糖蛋白富集
糖蛋白药物的多糖结构解析进展
糖蛋白药物的多糖结构解析进展刘艳玲;刘晓志;赵伟;王志明【摘要】细胞表达的治疗性单克隆抗体多数是糖蛋白.附着在蛋白质上的多糖直接影响蛋白质药物的稳定性、生物活性及免疫原性.因此,应对糖蛋白产品上的多糖进行充分分析,以控制产品质量.然而,糖蛋白上多糖的复杂性对检测带了艰巨挑战.介绍了糖蛋白上多糖分析的最新进展,以及利用凝集素芯片技术的高通量多糖分析法,重点介绍了用于检测糖基化位点、糖链结构和含量的测定分析方法,以期为糖蛋白药物的研发提供参考.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2016(006)004【总页数】5页(P244-248)【关键词】治疗性糖蛋白药物;多糖分析;凝集素芯片技术【作者】刘艳玲;刘晓志;赵伟;王志明【作者单位】华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015【正文语种】中文细胞表达的生物技术药物多数是糖蛋白，包括单克隆抗体、重组蛋白、融合蛋白、生长因子、细胞因子、酶和激素。
这些药物被用于癌症、自身免疫性疾病及其他危及生命的疾病的治疗。
适度糖基化对药物的溶解性、稳定性、生物活性、安全性、药代动力学和药效动力学等特征具有重要影响。
药物糖基化不但可以增加药物体外稳定性，还可以保护蛋白药物免受体内蛋白酶的降解。
非糖基化促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)较糖基化EPO，更易受到化学物质、pH变化或是加热引起的变性或降解。
蛋白质糖基化可以影响蛋白药物PK/PD特征，研究显示，末端半乳糖部分糖基化蛋白，较末端唾液酸完成糖基化蛋白具有更短的循环寿命。
由于肝细胞表达的唾液酸糖蛋白受体同半乳糖结合，促进了肝脏对部分糖基化蛋白的清除。
蛋白质糖基化分析方法简介
蛋白糖检测
百泰派克生物科技
蛋白糖检测
蛋白糖是指发生了糖基化修饰的蛋白质，也称糖蛋白。
蛋白糖检测主要就是鉴定一个蛋白质是否发生了糖基化修饰。
糖蛋白检测可以通过分离富集糖基化蛋白质的技术来实现，如凝集素亲和技术、肼化学富集法以及凝胶色谱技术等。
凝集素可以专一性识别并结合某一特异性的单糖或寡糖中特定的糖基序列。
含糖蛋白的蛋白质样品或经酶切的聚糖肽可以按照顺序通过多种凝集素亲和色谱柱，从而筛选出不同的聚糖蛋白或聚糖肽，用于后续的检测分析。
肼化学富集法利用高氯酸盐将糖基上的邻二醇氧化成醛，醛基能与固定在树脂上的肼共价结合，经过洗脱程序，富集在树脂上的蛋白质就是发生了糖基化。
凝胶色谱法通过利用凝集素或抗体亲和技术使糖蛋白带上相应标记，再通过色谱柱进行洗脱富集。
色谱法基于其快速、准确、分辨率高且稳定性好等特点，已成为糖蛋白鉴定的理想技术。
百泰派克生物科技基于Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC，提供糖蛋白检测一站式服务，包括蛋白提取、蛋白酶切、糖基化肽段富集、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析，欢迎免费咨询。
正常人肝组织的及肝癌转移相关核心岩藻糖基化蛋白质组学的研究
正常人肝组织及肝癌转移相关核心岩藻糖基化蛋白质组学的研究.;学校代码:学号:织旦大学博士学位论文正常人肝组织及肝癌转移相关核?罐藻糖基化蛋白质组学研究中山医院院系专代智姓名:刘银坤教授指导教师:完成日期:兰鱼鱼生垒旦博卜论文正常人盯组织及肝癌转移相关核一岩藻诂基化蛋白质组学研究正常人肝组织及肝癌转移相关核心岩藻糖基化蛋白质组学研究中文摘要糖蛋白质组学是研究糖蛋白表达谱、糖链组成及其功能的一门有发展前景的新学科。
糖蛋白在细胞识别、粘附、细胞间相互作用等细胞功能中发挥了关键作用。
许多疾病的发生与蛋白质糖链结构异常有关。
至今仍没有一个完整数据库全面阐述正常生理状态下所有糖基化的蛋白质,也未见有系统的糖蛋白质组学手段筛查病理过程相关的异常糖基化蛋白质。
由于一,岩藻糖又称核心岩藻糖普遍存在于很多糖蛋白中,并且其糖基化程度异常与肝癌或慢性肝病的发生和诊断关系密切。
本研究利用扁豆凝集素对糖链内核,岩藻糖的高亲和性及适用于大样本的、高通量糖蛋白质组学共性技术平台,即凝集素亲和层析、双向电泳联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱?~/分析,首次建立了正常人肝脏组织核心岩藻糖基化蛋白数据库。
同时应用和凝集素印迹联合】?/分析,对高低转移潜能不同人肝癌细胞系即高转移的、低转移的和基本不转移的细胞进行研究,获、膜联得了它们的核心岩藻糖基化蛋白质修饰谱,发现膜联蛋白蛋白和细胞角蛋白等异常核心岩藻糖基化状态及差异性表达,分析了此种糖蛋白表达和糖链结构的改变与肝癌细胞系转移潜能的关系。
第一部分正常人肝组织核心岩藻糖基化蛋白质数据库的建立及生物信息学分析本部分研究旨在建立适用于大样本、相对稳定、标准的高通量糖蛋白质组学共性技术平台,并以此为基础,建立正常人肝脏组织核心岩藻糖基化蛋白质数据库,为正常状态下,机体内糖蛋白的全面阐述提供基本生物学信息,为蛋白质核心岩藻糖基化在体内功能研究提供理论依据。
选择不同正常人的肝脏组织例,提取总蛋白通过亲和层析柱后,分成正常人组织及肝确转移相关核心岩藻糖基化蛋白质组学研究博士论文两个组份,柱不结合组分由非核心岩藻糖基化蛋白构成;柱结合组份由核心岩藻糖基化蛋白组成。
基于生物质谱的蛋白质N-糖基化定性与定量新技术
基于生物质谱的蛋白质N-糖基化定性与定量新技术本论文研究内容涉及分析化学、化学生物学等二级学科,属交叉学科研究领域。
主要在生物质谱技术的基础上,发展针对蛋白质N型糖基化修饰定性与定量研究的创新性技术与方法,以准确、高效地揭示蛋白质N-糖基化修饰的多方面信息,包括糖蛋白／糖肽、糖基化位点、糖链等。
糖基化修饰是生命活动中最广泛、最复杂、也是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,不仅影响着蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位,而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。
糖蛋白根据其糖链结构及糖基化位点的不同可分为三大类：N-糖蛋白、O-糖蛋白和GPI锚定蛋白,其中又以N-糖蛋白分布最为广泛。
据推断,有超过50%的蛋白质都发生了糖基化修饰,但是现有数据库中只有约10%的蛋白质被注释为糖蛋白,说明绝大多数糖蛋白尚未被发现。
糖基化研究仍处于起步阶段,缺乏高效的、成熟的技术手段。
在后基因组时代,基于对蛋白质高通量、系统性研究的蛋白质组学迅速兴起。
而以软电离为基础的生物质谱技术为蛋白质组学的快速发展提供了有力工具。
近年来,生物质谱技术同样被应用于糖基化修饰的研究,主要包括糖基化位点的鉴定和糖链结构的解析等方面,而针对糖蛋白/糖链进行大规模研究的糖蛋白质组学和糖组学也随之应运而生。
然而,糖链属非模板合成,其结构极其复杂且呈二维结构,同时糖链离子化效率低、同分异构体多,在质谱分析上仍存在诸多技术瓶颈。
可见,糖基化领域的进一步发展亟待方法学上的新突破。
本论文以生物质谱技术为基础,从定性研究和定量研究两方面,发展了针对蛋白质N-糖基化修饰研究的新技术与新方法,致力于建立高效、实用的糖基化解析策略,解决当今糖蛋白质组学与糖组学所面临的技术难题。
本论文工作的主要贡献如下：(1)成功将糖苷内切酶(Endo)应用于大规模、高通量的N-糖基化位点质谱鉴定,与传统的肽N-糖酰胺酶(PNGase)形成互补,并利用这两种酶切路线,从大鼠肝脏组织中鉴定到大量尚未被发现或证实的N-糖基化位点；(2)首次发现Endo酶促N-糖18O标记反应,并基于此反应发展了酶促糖链还原末端18O标记GREOL技术,有效用于糖链的质谱相对定量,弥补了定量糖组学领域的一项技术空白；(3)通过条件优化,首次实现了PNGase酶促N-糖链的完全18O标记,并基于此反应创新性地发展了酶促18O4标记技术,成功用于糖链、糖肽、非糖肽的一步定量分析,在一次实验中实现了蛋白质N-糖基化的全方位定量解析；(4)发展了硼氢化钠辅助的酶促N-糖链墙18O技术与18O+D双标记技术,不仅大大增加了酶促糖链18O标记的稳定性,更通过双标记使糖链质量差异增加到3Da,大大降低了同位素峰重叠效应的影响。
糖蛋白
复杂型 （complex type）： 这类N-糖链，除五 糖核心外，不含其 他甘露糖残基，但 含有半乳糖、岩藻 糖和唾液酸；
杂合型（hybird type）：此型糖链具 有复杂型和高甘露糖型这两类糖链的结 构元件，即除了高甘露糖型常见的七糖 核心外，也含有半乳糖、岩藻糖等。
•N聚糖修饰通常产生一定程度的修饰异质性， 因而得到的蛋白质并不是一个确定分子，可 能含有一个以上的糖基化位点，可能出现两 种情况： 微观不均一性(microheterogeneity) 即不同蛋白分子在同一糖基化位点上含 有不同的聚糖链。 宏观不均一性(macroheterogeneity) 即同样的糖基化修饰出现在不同的位点。
N-连接糖基化
• N-连接，只发生于真核生物中，糖链合成 起始于内质网，完成于高尔基体。在内质 网形成的糖蛋白具有相似的糖链，进入高 尔基体后，在各种糖基转移酶的作用下发 生了一系列有序的加工和修饰，包括某些 核心糖残基的替换以及聚糖链的降解，使 得糖链的结构和构造发生巨大变化，从而 形成了结构各异的糖链。
8.3 糖蛋白质组学
8.3.1 糖蛋白
• 糖蛋白质组学（glycoproteomics） 糖蛋白质组学是指大规模的分离、富集、 鉴定糖蛋白的研究。
糖蛋白质组学
凝集素亲和层析 免疫亲和色谱 尺寸排阻色谱 亲水亲和方法 +现代质谱技术=糖蛋白高通量鉴定
……
8.3.1 糖蛋白
• 糖蛋白（glycoprotein）是一类复合糖，由长 度较短，带分支的寡糖和多肽链共价连接而 形成。在大多数情况下，糖的含量小于蛋白 质。
• 糖蛋白广泛地存在于动物、植物和某些微生物 中。这些糖蛋白可被分泌、进入体液或作为膜 蛋白，起多种作用。它们包括许多酶、大分子 蛋白质激素、血浆蛋白、全部抗体、补体因子、 血型物质和粘液组分以及许多膜蛋白。
糖基化分析的内容和方法
糖基化分析的内容和方法
糖基化程度的分析过程大致如下：首先是鉴定糖蛋白，即确定糖蛋白的存在；其次是富集糖蛋白，即糖蛋白的分离存化。
糖蛋白的检测大致有以下几种：放射性标记法、分子荧光标记法、电泳法、凝集素标记法、抗体标记法和化学酵素法。
获得糖基化蛋白的方法主要是电泳法和层析法。
电泳法即通过电泳的方法先得到糖蛋白条带或蛋白点，再通过电洗脱或透析的方法得到糖蛋白。
此方法较为费时，且在操作中易使蛋白变性。
而层析法则具有快速、准确、分辨率高、稳定性好等特点，是分析糖蛋白的理想手段。
目前，利用抗体、凝集素进行亲和层析已成为分离存化糖蛋白的主要方法。
糖基化氨基酸位点的鉴定中，Edman降解法冗长，需要高超的实验技巧和较多的蛋白质，且无法处理N－端封闭的蛋白质。
因此，随着质谱技术的发展，此法已不在被广泛使用。
核磁共振技术也可用于糖基化氨基酸位点的鉴定。
这种方法可在液态溶液中直接进行蛋白质结构测定。
糖链结构的鉴定也采用质谱技术、毛细管电泳技术、气相色谱技术及凝集素亲和技术。
糖蛋白检测
百泰派克生物科技
糖蛋白检测
糖蛋白是蛋白质糖基化修饰作用后产生的一种蛋白质类型，生物体内约50%的蛋白质以糖蛋白的形式发挥其生物学功能。
通过糖蛋白检测可对蛋白质糖基化修饰过程进行研究，糖蛋白检测包括糖基化修饰的定性定量分析、糖基化修饰位点分析等。
一般可使用液相色谱质谱联用（LC-MS）或亲水作用色谱串联质谱（HILIC-MS/MS）技术对特定修饰的糖蛋白进行检测，包括特定修饰糖蛋白的鉴定、糖基化结合位点鉴定等内容。
糖蛋白检测思路：在进行糖蛋白检测之前，需要对经过特定修饰的糖蛋白样本进行富集；之后进行内切酶裂解（如胰蛋白酶消化）得到小片段糖肽，得到的糖肽利用LC-MS或HILIC-MS/MS检测，根据质谱检测结果分析糖肽序列，即可鉴定得出带有特定糖链的所有糖蛋白，结合生物信息学可分析特定修饰糖蛋白糖基化修饰位点。
百泰派克生物科技采用LC-MS和HILIC-MS/MS等高分辨质谱系统提供糖蛋白分析服务，该服务可用于鉴定血浆/血清、细胞、组织或生物体中的全部糖蛋白，并使用质谱系统进行定性和定量分析。
您只需将实验目的告知并将样品寄出，我们将负责项目后续所有事宜，包括蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析。
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Zhang等先利用肼腙反应富集糖蛋白，再将富集的蛋白质酶解并用PNGase去除糖链，然后在去除糖链后的糖肽的N末端引入轻（H4）和重（D4）同位素标记的琥珀酸酐，
再通过比较被标记肽的同位素峰的强度差异则可得到糖肽的相对量的变化。
他们用标
准蛋白质及人血清样品对该方法进行评价。
糖基化位点的确认仅通过糖肽经 PNGase F 脱去糖链时天冬酰胺残基转变为天冬氨酸时增加0.98 Da 的差异来判断，并不够准确。
Zhang H, Li XJ, Martin DB, et al. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotech, 2003, 21(6): 660-6
除了上述的肼腙反应选择性富集糖蛋白质，还可利用凝集素能够专一识别某一特殊结
构的单糖或聚糖中特定的糖基序列的特点使用凝集素柱对糖蛋白质进行富集。
如 Qiu
和 Regnier[11-12]利用接骨木凝集素 (Sambucus nigra agglutinin, SNA) 选择性富集含唾液酸的糖肽。
Goo 等用类似的非标记定量方法比较了人正常前列腺细胞和人膀胱基质细胞的糖
蛋白质组，先对细胞中的糖蛋白质用肼腙反应富集，PNGase F 酶处理脱去糖链后进行LC-MS/MS 分析，根据肽离子流峰面积(peptide ion current area, PICA) 对蛋白质进行
定量。
结果分别从正常前列腺细胞和膀胱基质细胞中鉴定到 116 和 84 个糖基化蛋白质，其中组织蛋白酶 Cathepsin L 等在膀胱基质细胞中上调。
这类现有的非标记定量
方法的主要缺点均在于难以对糖基化程度进行定量以及没有对糖基化位点进行更准确
的确认。
Identification of secreted glycoproteins of human prostate and bladder stroma by comparative quantitative proteomics. Prostate, 2009
糖蛋白是蛋白质与糖类以共价键相连形成的复合物。
目前已知糖链与蛋白质主要有两
种连接方式: ( 1) N型连接 (如图 1A所示 ) , 一般由六到数十个糖基组成糖链, N 乙酰
葡萄糖胺 ( G lcNAc)还原端与蛋白质中天冬酰胺的酰胺氮以1 , 4糖苷键相连,能被 N
糖基化的天冬酰胺必须存在于 N XS /T /C特征序列中,其中 X为除脯氨酸外的任何氨基酸。
N型糖链内侧通常含有一个五糖核心, 即 G lcNAc2M an3。
根据核心外连接单糖
的组成可以将其分为高甘露糖型、杂合型和复杂型糖链。
N型糖蛋白主要存在于血浆
蛋白和分泌蛋白等, 又称为血浆型糖蛋白; ( 2) O型连接 (图 1B糖基或糖链的还原端与蛋白质肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸残基中的羟基氧原子相连,糖链无固定结构及核心,在黏液,免疫球蛋白等中广泛存在。
Protein Glycosylation and Diseases: Blood and Urinary Oligosaccharides as Markers
for Diagnosis and Therapeutic Monitoring；Protein C-mannosylation: Facts and questions.这两篇文章
Zhang等利用化学反应固向捕获法富集糖蛋白。
主要原理: 糖蛋白的氧化和偶联。
高
碘酸氧化能够使糖链上的顺式二元醇转化为醛基和固向支持物上的酰肼基团进行反应
形成共价的腙键 (图)。
这样非糖基化的蛋白就可以被去除从而富集糖蛋白。
利用胰酶
进行蛋白酶切后, 只留有糖肽在支持物上来富集糖肽。
技术优点: 能够一次性富集两种类型的糖蛋白, 反应效率高。
缺点: 属于多步骤化学反应, 操作繁复, 条件不易控制。