵母细胞中很强烈$均匀地分布于胞质中(F#-/-02(E;+杂交信号在&期卵母细胞中明显减弱(J#-/-02(基因正义链探针杂交结果(I#成熟卵巢B J染色P?#卵原细胞(#*$*&*’表示各时期卵母细胞(O e#生发泡)+#放大倍数为(’’(_*J*I#放大倍数为(’’(6*F#放大倍数为#’’) F27@’!6")"=)2%#%3;"51$32&-#$#%&’"/01"&&2%#+*12#7%%7"#"&2&5,2#&2)*-,512+2;$)2%# 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:12@D2=="的功能和存活而并非调控其形成%!$&)最近的研究发现$;<9/:蛋白在果蝇幼虫卵巢的>O6:及成虫卵巢中的生殖干细胞中高表达$在分裂增殖中的胞囊细胞也有表达(并证实$;<9/:蛋白在卵子发生中通过阻止生殖干细胞过早分化$来维持其干%"#遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!’’$!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!细胞自我更新的属性$而不为生殖干细胞之后的卵子发生事件所需%!)&)在斑马鱼中$母源-/-02(E;+也是生殖质组分$在早期胚胎中的表达模式与另一生殖质组分’’’</2/E;+一致$即在>O6:中特异表达)反义吗啡啉实验证明$斑马鱼>O6:的形成并不需要-/-02(基因$但它是>O6:正常迁移*存活及发育必需的%)&)在线虫和小鼠中的研究结果与之一致%#$%&)但至今未见对-/-02基因在鱼类配子发生中的表达和功能研究的报道)本研究结果显示$在斑马鱼卵子发生中$-/-02(@E;+在卵原细胞及#*$期卵母细胞中表达极高(在&*’期卵母细胞中也能检测到其存在(-/-02(@E;+在各时期卵母细胞中都是均匀分布的!图($_*6*F")-/-02( @E;+在卵原细胞中的高表达提示$-/-02(基因在斑马鱼卵巢中可能起着与其在果蝇中相同的作用$即维持生殖干细胞’卵原细胞的自我更新和正常功能)在爪蟾中$-/-02同源物H4/=G!E;+在#期卵母细胞中定位于线粒体云!@81/D7/9308<=D=/-3"%!"&)在卵子发生中$H4/=G!E;+连同生殖质一起迁移至成熟卵母细胞的植物极皮层%(%$!%&$但它在卵子发生中并不翻译%(%&$提示其对卵子发生可能并无直接作用$而是作为母源物质储存在卵母细胞中$在未来胚胎>O6:的发育中起着作用)斑马鱼-/-02(@E;+在#*$期卵母细胞中也有较高表达$较晚期的卵母细胞中也能检测到!图($6*F")斑马鱼卵母细胞中的-/-02(E;+可能同样仅仅作为母源物质$留作调控胚胎>O6:迁移与发育之用$而对卵原细胞之后的卵子发生可能并无调控作用)是否果真如此$还有待研究)精子发生也是一个典型的干细胞系统$-/-02基因在该过程中同样有着重要作用)在-02基因突变雄蝇精巢中$精子束极少甚至没有$在精巢前部积累了比野生型多得多的初级精母细胞$表明这类细胞的分化延迟或受阻(同时-02基因突变雄蝇大多表现出致育缺陷$说明-02基因突变雄蝇的精子发生确实受到影响%!$&)在小鼠中$-02!基因主要在雄性生殖细胞中表达$-02*基因在迁移中的>O6:中表达)-02!基因敲除雄鼠和-02*基因敲除雄鼠的精巢发育不良$重量只有野生型的(+*$#周龄精巢中完全没有生殖细胞%%&)在人类成体组织中$-02(基因只在精巢中表达(在成熟精巢中$ -02(基因在生殖干细胞’精原细胞中表达最高$减数分裂中的初级精母细胞中也有表达$但在减数分裂后的生殖细胞中不表达%&&)本研究结果表明$在斑马鱼精子发生中$-/-02(基因在精原细胞中表达极高$在初级精母细胞中表达较低$在次级精母细胞*精子细胞及精子中不表达!图!$+*F")据此推测$-/-02(基因不仅对于维持生殖干细胞’精原细胞的存活与功能有重要作用$并且在随后的减数分裂中也可能起着调控作用)总之$斑马鱼-/-02(基因在生殖干细胞’卵原细胞和精原细胞中有极为活跃的表达$表明该基因应该对于生殖干细胞的维持与功能有着重要作用)在斑马鱼中$-/-02(基因如何维持生殖干细胞并维持的自我更新与功能还有待继续研究)参考文献#D"3"1"#="&$!%(&!U<9?6$Q27@<99E H;<9/:8:172=/D<=8X23./:1208/032120@8K 9<9189F0/:/.78=<H?*66$(&&($))#)*"!)#"3%!&!>8=/9^$U28:4=<1F+H+9<9/:7/@/=/?89=22D7H$*<*60F G E*-=$(&&"$(!#$(""(!("%’3%*&!^/D78X-[8f$,<9/B$f/4<5<:78,$;8:78@85<K I-g8:<Y<$6$ I-g8:<Y<C H J Z.02::8/9<932G/=-18/9<05D/9:20G<18/9/A9<9/:K 02=<123?292:89B530<H$*<M*-*2"<06$!’’’$!(’$$&(!)’!3 %#&!,-40<@<98<@$f$,253/-ZO H9/:K(<939/:K!$1Y/?292:02=<1K 231/F0/:/.78=<9<9/:$02?-=<12.08@/038<=?20@D2==32G2=/.K @291<93:-0G8G<=89?/*-015/A D+=+2*6*./-23$*<*60F E*-=$ (&&&$(!)$#%)(!#%"(3%$&!Q-8:^/:h-20<$6<05=I/008:1<==$N8S7/-$^<05Q/-f89?H+ @E;+=/D<=8X231/172G2?21<=D/012Z/A H*-0F:2//D512:29K D/32:<.0/1289Y817<-/-02G=8[2X89D 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*-=/6)+060.>$!’’’$!("$!!(!!!&"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""3欢迎订阅%动物学杂志&!!,动物学杂志-是由中国科学院动物研究所*中国动物学会主办的科技期刊$亦是中国自然科学核心期刊)主要报道动物学领域的最新研究成果$介绍有创见的新思想*新学说*新技术*新方法)报道范围既有宏观生态研究$又有微观实验技术)报道层次既有科学前沿性*资料性的$也有技术性*知识性的)稿件内容涉及范围广$实用性强$主要栏目有#研究报告*珍稀濒危动物*技术与方法*研究简报和快讯*科技动态等等)读者对象为动物科学领域的研究*教学*技术*管理人员及广大业余爱好者)根据中国科技信息所信息研究中心!’’#年发表的数据$,动物学杂志-各项统计指标有了很大的提高$除了被国内各大数据库收录外$已分别被国外著名数据库英国,动物学记录-*美国,化学文摘-*俄罗斯,文摘杂志-收录),动物学杂志-双月刊$()开$((!页$每册定价!$元$全年($’元$国内外公开发行)国内邮发代号#!M #!!(国外发行代号!6/32;/H "#_^$%)全国各地邮局均可订阅)如未能在当地邮局订到$可与编辑部直接联系)本刊对在校学生及个人订户"折优惠!直接与编辑部联系订阅")地址#北京市北四环西路!$号,动物学杂志-编辑部!!邮编#(’’’%’(电话#!’(’")!$%(#"$(J K @<8=#g /-09<="8/X H <D H D 9)网址#4803H D 789<g /-09<=H 921H D 9)欢迎投稿*欢迎订阅*欢迎刊登广告)’"#遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!’’$!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!。
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斑马鱼胚胎整体原位杂交(Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos)北京大学遗传与发育生物学实验室整理者：肖安版本：V6.22 Build 2006-8-17说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。
在整个实验中应当注意：(1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。
因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止污染。
操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA 在常温或37℃放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。
实验间隙中RNA放置在-20℃，过夜或更长时间保存在-80℃。
(2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。
避免漏加溶液。
(3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。
一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。
(4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。
吸时动作要轻。
任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。
(5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。
第一天以下操作需戴乳胶手套。
1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。
1.1吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。
梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。
稀释时间宁长勿短。
特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。
1.2 PBST处理5分钟，两次。
2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。
2.1用蛋白酶K的PBST溶液(在管中原有的约1mLPBST中加入1uL10mg/mL的蛋白酶K，终浓度消化的目的是使探针更容易进入组织中。
应根据胚胎质量、以前原位杂交结果适当增减时间。
注意双氧水脱色的胚胎受损害较大，蛋白酶K处理时间应大大短于培育时加入PTU阻止色素生长的胚胎。
理论上换新的酶和新胚胎都应该重试处理时间。
以下操作室温进行，注意溶液预热。
2.2消化时间到后，先尽快用PBST暂时漂洗，然后PBST洗5分钟，一到两次。
在PBST洗后或下一步多聚甲醛固定后可以按照探针将胚胎分管和混合，注意同一管中的胚胎发育时期不宜相隔过近，以免最后观察结果时难以分辨。
但若相隔过远，后面的染色时间可能会有很大差异，并且处于发育较早期的胚胎破裂时卵黄可能污染发育较晚期的胚胎。
每一时期每一探针需15枚左右(发育早期的胚胎在实验中容易损坏，宜多取一些)。
若做正负对照，正对照用已明确的Marker基因探针(反义RNA链)，或者对胚胎进行双染。
负对照使用正义RNA链，或者不加探针(如粗略筛选时)。
注意及时写上新的标签编号并记录下每个编号对应的各胚胎时期。
2.3 4%多聚甲醛(paraformaldehyde, para)固定20分钟。
提前解冻，每次实验都尽量用一管新的多聚甲醛，避免RNase污染。
未使用完部分可用于固定胚胎。
用于原位杂交的胚胎都使用多聚甲醛固定。
甲醛苦味酸混合液固定胚胎虽然能更好的保持形态，但将破坏胚胎抗原性，导致零结果。
2.4 PBST洗5分钟，两次。
以上两步用PBST洗涤也可改为PBT，后者含有小牛血清，对胚胎保护更好。
以下65℃的操作步骤在水浴箱(water bath)或杂交炉(hybridization oven)中进行，注意溶液预热。
3 预杂交(Prehybridization)。
加入500uL HYB，65℃预杂交至少4小时。
4 杂交(Hybridization)。
4.1 RNA探针(RNA probe)以3ng/uL浓度溶于HYB，72℃温育5分钟，再冰上放置以破坏形成的可能妨碍杂交的二级结构。
4.2吸去胚胎管中的HYB，加入约含至少300ng 探针的溶液。
实际探针浓度应反复调整至合适。
通常加入体积为200uL，不得少于100uL，否则胚胎难以充分接触溶液。
4.3 65℃温育过夜或大约12小时。
杂交温度一定不得超过72℃，否则探针被破坏。
温度越低，杂交程度越好，但背景可能越深。
这是影响最终结果最重要的决定因素之一。
杂交时间不宜超过太多，否则背景容易过深。
第二天5 去除探针(Probe Removal)。
5.1吸去探针溶液并重新保存于-20℃。
一般而言探针可重复使用十次左右，能重复使用次数取决于探针质量。
使用越频繁，得到的信号越弱。
探针的HYB 溶液中在-80℃下至少可保存一年。
以下步骤不用戴乳胶手套操作。
以下操作步骤仍在65℃进行，注意溶液预热。
5.2甲酰胺(formamide)溶于SSCT的溶液(最终浓度甲酰胺50%，SSCT 2*)洗30分钟，两次。
5.3 2*SSCT洗25分钟。
5.4 0.2*SSCT洗30分钟，两次。
通常在试验时洗涤到此为止，若背景过深可继续一至多步洗涤，如0.1*SSCT65℃或室温洗涤15分钟，再0.05*SSCT 室温洗涤15分钟。
洗涤的目的是洗去残留未特异性结合的探针，留下特异性结合的探针，较高温度(65℃)或较稀浓度SSCT洗涤可洗得更干净，在降低背景同时也容易使杂交上的探针被洗脱，这是影响最终结果的最重要因素之一。
时间要严格控制。
实际需要反复探索适合于不同探针、不同时期胚胎的具体条件和时间。
第一次试验可只到0.2*SSCT洗涤。
从去除探针开始的步骤需要特别保护胚胎，因为胚胎此时非常透明(处于发育较晚期的尤其如此，可能是卵黄较少的缘故)。
吸取溶液时先将管竖直，待胚胎沉到管底后再吸溶液，并注意枪头中有没有吸走胚胎。
以下步骤(6-7)为针对双染的第一步或针对荧光素标记探针Fast Red染色。
若不做此步可直接跳至8。
8 地高辛抗体检测(Anti-Dig Detection)8.1慢摇下用MABT洗5分钟，两次。
8.2慢摇下用阻断溶液(blocking solution，参见现配溶液)阻断一小时。
此步可以在解剖镜下将损坏的胚胎清除。
若为双染，第二次阻断可略去。
8.3加入新用阻断溶液3000倍稀释的地高辛抗体(digitin antibody, anti-dig)，每管至少加入800uL，4℃下摇动过夜。
注意用于稀释抗体的溶液4℃预冷，避免抗体降解。
抗体不一定是单抗，有可能与胚胎中原有的其它抗原结合，导致背景过深。
在对实验结果精度要求较高的情况下，可将抗体与待原位杂交时期的胚胎或胚胎的丙酮保存粉末混合处理(参见现配溶液)，或者加入适当的阻断试剂。
第四天以下步骤最好使用另一摇床或停止加热的杂交炉，从4℃中取出的摇床要等内部凝结的水汽蒸发完后才能再次使用，以保护电路。
第四天同。
9 碱性磷酸酶底物染色(AP Substrate Stain)9.1加入到1%热处理羔羊血清(heat treated lamb serum)的MABT溶液中，室温洗25分钟。
9.2 MABT洗25分钟，三次。
9.3检测缓冲液(Detection Buffer，参见现配溶液)洗5分钟，二次。
胚胎转移到24孔板。
在转移之前可再挑一次损坏的胚胎。
24孔板孔内不能有灰尘，解剖镜下检查并用脱脂棉蘸乙醇擦干净，用检测缓冲液冲洗两次，一般使用一两次即抛弃。
各孔盖上标好探针名。
9.4加入至少300uL AP底物染色缓冲液(参见现配溶液)，室温温育，金属箔片包裹避光。
每30分钟检查一次染色情况。
万一需要过夜不便检查，4℃保存第二天再室温放置并检查。
尽量避免如此以防染色过度。
若染色液变色，说明已光照失效，应适当补充染色液。
温度低可以减缓酶促反应速度，而温度高染色快，但会使背景加深。
9.5当目标着色出现后，用PBS洗5分钟，两次，以停止反应。
此处PBS和杂交前使用的PBS分开，不加吐温以免干扰。
若同一孔中的不同时期胚胎染色情况不一致，可以分开分别终止。
10 照相(Photograph)10.1 4%多聚甲醛PBS溶液固定，保存于4℃。
地高辛探针杂交胚胎长期保存可依次用30%, 50%, 70%MeOH的PBS溶液处理后转移到MeOH中，4℃或-20℃保存；并不时检查更换变色的MeOH。
管的侧面和盖上注明胚胎品系、时期、探针、日期。
MeOH可溶解碱性磷酸酶非特异性着色和部分特异性着色，因此保存的胚胎颜色将逐渐变浅；而Fast Red着色在MeOH中将全部脱落，只能保存于多聚甲醛。
10.2照相前将胚胎用用30%, 50%, 70%甘油的PBS溶液处理后转移到甘油中，照相后再梯度转移回4%多聚甲醛或MeOH中。
不需保留可丢弃。
现配溶液(仅需稀释或混合者略)溶液名后附加的T表示吐温(tween)，用前加入，浓度约为0.1%。
吐温的作用是使胚胎不易粘附在枪头内壁上。
由于吐温量少且较粘稠，吸取的时候要多等一会让其上升至枪头内，加入后在溶液中吹吸几次。
(1)丙酮粉末处理抗体溶液每管800uL抗体溶液：取充分混匀的质量百分比约1%的丙酮鱼粉悬浊液11uL，4000rcf离心2分钟，去除上清。
加入500uLPBT洗涤，4000rcf离心2分钟，去除上清。
离心速度和时间须适当调整，既要保证沉淀上清分离，又要避免沉淀结合过于紧密无法重悬。
加入80uLPBT，震荡成悬浊液。
加入羔羊血清至2%终浓度(1.6uL)。
加入1/300的抗体，即得10*抗体溶液。
使用前用阻断溶液稀释至1*，即1/3000抗体溶液。
(2)阻断溶液(blocking solution)每1mL 10%热处理羔羊血清或100uL血清原液；2mL 10%阻断试剂(blocking reagent)；用MABT补至10mL。
1%热处理羔羊血清的MABT溶液类似，仅不加阻断试剂；可共用同一容器。
两种溶液若剩余均须丢弃，防止血清变质。
(3)检测缓冲液(detection buffer)又称AP缓冲液(AP Buffer)每50mL溶液：100mM NaCl(1mL 5M)；50mM MgCl2(2.5mL 1M)；100mM 三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl(5mL 1M，pH9.5)；0.1% Tween-20；1mM 左旋咪唑(levamisole)(50uL 1M)。
左旋咪唑的作用是抑制胚胎组织内源性碱性磷酸酶，若不加左旋咪唑，可以增强信号，不过同时背景也会增强。
而若最终结果染色过浅，可能是左旋咪唑抑制了抗体结合碱性磷酸酶，应调整浓度。