革兰氏染色液使用说明
革兰氏染色的关键步骤
革兰氏染色的关键步骤
革兰氏染色是一种常用于细菌诊断和鉴定的染色方法。
革兰氏染色(Gram's staining)是1884年由Hans Christian Gram发明的一种染色技术，它实现了细菌的初步分类，帮助识别细菌类型以及培养媒介中细菌的存在。
革兰氏染色可将细菌分为两大类：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，它们的染色特征不同，
由此可以比较出被染色的细菌的形态。
革兰氏染色的关键步骤包括：
1. 从培养液或培养基中获取样本，采用玻片或薄层染色，将涂有细菌的玻片放入热水浴
管中，然后用湿拭的纱布将热水浴管罩住，使玻片與浴液形成密封，然后在76~87℃的恒
温水浴中，持续加热、搅拌和蒸汽保温蒸汽毛，将湿拭蒸汽毛玻片水分蒸发，让固有菌滴
凝结成膜，凝结后将其拿出热水浴，放置冷凝室，冷凝至室温。
2. 用碘酒至少涂抹玻片两次，每次熄灭火焰，一次空气浸泡1~2分钟，一次水浸泡1~2
分钟。
3. 采用革兰氏染色液，将染色液倒入密封干净的染色管中，然后加热，使其升温至50度，保持恒温约15~20分钟，然后把玻片浸入其中，放在恒温器中调整温度至25度，充份搅拌，浸泡2~4分钟。
4. 将玻片拿出，用蒸气浸泡一次然后用水冲洗，最后待玻片干燥后即可观察细菌的形态，对比染色后的过程，以判断是Gram阳性菌还是Gram阴性菌。
革兰氏染色是一种初步筛查细菌感染的实验技术，其步骤很简单，无需昂贵的设备。
有效
的实施革兰氏染色，可以帮助诊断师在细菌病诊断中获得更好的结果。
革兰氏染色操作规程 20b
结果： •革兰阳性菌呈紫色
•革兰阴性菌呈红色
图示
• 革兰阳性菌
图示
• 革兰阴性菌
•第四液：稀释石炭酸复红液（同单染法） 或沙 黄溶液（2．5 ％沙黄乙醇液10 ml 加水90 ml）。
ห้องสมุดไป่ตู้
方法：
•将第一液滴加在已固定的细菌涂片上，染1 分 钟，水洗。 •再以第二液媒染1 分钟，水洗。 • 继以第三液脱色。轻摇玻片，到无紫色脱落为 止，水洗。 •最后以第四液复染0．5 分钟，水洗，干后镜检。
检验基地住培技能培训 ----操作训练教材
革兰氏染色 操作规程
染液：
•第一液：取结晶紫乙醇饱和液（乙醇100 ml 含 结晶紫7 ～14g）20 ml 与1 ％草酸铵水溶液 80 ml 混合过滤即成。
•第二液：碘1g ，碘化钾2g ，加少量蒸馏水， 充分振摇，溶解后加水至300 ml 。
•第三液：95 ％ 乙醇或用乙醇、丙酮（7 ∶3） 混合液。
PH1237 标准革兰氏染色液实验与操作方法
PH1237|标准革兰氏染色液Standard Gramˊs StainCatalog No：PH1237Size：☐4×100mL|☐4×250mL Store at RT简介革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。
未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。
通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。
细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。
经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。
在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。
红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。
在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。
Standard Gramˊs Stain采用最经典的革兰染色配方,临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。
组份名称4×100ml4×250ml Storage试剂(A):结晶紫染色液100ml250ml RT避光试剂(B):Gram碘液100ml250ml RT避光试剂(C):脱色液100ml250ml RT试剂(D):沙黄染色液100ml250ml RT避光自备材料1、接种环或挑取细菌的其他工具2、酒精灯3、载玻片4、光学显微镜操作步骤(仅供参考)：1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，混合均匀，涂成一薄层。
革兰氏染色法操作规程
革兰氏染色法操作规程革兰氏染色法操作规程1目的建立革兰氏染色法操作规程，确保革兰氏染色法操作规范化、科学化。
2范围适用于用革兰氏染色法对细菌进行分类和鉴定。
3职责3.1检验员：负责按本规程进行革兰氏染色操作。
3.2 QC主管、质量部经理：负责监督。
4内容4.1仪器与用具酒精灯、洁净的盖玻片、接种环、滴管、生物显微镜。
4.2材料4.2.1试剂结晶紫、番红、碘化钾、碘、95%乙醇、草酸铵、香柏油。
4.2.2试液及配制方法4.2.2.1 结晶紫染色液：称取结晶紫2g，溶于20ml 95%乙醇中；称取草酸铵0.8g，溶于80ml水中；将两种溶液混合，静置48h后使用。
4.2.2.2碘染色液：称取碘化钾2g，加5～10ml水使充分溶解，加碘1g，待完全溶解后，加水至300ml。
4.2.2.3 番红复染液：称取番红0.25g溶于10ml 95%乙醇中，然后加水100ml。
4.3操作步骤4.3.1 样品固片取一干净的载玻片，用接种环挑取一环无菌水于载玻片中，挑取少量菌于生理盐水中涂片或直接滴一滴待检菌在盖玻片中央，自然干燥固定。
4.3.2 初染滴加结晶紫染液于已固定的涂片上，染1min，用水冲洗、甩干。
4.3.3 媒染滴加碘染色液，液作用1min，用水冲洗、甩干。
4.3.4 脱色滴加95%乙醇脱色，置白色背景下，侧动盖玻片，直至无紫色脱落为止（约为20-30秒），立即用水冲洗、甩干。
4.3.5 复染滴加番红复染液，染1-2 min，用水冲洗、甩干。
4.3.6 镜检置油镜下观察。
先用低倍镜找准目标，于涂有样品处滴加香柏油一滴，用油镜观察。
4.3.7 结果判定革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常呈假阳性。
4.4 注意事项4.4.1 待检菌菌龄应为18～24h。
一般情况下，革兰氏阴性菌的染色反应较稳定，不易受菌龄长短影响；而革兰氏阳性菌，有的在幼龄时呈阳性，超过24h可变为阴性。
革兰氏染色说明
革兰氏染色【操作步骤】1、操作前准备：戴口罩、帽子、手套，穿工作服，准备并清点本试验所需器材。
2、制作涂片：细菌涂片的制作包括涂片、干燥、固定3个步骤。
(1)涂片：取洁净载玻片1张，用铅笔标记，并在玻片正中间位置滴加一滴生理盐水。
用灭菌环挑取菌落少许，均匀涂布于生理盐水中，并研磨成直径1~1.5cm的菌膜。
若取菌悬液标本涂片，则不需加生理盐水，直接用灭菌的接种环取菌液1~2环，直接均匀涂抹成菌膜。
(2)干燥：涂片最好置室温下自然干燥，也可将菌膜面向上，在酒精灯火焰上方约10cm处的热空气中微微加热烘干。
(3)固定：用手或玻片夹夹住载玻片一端，干燥的涂片面朝上，在酒精灯火焰的外焰上尽快对来回通过2~3次，以玻片反面接触皮肤热而不烫手为宜。
3.染色（1）初染：在制好的涂片上滴加结晶紫染液数滴（以刚好覆盖菌膜为宜），染色一分钟，倾斜载玻片，水洗。
甩去积水。
（2）媒染：滴加卢戈碘液数滴，染色1分钟，倾斜载玻片。
水洗，甩去积水。
（3）脱色：滴加95％乙醇数滴，轻轻摇动载玻片，使其脱色。
需10~30s 至无紫色脱出为准。
（4）复染：滴加稀释复红染液数滴，复染0.5min。
倾斜载玻片，水洗，甩去积水。
用滤纸吸干或者自然干燥。
4、油镜检查：待标本涂片自然干燥或用吸水纸吸干后，在菌膜上滴加香柏油，置油镜下检查。
表皮葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性菌，呈葡萄球状排列；大肠埃希菌染成红色，为革兰阴性菌，呈散在的杆状。
5、其他：操作后正确处理医疗垃圾，实验器材归回原位。
【注意事项】1、整个操作过程须注意无菌操作。
2、因不同菌龄的细菌，革兰染色的结果也有差异，故一般以18~24h的培养物染色效果最好。
3、涂片若太厚或太薄，固定时菌体过分受热及脱色时间长短，都会影响染色结果，要严格按要求操作。
4、涂片最好在室温下自然干燥，若置酒精灯上微加热烘干时，切勿靠火焰太近，以免标本烤枯变形。
5、染色时，染液以覆盖标本为宜，不宜过多。
6、染色各环节均要严格掌握好时间，尤其是乙醇脱色环节，应根据菌膜厚度、室温等因素掌握适当时间，否则会影响染色结果。
革兰氏染色操作规程
革兰氏染色法操作规程预期用途：主要用于细菌标本涂片或菌落涂片的染色。
检验原理：革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。
细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。
为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。
阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。
有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。
现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。
另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。
所以染色时的条件要严格控制。
例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。
此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。
所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。
试剂盒组成：试剂盒组成4*100mlR1：结晶紫染液100mlR2：革兰氏碘液100mlR3：盐酸酒精脱色100mlR4:复染液100ml贮存及效期：10℃─30℃贮存，有效期三年。
操作步骤：1）做一薄涂片，干燥后火焰固定。
2）滴加1液，夏天染1分钟，冬天染2分钟，清水冲去染液。
3）滴加2液，作用1—2分钟。
流水洗，并倒掉多余的水分。
4）加3液脱色，不时摇动（约左右摇动10—15次），至无紫色脱落为止，流水冲洗。
5）加4液复燃，10秒内流水冲洗。
革兰氏染色液试剂盒使用说明
革兰氏染色液试剂盒使用说明
“革兰氏染色液”试剂盒使用说明（规格一、二）
一、用途：
本试剂盒用于各类标本的细菌染色。
二、试剂盒组成：
１、结晶紫染色液（Ⅰ液）：1×100ml；（规格一）；1×250ml（规格二）
2、革兰氏碘液（Ⅱ液）：1×100ml；（规格一）；1×250ml（规格二）
3、95％酒精液（Ⅲ液）：1×100ml；（规格一）；1×250ml（规格二）
4、沙黄染色液（Ⅳ液））：1×100ml；（规格一）；1×250ml（规格二）
三、染色方法：
1、将Ⅰ液滴加在已固定的涂片上，染1分钟，用蒸馏水洗去剩余染料。
2、滴加Ⅱ液,1分钟后用蒸馏水洗去剩余染料。
3、滴加Ⅲ液脱色，夏季30秒，冬季1分钟，水洗。
4、滴加Ⅳ液，复染1分钟，用蒸馏水洗去剩余染料，待干后镜检。
四、结果：
革兰氏阳性细菌：蓝色。
革兰氏阴性细菌：红色。
五、贮存、有效期：
本试剂盒应置2℃－25℃、相对湿度40－75%、避光环境保存，有效期一年。
革兰氏染色标准操作规程
革兰氏染色标准操作规程1、目的
确保染色结果清晰可靠。
2、范围
球菌、杆菌和弧菌染色
3、职责
临床微生物实验室当班工作人员认真按程序文件操作。
5、试剂
5.1结晶紫溶液
A液：结晶紫2g
95%乙醇20ml
Β液：草酸铵0.8g
蒸馏水80ml
使用前24小时将A液Β液混合后，过虑后装入试剂瓶内备用。
5.2碘液
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300ml
5.3脱色液：95%乙醇
5.4复染液
储存液：沙黄2.5g
95%乙醇100ml
应用液：储存液10ml
蒸馏水90ml
6、工作程序
6.1待检标本用无菌生理盐水涂片，经自然干燥后用火焰固定。
6.2加结晶紫液染1分钟，清水冲去染液。
6.3加碘液染1分钟，清水冲去染液。
6.4加95%乙醇脱色液，不时摇动约10-30秒钟，至紫色已脱落为至，水冲洗。
6.5加复染液（伊红），染30秒钟，水冲洗。
6.6待涂片自然干燥后，油镜镜检。
7、质量控制
金黄色葡萄球菌为革兰氏染色阳性,大肠埃希菌为革兰氏染色阴性。
8.参考文献
中国人民共和国卫生部医政司编.《全国临床检验操作规程》（第三版）.2006, 第六篇P725。
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革兰氏染色液使用说明
货号：G1060
规格：10ml/100ml
保存：阴凉处保存，保质期1年。
产品内容:
结晶紫；碘液；95%酒精；蕃红。
产品简介：
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌细胞壁较厚，肽聚糖网层次较多且交联致密，乙醇脱色时，肽聚糖脱水使孔径缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。
革兰氏阴性菌细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，脱色后类脂外膜迅速溶解，缝隙加大，结晶紫与碘复合物溶出，因此乙醇脱色后再经番红复染，呈红色。
操作步骤：
1.涂片固定
菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。
固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色
一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。
（2）加上碘液后染色1分钟，水洗。
（3）加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约20-60秒，水洗，吸去水分。
（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。
（5）吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌
可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄
也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌体自行溶解，
都常呈阴性反应。
3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以均匀分散
开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈现假阳性。
注意事项：
1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。
若涂片较厚，应延长脱色
时间，直至不再出现紫色为止。
2．玻片通过火焰温度不能太高。
3．碘液变透明，则不能使用。
4．水洗时动作要轻柔,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。