转化摇菌提质粒
(完整word版)质粒转化流程
质粒转化流程：（以下操作如无特别说明均在超净台中操作）
1.取一管感受态细胞，待感受态细胞在冰上融化后，取1μl质粒DNA或20μl连接产物与
之混合(质粒DNA的用量不超过50ng)，冰浴30min。
2.42℃水浴90s。
3.冰浴5min。
4.加入800μｌ不含抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床培养45min。
5.5000rpm离心3min，吸去800μl上清。
6.将剩余200ul菌液重悬，加入倒有含抗生素的LB固体培养基平板上，用涂布棒涂均匀。
7.正置数分钟，待菌液稍干，放入37℃培养箱中倒置培养，12-16个小时后可观察到菌落
形成。
8.第二天上午挑取单菌落于1ml含有抗生素的LB液体培养基中37℃摇菌。
9.晚上将摇起来的菌株每管加入500ul 50%无菌甘油，于-70℃中冻存。
注：可做一组阴性对照，即用无菌水取代质粒，与感受态细胞混合，其余操作相同，平板
上应无法长出菌落。
连接产物的转化应设一组用线性化载体的阴性对照和空载体的阳性对
照。
质粒提取摇菌的详细步骤
质粒提取摇菌的详细步骤质粒提取摇菌啊，这可是分子生物学实验里相当常见又重要的事儿呢。
咱先来说说这摇菌吧。
你得先有含有你要提取质粒的菌液才行。
这菌就像一个个小小的工人，在液体里忙活着呢。
你得从甘油保存的菌种里挑一点儿出来，就像从宝藏库里取一颗小珍珠一样。
这菌种啊，要小心地用接种环挑取，可别贪多，一点点就够啦。
然后把这挑取的菌种放到装有新鲜培养基的试管或者锥形瓶里。
这培养基就像是菌的食物，得给它们准备得妥妥当当的。
那这个装菌液的容器啊，可不能随随便便就扔到摇床上去晃悠。
要把它密封好，要是没密封好，菌液漏出来不说，还可能会混进去一些杂菌呢，那可就像一场不速之客闯进了一场精心准备的聚会，全乱套了。
把密封好的容器放到摇床里，这摇床的转速和温度可都是有讲究的。
转速就像风的强度，要是太快了，菌可能会被晃晕乎了，要是太慢了，菌又觉得不得劲儿，不好好生长。
一般来说，200 - 300转每分钟就挺合适的。
温度呢，就像菌的被窝温度，大多数菌在37摄氏度的时候长得最欢实，就像人在最舒适的温度下最惬意一样。
等菌在摇床里晃悠了一段时间后，你就能看到菌液变得浑浊啦，这时候菌就繁殖得差不多了。
这浑浊的菌液就像一杯加了很多料的果汁，满满当当的都是菌。
接下来就是提取质粒喽。
把摇好的菌液收集起来，这时候的菌液就像是充满宝藏的湖水，质粒就是湖水里珍贵的珍珠。
先把菌液离心一下，这就像是一场筛选比赛，通过离心力把菌都聚集到管子底部，就像把乱跑的小动物都赶到一个角落里一样。
离心完了之后，把上清液倒掉，可别倒得太猛，要是把菌也倒掉了，那就像把宝贝和水一起倒掉了，多可惜啊。
然后往菌沉淀里加入溶液，这溶液就像神奇的魔法药水，能把菌的细胞壁打破，让里面的东西都释放出来。
加完溶液后，要好好地把菌沉淀和溶液混合均匀，就像搅拌面粉和水做面糊一样，得让每一处都混合到。
再进行一次离心，这次离心就像二次筛选，把一些杂质去掉。
接着取上清液，再加入新的试剂，这试剂能让质粒乖乖地和其他物质分开。
质粒提取
质粒提取
挑单克隆摇菌过夜，菌液1ml 10000转x 1min 离心2次得沉淀，去尽上清。
1：加solutionⅠ100μl充分混匀。
同时加RNAase
2：加solutionⅡ200μl混匀，静置2—5分钟，至溶液透明
3：加solutionⅢ150μl混匀，出现白色絮状物
4：离心10000转x 10min
5：取上清+0.7倍体积的异丙醇混匀，常温静置15min
6：离心10000转x 10min，弃上清
7：75%乙醇洗沉淀2次，每次10000转x 5min，风干15min
8：加30μl TE/H2O。
粗提质粒可用酶切鉴定，不适于回收片断作克隆
大提质粒菌液体积增加，solutionⅠ、solutionⅡ、solutionⅢ体积也相应成比例增加，小提一般不需要酚抽提，大提质粒一般需要RNase消化和纯化，纯化即酚抽提，具体步骤如下：1：等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提2次
2：添加1/10体积的3M NaOAc
3: 添加2.5倍体积冷乙醇，在-20°C保冷30-60min
4：离心分离回收沉淀，用4倍量70%冷乙醇洗，干燥吹干
5：用适量（1/100—1/30体积）的TE/H2O溶解沉淀。
质粒提取步骤protcol
质粒提取步骤（去除内毒素的kit）准备：挑取单克隆后摇菌12-16小时‘异丙醇，无水乙醇，1.5毫升无酶EP管，无菌去离子水，涡旋在SOLUTION 1中加入RNASE A 保存在4度冰箱DNA W ASH buffer中加入无水乙醇，室温保存HBC Buffer 中加入异丙醇，室温保存检查SOLUTION 2是否沉淀，若有沉淀，加热到37度溶解N3缓冲液放在冰上热块加热到42 度，或者水浴锅，还有一个，加热到70度离心机转速5000XG微凉离心机13000XG步骤：1、摇菌2、收集菌液，5000XG，室温离心，10min3、弃掉上层培养基4、加入500ul SOLUTION 1/RNASE A ，涡旋或者抽吸，彻底混匀。
重悬完全能获得好的结果5、转移细胞到新的2ml离心管中6、加入500ul SOLUTION 2，涡旋或轻柔旋转数次，获得澄清裂解液，孵育2-3min，注意避免用力混合，否则会剪切染色体DNA，降低质粒纯度，不要让裂解液反应超过5min，SOLUTION 2要盖紧，防止空气中的CO2导致其酸化7、加入250ul冰浴预冷的N3 Buffer，轻柔颠倒数次，直到形成白色絮状沉淀（除蛋白）Buffer必须充分混合，如果混合液是粘的，棕色的，成团的，需要更多次混合完全中和SOLUTION。
完全中和绝对影响结果。
8、最大转速（大于13000XG），离心10min,形成白色沉淀，迅速进行下一步9、将清澈的裂解有转移到1.5ml EP管，量取清澈的裂解液的体积10、加入1/10的ETR溶液，此时会浑浊，颠倒EP管10次，彻底混匀如果转移500ul清澈裂解液，就加入50ulETR溶液11、冰上孵育10min,在孵育过程中，颠倒混匀数次，冰上裂解后悔澄清，2min/次12、裂解液42度孵育5min,裂解液又会出现浑浊13、25℃12000XG，离心3min,,ETR溶液在管底部14、将上层水相转移到一个新的1.5ml EP管中，加入1/2体积无水乙醇，轻柔颠倒6-7次，室温培养1-2min15、将小柱加入2ml管中，注意：选择性步骤：小柱是否处理16、将700ul混合液加入小柱中17、最大转速（大于13000XG），离心1min,18、弃去滤液，重新放回19、重复16-18，所有的东西都保存在柱里20、加入500ul HBC Buffer 注意加入异丙醇21、最大转速（大于13000XG），离心1min,22、弃去滤液，重新放回23、加入700ul DNA wash buffer 注意加入无水乙醇24、最大转速（大于13000XG），离心1min,25、弃去滤液，重新放回26、重复步骤23-25，27、最大转速空载离心2min,使管干燥，残余乙醇有干扰28、将滤柱放于1.5ml EP管中29、加入80ul洗脱缓冲液或者无酶水，直接加到中间，主要看穿着和穿着的悬液。
质粒提取常见问题解析
质粒提取常见问题解析质粒, 解析本帖引用网址：/thread-29246-1-1.html涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。
蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。
建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。
同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。
解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。
只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。
而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。
对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。
】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
质粒扩增、提取、转化和转染
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序60质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB 培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
实验五 转化后细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查
实验五转化后细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查一般情况下，可以根据质粒的大小来确定它是否带有插入片段。
以下方法足以产生在琼脂糖凝胶的单个泳道上加样所需的DNA量。
操作方法如下：1. 使转化得到的细菌在含有氨卞青霉素的琼脂培养基(LB)上生长至菌落直径达1mm左右。
2. 用灭菌的牙签挑取单菌落的一小部分，在含氨卞青霉素的LB琼脂平板上划线。
至少挑选20个左右的菌落照此划线，平板于37℃培养过夜，然后保存于4℃，直到相应菌落的回收。
3. 在划线培养的同时，将每一菌落的剩余部分用牙签一一转移并洗脱到事先加有50mL 灭菌的10mmo1／L EDTA(pH8.0)的1.5mL离心管中。
4. 每管加50mL配制的0.2mo1／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液，振荡30秒。
5. 于70℃温育5分钟，然后冷却到室温。
6. 加3mL 2mol／L KCl、0.2％溴酚蓝的溶液，振荡30秒。
7. 冰浴5分钟。
8. 用微量离心机于4℃以12000g离心3分钟，使细菌碎片的沉淀。
9. 制备1％的琼脂糖凝胶(5mm厚)，将50mL上清液加入样品槽内(5×2.5mm，长×宽)。
10. 染料迁移到凝胶全长的2／3—3／4时，于室温将凝胶放入溴化乙锭溶液(0.5ug／mL水溶液)中，浸泡20—30分钟。
11. 紫外灯下观察、拍照。
通过与同时点样的载体质粒的比较，不难发现重组子：比载体质粒迁移慢的很可能是含有插入片段的重组DNA。
可从保存于4℃的重新划线的平板上挑出相应的菌落，接种于2mL含抗菌素的LB培养液中培养过夜，然后提取质粒，用做重组时相同的限制酶做酶切鉴定。
重组子应该可以切下预期大小的插入片段。
提取质粒的方法
提取质粒的方法提取质粒是分子生物学实验中的常见步骤之一，其目的是将细菌中的质粒分离出来，以进行后续的实验操作。
提取质粒有多种方法，本文将介绍其中的几种常用方法及其优缺点。
一、CACl2热激转化法CACl2热激转化法是经典的提取质粒方法之一。
其过程如下：1. 将含有目的质粒的细菌培养物进行扩增，使细菌数达到一定程度。
2. 离心将细菌沉淀下来，将培养液中的菌落去除。
3. 用无菌水洗涤细菌沉淀，用CACl2溶液缓慢重悬细菌，使CACl2浓度达到0.1M。
4. 加入pH 6.5的冷缓冲液，浸泡在冰上15分钟。
5. 在热水浴中40-45℃，热激转化。
6. 加入含有抗生素的琼脂糖平板上进行筛选。
该方法的优点是操作简单，不需要特殊设备，且质粒提取量较大。
但其缺点也显而易见，即有毒化学物质CACl2使用，对质粒构建的影响较大，在序列克隆等需要高质量的质粒时不适用。
二、碱裂解法碱裂解法是一种有效的质粒提取方法，是利用质粒DNA与蛋白质的不同耐碱性，将质粒分离出来的方法。
其操作流程如下：1. 将细菌沉淀用含50mM Tris-HCl（pH 8.0）的盐水洗涤。
2. 加入含50mM Tris-HCl（pH 8.0）、25mM EDTA和1%SDS的Lysis Buffer（血浆蛋白）溶液，充分振荡混合，放在65℃水浴中加热，使细胞破裂并释放DNA和蛋白质。
3. 加入冷异丙醇，低温离心，使DNA和蛋白质分开。
注意此步骤中异丙醇的体积比例对DNA的提取量有较大影响，需根据实验需要酌情设置。
4. 倒出上清液，将沉淀用50%异丙醇洗涤。
5. 将洗涤后的沉淀用无菌水重悬，进行后续实验操作。
碱裂解法优点较多，其操作简单、快捷，可以得到较纯的质粒DNA，适用于后续实验需要高质量的DNA。
三、亲水性亲油性法亲水性亲油性法又称酚-氯仿法，其原理是利用亲油性有机溶剂和亲水性酚盐在酚-氯仿-异丙醇三相体系中分离质粒和其它细胞成分。
其操作流程如下：1. 培养含有质粒的细菌，并进行扩增。
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转化摇菌提质粒
SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
一、感受态细胞XL-1转化实验
（1）5ng DNA+100μl感受态细胞XL-1于离心管中,混匀，冰浴30min。
（2）42o C, 45s。
（3）冰浴2min。
（4）涂布于固体LB平板上(含50mg/ml 氨苄青霉素, 37 o C预热)。
（5）放入37 o C恒温孵育箱，待液体吸收完全后，倒置孵育16-18h。
（6）保鲜袋密封后，倒置放于4o C冰箱保存。
二、菌液的培养与质粒的提取
1.每个样本挑取5个细菌，进行摇菌，提取质粒。
（一个细菌一支管）
在50ml离心管里加入5ml液体LB和5μl 50mg/ml氨苄青霉素，用200μl枪头挑取过夜培养LB平板上的单克隆，枪头打入离心管中，置于37o C摇床，250r/min培养16～18h，质粒提取。
（老师，这里要先挑取一个细菌进行摇菌后再分成五支离心管重新摇菌，还是直接挑取5个菌落直接摇菌）
质粒提取(采用天根质粒小量多次提取试剂盒提取，步骤如下)：
（1）吸附柱中加入500μl平衡液BL，13000rpm离心1min。
倒掉收集管中废液，吸附柱放回收集管，备用。
（2）收集5ml菌液，13000rpm/min, 离心10min，收集沉淀。
（3）加入500μl溶液P1(含RNase A), 使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
（4）加入500μl溶液P2, 温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解。
（5）加入700μl溶液P3, 立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色沉淀。
（6） 13000rpm/min离心10min，收集上清分次加入过滤柱中(800μl/次)。
（7） 13000rpm离心2min后将上一步得到的滤液分次加入吸附柱中(800μl)。
（8） 13000rpm离心1min，弃掉滤液。
（9）加入500μl去蛋白液PD, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。
（10）加入600μl漂洗液PW, 静置5min, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。
（11）重复步骤10。
（12）13000rpm/min离心2min，彻底去除柱子中残留废液。
（13）将DNA吸附柱放入新的离心管，悬空滴加100μl无菌双蒸水，静置5min。
13000rpm/min离心1min，所得到的液体即为高纯度的DNA溶液，置于-20o C保存。
七．定点突变的鉴定
质粒提取后用限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.1.6亚克隆
对成功突变的突变体和质粒载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒步骤回收载体和目的片段，用T4连接酶进行目的片段和表达载体的连接，产物转化细菌感受态细胞，挑取阳性克隆，按照质粒试剂盒说明书提取质粒，用限制性内切酶进行酶切鉴定，送质粒进行测序鉴定。