应用AccQ柱前衍生高效液相色谱法检测黑大麦中的游离氨基酸

异 亮氨 酸 （ ）亮氨 酸 （ ｅ）苯丙氨 酸 （ ｈ ）含 量 依次 为 ２‘ ．３ 、 ． Ｈｅ、 Ｌｕ、 Ｐ ｅ， ． ３±０ ０ １３ ６±００ ４２ ５±０ ０６ ２ ． ．６ 、 ． ．３ 、２ ７ ±０ １８２ ． ±０ ２ １５ ． ±０７９ １ ． ±０ ０ １８ １ ．６ 、４ ． ±８０２ｂ ｌｇ各氨基酸含量差 ．５ 、２ ２ ．９ 、７０ ．３ 、 １１ ．５ 、 ． ±００ ７３ ７６ ．５ ｔ ／ ， ｍｏ
［ 收稿 日期］２ １ —０ ０ １ ７—１ ０
［ 基金项 目】 校地合作项 目（Ｂ Ｘ ＭＶ－ ０８ Ｂ 一 ４ ２０ 一 Ｃ ２ ） ［ 作者简介 】 申晓蓉 （９０ ， ， １６ 一）女 陕西米脂县人， 实验师
（＊： 通讯作者）
一
６ — ５
脱气 ３ ｎ ０ｍｉ．
１３ ２ 流动 相 Ｂ液 ．．
、
’
根据图 ２ 所测结果， 将样品峰保留时间与混合液标准曲线中 各氨基酸的 保留时 伺相对应， 并带入回 归方程进行计算， 确定样品中 所含游离氨基酸种类及含量， 其分析结果如表 ３ 所示 ．
ｔ ’
衰 ３ 样品中 擘 漕禽氨基酸种类及禽曩
由表 ３可知， Ａ Ｃ反应衍生后， 经 Ｑ 用高效液相色谱法分析黑大麦纯化样 品， 共检 出 ９种游离氨基 酸， 分别为天冬氨酸（ ｓ） Ａ ｐ 、组氨酸 （ ｓ、苏氨酸 （ ｈ）丙氨酸 （ ｌ 、 Ｈｉ ） Ｔ ｒ、 Ａａ 蛋氨酸（ ｔ、 ） Ｍｅ）赖氨酸（ ｙ） Ｌ ｓ、
［ 摘
要 】采用 Ａ ｅ ｅＱ柱 前衍 生高效液相 色谱法， ６氨基喳啉． 羟基琥 珀酰亚 胺基． 以 ． Ｎ． 氮基 甲酸酯（ Ｃ 为衍生试 ＡＱ ）
剂， 分离并检 测 了黑大 麦样品 中游 离氨基酸种 类及 其含量 ． 结果表 明： 在检 测 出的 ９中游 离氨基酸 中， 天冬 氨酸含 量最
第 ３ 总第 ８ ２卷 ３期
２ ０１ 年 ９ 月 １
西 北 民 族 大 学 学 报（ 自然科 学版）
Ｖｏ．２． ． １３ Ｎｏ ３
Ｊｕｎｌ ｆ ｏ ｈ ｅ ｎ ｅ ｉ ｒ ａｏａｔｓＮａｕａ Ｓｉ ｃ） ｏｒａｏ ｒ ｗｓＵ ｉ ｒｔ ｆ ｔ ｎｌｉ （ ｔｒｌ ｃ ｎ ｅ Ｎ ｔ ｔ ｖ ｓｙ ｏ Ｎ ｉ ｉ ｅ ｅ
Ｓ ｐ ２ １ ｅ 。０ １
应用 Ａ ｃ ｃＱ柱前衍生 高效液相色谱法 检测黑大麦 中的游离氨基酸
申晓蓉 陈士恩¨ ， ， 郭鹏辉ｊ李 占虎 李绪伦２韩 霁光２李振 明２王娟妮２ ， ， ， ，
（． １ 西北 民族 大 学 生命 科 学与 工程 学院， 肃 兰州 ７ ０３ ； ． 甘 ３０ ０２ 甘肃省 宁县 畜牧 局， 肃 庆 阳 ７ ５０ ） 甘 ４２ ０
ｒ ｎ 待测 ． ａ， ｉ
１４ ４ 色谱仪条件 ．．
色谱柱 ： ｅ Ａ ｅ Ｔ ｇ Ｍ 柱（ Ｑ— ａＴ 美国 Ｗａ ｒ 公司） 流动相 Ａ： ｔｓ ｅ ． 硼酸缓冲液； 流动相 Ｂ 乙腈 ； ： 流动相 ｃ ： 超纯水， 柱温 ３ ５℃， 进样量 １ Ｌ 梯度洗脱条件如表 １ Ｏ ， 所示［１ ５．
流动相 Ｂ液（ 稀释乙腈） 的配置， 由美国 Ｗａｅ 公 司提供， ｔｓ ｒ 用前取 １ ０ｍ ０ Ｌ乙腈贮备液加纯水 ９ ０ ０ ｍＬ及 ９ Ｌ四氢呋喃混匀， Ｏ“ 超声脱气 ３ ｉ． ０ｍ ｎ
１３ ３ Ａ Ｃ衍生试剂的配置 ．． Ｑ 吸取 ｌ Ｌ乙睛加入装有衍生剂粉末的瓶中， ｍ 震荡 １ ， ０ｓ放入烘箱，５℃加热 １ ｉ 直至粉末完全 ５ ０ｍ ｎ
熔化， 即得 ＡＱ Ｃ衍 生试剂 ． １３ ４ 标准溶 液 的配置 ．．
移取 ４ Ｌ ５ ｏ／ ０ｔ ２ ０ ￣ ｍｍ ｌＬ的氨基酸混合标准溶液 （ １ 含 ７种氨基酸 ）加入 ４ Ｌ２０ｍ ｏ／ ， Ｏ ５ ｍ ｌＬ内标 物， 用高纯水稀释至不同浓度， ４℃冰箱中保存备用 ． 于
２３ 样品中游离氨基酸 色谱图分析 ． 将纯化后的样品经 ０４ ｍ的滤膜过滤， Ａ Ｃ反应衍生后， ．５ 与 Ｑ 经高效液相色谱仪分析样品中所含 游离氨基酸， 其色谱图如图 ２ 所示 ．
一
６ ７ —
圈－ ２ 样品中 游离氨基酸色谱图
２４ 样 品 中游 离氨基酸种 类及含 量分 析 ．
为Ａ ＭＱ， 在检测时会形成一个很大的试剂峰影响检测， 且浪费昂贵的试剂【 引． 此外， 还应注意样 品必须与衍生剂均匀混合， 最好在样品涡旋状态下迅速加入衍生剂， 不要等到衍 生剂全加完后再涡旋混合 ． 反应试剂混合不均匀可能使衍生剂在还未与全部样品作用时即发生水解而
影 响检 测效 果 ．
［ 关键词 】 ． ６氨基喹啉． ． Ｎ 羟基琥珀酰亚胺基． 氨基 甲 酯（ Ｑ ）黑大 麦； 酸 Ａ Ｃ； 游离氨基酸 ［ 中图分 类号 ］ ８５２ Ｓ１ ． 【 文献标识码 】 Ａ ［ 文章编号】 ０９ ２ ０ （０１０ — ０ ５ ０ １０ — １２２１ ）３ ０６ — ５
黑大麦具有能促进人体健康长寿的合理食物结构， 属于“ 三高一低” 作物， 即高蛋白、 高维生索、 高纤
３ ３ 其他 因素 对检测 结果 的影响 ．
为避免基线漂移和出现杂峰， 每次注射 １ 针后运行一次空白梯度， ０ 并用流动相冲洗柱子 ． 因为氧
会破坏氨基酸， 所以高温水解前最好抽真空或是充氮气以排除氧气的干扰 ． 另外， 高压微波溶样可以显 著提 高氨基 酸 的提取率 ［１ ８．
４， 论 结
高效液相色谱仪 ：Ｖ Ｒ Ａ Ｒ Ｓ Ａ ０／ ６／ ４／ ； （ Ａ Ｉ Ｎ Ｐ Ｏ Ｔ Ｒ ８０３ ３２ ０ ） 色谱柱 ： ｃＱ—Ｔ ｇ Ｍ 柱 （ Ａｃ ａＴ 美国 Ｗａ ｒ ｔｓ ｅ 公司）真空抽滤装置、 ； 旋转 蒸发器 ；０ｃｌ ５ｍ ６ Ｉ ×４ ｍ分离柱， ５ Ｉ ９ ％乙醇， ． ％醋酸铅，０ ０１ １ ％三氯 乙酸。
１ ％乙酸， ％Ｎ Ｃ， ０ １ ａ１乙醚 ； 乙腈， 四氢呋哺， Ｑ Ａ Ｃ荧光衍生剂 ，３ ７２强酸性 阳离子交换树脂， ｏ Ｌ茚三 １ｍ ｌ ／
酮 溶液 。
１ 试 剂 配 置 ．
；
１３ １ 流动 相 Ａ液的配 置 ．．
采用美国 Ｗａ ｒ 公司提供的硼酸缓冲液， ｔｓ ｅ 用前取 ４ ０ｍ ０ Ｌ硼酸缓冲液加高纯水 ６ ０ ０ ｍＬ混匀， 超声
１ ４ 实验 方法 ．
１ ４ １ 样 品预处 理 ．．
从宁县随机采取 ３ ６份黑大麦样品， 每份 １５ ｇ 用纸袋包装备用 ． ．ｋ， 每份黑大麦样品试验时充分混 匀， 精密称取样 品 ５ｇ 在冰浴条件下加入 １ Ｌ ０ ， ０ｒ ｌ ％乙酸完全研碎， 移至 ２０ｍ ｏ 转 ５ Ｌ三角瓶 中， 加入 １ ％三氯乙酸 １ Ｌ １ ％乙酸 １ Ｌ ０ １ ０ ０ 、０ ｍ ０ 、． ％的醋酸铅 ５ｍ 、５ ｍ Ｌ ９ ％的乙醇 １ ， ０ ｍＬ 沉淀过滤 。 冰箱 ４ ℃保
２ ２ 标 准氮基 酸 回归方程 分析 ．
衰 ２ 氨基酸混合液标准曲线
对氨基酸混合液标准图谱进行积分处理后， 以各氨基酸浓度 （ ／ ） ｍｇＬ 为横坐标， 响应值为纵坐标， 绘 制标准曲线， 其对应的线性回归方程如表 ２ 所示 ． 由表 ２ 中各氨基酸回归方程可知， 方程线性关系良 好．
存 ． 后取出经沉淀脱糖去除有机物， ２ ｈ ４ 真空抽滤去掉 固体物质， 留滤液， 脱脂，４ｈ ２ 后过滤 沉淀， 最后 在４ ０℃条件下旋转蒸发至 ２ｍＬ备用 ．
１ ４ ２ 样 品纯化 ．．
将制备好的 ２ｍ Ｌ样液， 置于处理过的 ７２ ３ 强酸性阳离子树脂柱中， 再加 ５ｍ Ｌ去离子水， 待液体通 过树脂后加 ５ Ｌ２ ｌ Ｈ Ｏ 然后用 ５ Ｌ去离子水洗涤 ， ０ｍ ／ Ｎ ４ Ｈ， ｍｏ Ｌ ０ｍ 将洗涤液收集在 自动收集器的 １０ ８
本实验结果表明， ｃ Ａｃ Ｑ柱前衍生高效液相色谱法具有简便、 选择性好、 灵敏度高、 分离速度快等优
点， 用此法检测分析样品中氨基酸的含量， 其衍生物稳定时间长， 代表性好 ． 因此， 此方法也适用于黑大 麦中游离氨基酸的测定 ， 在黑大麦的开发与利用以及质量控制方面具有很好的应用前景 ．
表 １ 流动梯度洗脱条件
２ 结果
２ １ 标 准 氨基酸 衍生物 色谱 图 ．
～
６ — ６
图 １ 标准 氨基酸 衍生 物色谱 图
将氨基酸标准液稀释成 ５ 个浓度后， Ａ Ｃ衍生后采用氨基酸 自动分析仪分析检测 （ 经 Ｑ 进样量为 ２ Ｏ
ｔ ）得到氨基酸混合液标准分析图谱（ １横坐标为氨基酸保留时间， ｘ， Ｌ 图 ， 纵坐标为响应值） 由图 １ ． 可
知，７ １ 种标准氨基酸的排列顺序依次为（ 从左到右）天冬氨酸（ ｓ ）丝氨酸 （ｅ）谷氨酸 （ ｌ）甘氨 ： ａ ｐ、 Ｓｔ、 Ｇ ｕ、
酸（ｌ 、 Ｇｙ 组氨酸（ ｉ 、 ） Ｈｓ 精氨酸（ ｒ）、 ） Ａ ｇ 苏氨酸 （ ｈ）丙氨酸（ ｌ 、 Ｔ ｒ、 Ａａ 脯氨酸 （ ｒ）胱氨酸 （ ｙ）酪氨酸 ） Ｐｏ 、 Ｃ ｓ、 （ ｙ）缬氨酸（ ａ）蛋氨酸（ ｔ、 Ｔ ｒ、 Ｖ 】、 Ｍｅ 赖氨酸（ ｙ）异亮氨酸（ｅ、 ） Ｌ ｓ、 １ ）亮氨酸（ｅ ）苯丙氨酸（ ｈ ） 其 图谱 ｉ Ｌｕ、 Ｐ ｅ． 清晰、 分辨率高、 操作简单 ．
３２ ｐ ． Ｈ值 对检 测结 果的 影响
ｒ ’
Ａｃ ｃ Ｑ柱前衍生法分析氨基酸含量， 是通过反相色谱柱分离氨基酸衍生物从而达到检测氨基酸的目 的， 经适当有机溶剂的梯度洗脱可以同时将总游离氨基酸分离开来【 因此流动相 ｐ ． Ｈ值对分离效果影
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响很大， 每次配备流动相时， 都必须用 ｐ Ｈ计准确控制校准 ｐ Ｈ值， 本实验的 ｐ Ｈ值应控制在 ６ ８ ． 左右 ．
根小试管内， １ ｏ Ｌ的茚三酮进行各个收集管的显色反应， 用 ｌ ｍ ／ 收集在滤纸上与茚三酮反映出现紫红色 的试管 中的液体， 用去离子水定容至 ２ Ｌ 备用 ． ５ ， ｍ