宏基因组文库构建
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完整版)宏基因组测序讲解
完整版)宏基因组测序讲解宏基因组测序的目的是研究藻类物种的分类、与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、微生物与环境以及与宿主的关系。
宏基因组，也称为微生物环境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新名词。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。
它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系为研究目的。
一般XXX包括从环境样品中提取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。
所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
对于宏基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表型功能筛选和序列基因型分析两类。
表型功能筛选是利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因，例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
而序列基因型分析则是对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。
XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的新的微生物研究方法。
它主要通过功能基因筛选和测序分析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。
在宏基因组学研究中，样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步骤。
提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法首先，宏基因组测序技术的样品采集非常重要，需要选择适当的采样策略和方法。
采样点的选择应考虑生态系统的多样性和复杂性，同时要确保采样点的代表性和一致性，以便更准确的反映生态系统的特征。
其次，样品处理是宏基因组测序技术中的关键步骤之一、样品处理的目的是去除样品中的非目标DNA，并增加细菌和古菌的DNA含量。
常用的样品处理方法包括滤网富集、密度梯度离心和聚合酶链反应（PCR）等。
在DNA提取过程中，需要先将样品中的DNA分离出来。
DNA提取的方法有许多种，可以选择适合的方法根据不同的样品类型和目标物种。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿提取法、商用DNA提取试剂盒等。
在DNA提取后，需要进行文库构建。
文库构建是将DNA片段添加接头序列，并通过PCR放大，生成可以进行测序的文库。
文库构建的方法有多种，常用的包括文库制备试剂盒和自制接头序列等。
完成文库构建后，接下来是测序步骤。
目前宏基因组测序常用的技术是高通量测序技术，常见的有Illumina MiSeq、Illumina HiSeq和PacBio等。
不同的测序技术具有不同的优缺点，可以根据实验需求选择合适的测序技术。
最后是数据分析。
宏基因组测序获得的数据量庞大，需要进行有效的数据分析来获取有价值的信息。
数据分析可以包括序列质控、序列拼接、OTU聚类、物种注释、功能预测等。
数据分析的方法有多种，可以使用开源软件如QIIME和Mothur等，也可以使用商业软件如RDP和MetaPhlan 等。
总体而言，宏基因组测序技术的检测方法包括样品采集、样品处理、DNA提取、文库构建、测序和数据分析等步骤。
这些步骤需要结合具体的实验目的和实验条件来选择和调整，以保证获得准确、可靠和有意义的结果。
宏基因组测序技术的发展将为生物学、生态学和环境研究等领域提供更深入和全面的研究手段，推动相关领域的快速发展。
宏基因组学
组（Metagenome）
广义的宏基因组：特定环境下所有生物遗传物质的总和 狭义的宏基因组：特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和
宏基因组测序（Metagenomics Next Generation Sequencing,mNGS)
NGS:也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。 mNGS:m指宏基因组。mNGS指宏基因组二代测序，以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，利 用高通量测序平台进行基因组DNA测序，DNA不需要进行PCR扩增，测序结果具有较好的无偏性， 不仅可以提示微生物群落的物种组成，更能获需段序列分析不依赖 于任何已知序列信息进行筛选。其中以功能筛选法最为常用。
能够直接发现全新的活性物质和功能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子 缺陷：
工作量大,效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
谢谢！请大家批评指正
其前端关键性技术是环境DNA(e DNA)的提取A的提取
直接提取法（原位提取法） 不经过样品中微生物的培养和分离，通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释 放，并对DNA进行纯化。 操作简便、省时、成本低，所获得DNA具有较好的完整性，并能够代表某一生境的微生物群落多样性。 但常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题，所以一般需要进一步的 DNA纯化处理，同时所提取获得的DNA片段较用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物 细胞提取DNA。 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少，纯度较高、DNA完整性好(20kb~大、DNA得率较低，其产率只是直接裂解法的1%~10%,且获得的DNA往 往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。
广义的宏基因组：特定环境下所有生物遗传物质的总和 狭义的宏基因组：特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和
宏基因组测序（Metagenomics Next Generation Sequencing,mNGS)
NGS:也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。 mNGS:m指宏基因组。mNGS指宏基因组二代测序，以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，利 用高通量测序平台进行基因组DNA测序，DNA不需要进行PCR扩增，测序结果具有较好的无偏性， 不仅可以提示微生物群落的物种组成，更能获需段序列分析不依赖 于任何已知序列信息进行筛选。其中以功能筛选法最为常用。
能够直接发现全新的活性物质和功能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子 缺陷：
工作量大,效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
谢谢！请大家批评指正
其前端关键性技术是环境DNA(e DNA)的提取A的提取
直接提取法（原位提取法） 不经过样品中微生物的培养和分离，通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释 放，并对DNA进行纯化。 操作简便、省时、成本低，所获得DNA具有较好的完整性，并能够代表某一生境的微生物群落多样性。 但常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题，所以一般需要进一步的 DNA纯化处理，同时所提取获得的DNA片段较用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物 细胞提取DNA。 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少，纯度较高、DNA完整性好(20kb~大、DNA得率较低，其产率只是直接裂解法的1%~10%,且获得的DNA往 往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。
微生物组和宏基因组
微生物组和宏基因 组研究面临的挑战 与未来展望
微生物组和宏基因 组数据量大，解析 难度高
数据质量参差不齐， 影响挖掘准确性
解析算法和工具尚 不成熟，需进一步 优化
数据安全和隐私保 护问题亟待解决
技术挑战：提高测序深度和分辨率，降低成本 数据解读：解析微生物组和宏基因组的复杂结构和功能 伦理问题：保护个人隐私和生物安全，避免滥用数据和误导研究环境中的微生物多样性、功能和进化关系。
应用领域：环境科学、生物技术、医学和农业等领域。
定义：对环境样本中的全部微生物基因组进行测序的方法 目的：了解微生物种群结构、功能和进化关系 技术分类：高通量测序、单分子测域
简介：代谢组学分析是一种研究微生物组的方法，通过检测微生物的代谢产物来了解其 功能和相互作用。
技术手段：利用质谱、核磁共振等技术对微生物的代谢产物进行分析，以揭示其代谢途 径和生物合成过程。
优势：代谢组学分析可以全面了解微生物组的代谢活动，揭示微生物组与环境、宿主之 间的相互作用。
应用领域：在医药、农业、食品等领域有广泛的应用，例如用于药物筛选、疾病诊断和 环境污染治理等。
微生物组与人体健康： 对人体健康有重要影 响，与许多疾病的发 生和发展密切相关。
微生物组与生态平衡： 在生态系统中发挥着 重要作用，维持着生 态平衡。
微生物组研究：通过研 究微生物组的组成、功 能和相互作用，有助于 深入了解其在不同领域 的应用价值。
宏基因组是指从环境中直接提取的 基因组信息
宏基因组学在环境保护、生物能源 等领域有广泛应用
利用微生物组和 宏基因组技术可 以开发新型疫苗， 预防和控制疾病 的发生和传播。
微生物组和宏基 因组技术还可以 用于监测疾病的 进展和治疗反应， 为个性化治疗提 供支持。
基因组文库构建
SI 酶 降 解 发 夹 结 构 末 端 转 移 酶 dGTP 末 端 转 移 酶 加 寡 聚 C CCC CCC GGG GGG 连 接
转 化 E .c o li 扩 增 以 质 粒 为 载 体 构 建 cD N A 文 库
四.大容量克隆载体
基因组作图中使用的高容量人工染色体克隆载体的比较。
载体 YAC( 酵母人工染色体 ) 系统 酵母着丝粒 , 复制起始 点和端粒 克隆容量 200kb ～2Mbp 评价 嵌合 发生 率高 ( 在 基因 组 中不相连的连续片段) ； 不稳定 (自发缺失 )； 很难与酵母染色体分离； 稳定，但在细菌外难以维 持
TTTTTT
TTTTTT AAAAAA
通 过 以 下 途 径 将 cDNA 插 入 载 体 a. 平 端 克 隆 b. 加 接 头 c. 进 一 步 进 行 同 聚：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或 包装后转染宿主细胞。 载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。 重组筛选： 插入载体—通过可见标记的插入失活(cI基 因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈； 现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。
(a) 随 机 六 碱 基 NNNNNN (c)发 夹 引 物
AAAAAAA mRNA (b)寡 聚 (dT)引 物 第 一 条 cDNA 的 合 成 An An Tn (d)同 聚 物 加 尾 反 应
第 二 条 cDNA 的 合 成 TTTTTT GGGGGG CCCCCC 加接头 1 TTTTTT GGGGGG AAAAAA CCCCCC 切除发夹 TTTTTT AAAAAA 加接头 2 TTTTTT AAAAAA 经酶切进行定向克隆 cDNA 克 隆
PAC(P1 人工染色体 ) BAC( 细菌人工染色体 ) MACs( 哺乳类人工染色 体)
番茄灰霉病病株根际土壤宏基因组文库的构建
［ ］ Ｌ Ｒ Ｎ Ｐ Ｓ Ｈ Ｅ Ｅ Ｃ Ｍ ｔ ｇ ｎ ｍ Ａ ｈ ｌ ｅ ｇ ｎ ７ Ｏ Ｅ Ｚ ， Ｃ Ｌ Ｐ Ｒ ． ｅ ａ ｅ ｏ ｅ ｃ ａ ｎ ｉ ｇ ｌ ｓ ｕ ｃ ｏ ｅ ｚ ｍ ｄ ｃ ｖ ｒ ［ ］ Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ Ｍ ｌ ｃ ｌ ｒ ｏ ｒ ｅ ｆ ｎ ｙ ｅ ｉ ｏ ｅ ｙ Ｊ ． ｏ ｒ ａ ｏ ｏ ｅ ｕ ａ ｓ
春 鞘 顶 芽 一外 植 体 灭 菌 、诱 导 培 养 一继 代 增 殖 培 养 一 生 根 培养 一 瓶炼 一 营养 杯 移栽 苗 一 成 品苗 。
［］ 李 云． 果 花 菜组 织培 养技 术 ［］ 北 京 ： 国林 业 出版 ３ 林 Ｍ． 中
社 ．
［］ 梁玉 堂， 庄 如． 木 营 养繁 殖原理 和 技 术 ［］ 北京 ： ４ 龙 树 Ｍ． 中
育 出版社 ．
容 易 失水 萎 蔫 ；湿 度过 大 ， 组培 苗会 腐 烂致 死 。实验 结 果显 示 ，
相 同。
移 栽 的初 始 湿度 应 为饱 和 湿度 ，其后 逐 渐 降低 ，直 到 与 大气 湿度 林 业 出 版 社 ．
４结 论 ４ １ 工厂 化 育苗 工 艺流 程 ．
ｐｒｏ ｃｔｓ ｆ ｍ ｓ ｄｕ ｒｏ ｏｉｌ Ｄ ｌｉ ｒａ ｅｓ Ｔｎ ｓ ｅｐ ｎｙ ｔｅ ＮＡ ｂ ｒｉ ａ ｔｒ ｔＯ ｃｅ
１ ０ ０ ５ ０ ｂｐ
ｈ ｓ ［ ］ Ｏ ｇ Ｌ ｔ ， ０ ０（） ２ ０ — ４ ４ ｏ ｔ Ｊ ． ｒ ｅ ｔ ２ ０ ２ ： ４ １２ ０ ．
［］ ５ 冯美琴 ． 基 因组 学 的研 究进展 ［］ 安徽 农 业科 学．０ ８ 宏 Ｊ． ２０ ，
３ ２ ４ ５４６４ ９ ６（）： １ － １ ， ７ ．
怎样构建基因组文库
NA分子导入宿主细胞， 让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子机挑取一些转化子或重组子，提取质 粒DNA，电泳量越高，可大大减轻后续 筛选基因工作量。
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
p a c lo x P
D N A h ea d fu l
+
+ p a c c le a v a g e
p r o te in
C re
R e c o m b ila tio n
DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片 段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
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D N A h ea d fu l
+
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DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片 段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
宏基因组学
,已发现的新基因主要有生物催化 剂基因、 抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因
• 土壤宏基因组学技术最引人注目的贡献是新生物 催化剂的发现 , 包括腈水解酶和淀粉酶( Rondon et al . , 2000 )、 蛋白酶、 氧化还原酶(Knietsch et al . , 2003)、 脂肪酶、 酯酶 ( Ki m et a l . ,2004; 2006)等 ,并且在此基础上获得新酶的许 多特征信息.
• 海表层水样 为研究海洋生命的代谢潜力和海洋生态学提供
了前所未有的原始素材；海洋蕴藏着巨大的生物 多样性和复杂性 ,宏基因组学研究将大大促进人 们对它的认识。 • 极端环境水体 (如酸性矿水、 深海 )
由于其苛刻的物理化学条件,使得其中的微生 物群落也较为独特 ；利用环境基因组学对其开展 微生物生物群落结构及生理代谢对环境变化响应 的研究 ,将促进我们更好地理解这些极端环境生 态系统并对其加以调控和利用。
序列分析法
• 微序列技术 (Micr oarray)采用集约化和平面处 理原理 ,在微小片基上高密度而有序地排列大量 基因片段、 EST或寡核苷酸片段 ,从而形成 DNA 微矩阵 ,又称基因芯片。
• 焦磷酸测序技术( Pyrosequencing) 是在焦磷酸 盐测序法的基础上结合一种乳胶材料和皮升级反 应孔 ,将基因组 DNA进行随机切割 ,批量地进行 整个测序反应，能够在相同的时间内破译 6 × 106组以上的基因组序列 ,比 Sanger法要快100 倍 ,提高了测序的效率。
将一条完整的目标序列随机打断成小的片段 , 分别测序 ,然后利用计算机根据序列间的重叠关 系进行排序和重新组装, 并确定它们在基因组中 的正确位置 。
• 优点：为筛选新的天然产物提供了 一种可选择的途径, 从中挖掘上百 万个新基因,揭示不可培养微生物 的代谢途径.
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DNA或cDNA 载体：质粒载体（ plasmid ）、黏粒载体（ cosmid ）、人工染色体 （BAC、YAC）等 宿主：大肠杆菌（E.coli）、酵母（Saccharomyces ce经纯化后部 分酶切，然后把这些 DNA 片段连接到载体 上，胞获得的新功能进行筛选 , 或用 相关已知序列设计探针或 PCR 引物寻找并 分离目的基因片段，加上表达调控元件后使 目的基因表达，从而获得产物。
E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9
p=99% f=10kb/4的外源
DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的
特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA
经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组
1976年L.Clark,p)/大小与基因组DNA大小的比值
哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均克隆片段20kb f=20kb/3×109 n=690773.2
常见筛选工具: 探针
狭义: 核酸, 抗体 广义: 还包括其他筛选手段
一、功能筛选
利用目标基因的特定功能进行筛选 • 抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活 性 • 分解基因: 苯环化合物, 分解酶 • 功能活性：杀虫，酶 • 启动子/复制子
Vector
Amp ori
MCS
Tet gene without promoter
以此突变体作为宿主
在野生型的DNA导入后检测回复突变
如 营养缺陷型 相关的基因
二、核酸探针 • 同源DNA探针
高度保守的基因 rRNA基因
邻近种属的相应基因
相应基因的序列比较
• 合成寡核苷酸
蛋白质N-末端aa序列 简并探针degeneracy 选取简并程度低的aa序列
° 根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针 ° 设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛 选的阳性acteria in pure culture is typically the first step in investigating bacterial processes.
standard culturing techniques account for 1% or less of the bacterial diversity in most environmental samples
sequencing of ribosomal RNAs and the genes encoding them was introduced to desnment.
The most startling result of the many microbial diversity studies that have employed 16S RNA culture-independent methods is the richness of the uncultured microbial world.
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter
其他标记: gfp, Kan
质粒复制单位的克隆 Amp ori
MCS
目标宿主可用的 抗性gene
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位
• 功能缺失
在获得相应突变体的前提下
a suite of culture-independent techniques are needed to complement efforts to culture the thousands or millions of unknown speci能的话 设计一对, 用PCR产物作探针
三、免疫
在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选
四、高表达基因
高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织 红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数
五(1)、差别杂交 五(2)、扣除杂交
六、mRNA差别显示
Differential display PCR, DD PCR
如无特殊需要(如单个λ phage不能包容靶基因片段 或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克 多
YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段
BAC 可减少DNA分子间的重组
DNA
Plasmid λ Phage Cosmid BAC YAC
<10kb 0-23kb ~45kb ~ 100kb ~ 300kb-1.2Mb
粘粒克隆所需的克隆子数是λ phage的一半， 如λ 需700000时，cosmid需350000个
七、酵母双杂交系统
用于分离与某一已知蛋白发生相互作子，该蛋白结合 在gal基因上游激活区(UAS)可启动gal基因的转录
GAL4蛋白：可分为两个区域 DNA-BD: DNA结合域, N-末端 1-147aa AD: 转录激活域， C-末端 768-881aa
E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9
p=99% f=10kb/4的外源
DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的
特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA
经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组
1976年L.Clark,p)/大小与基因组DNA大小的比值
哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均克隆片段20kb f=20kb/3×109 n=690773.2
常见筛选工具: 探针
狭义: 核酸, 抗体 广义: 还包括其他筛选手段
一、功能筛选
利用目标基因的特定功能进行筛选 • 抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活 性 • 分解基因: 苯环化合物, 分解酶 • 功能活性：杀虫，酶 • 启动子/复制子
Vector
Amp ori
MCS
Tet gene without promoter
以此突变体作为宿主
在野生型的DNA导入后检测回复突变
如 营养缺陷型 相关的基因
二、核酸探针 • 同源DNA探针
高度保守的基因 rRNA基因
邻近种属的相应基因
相应基因的序列比较
• 合成寡核苷酸
蛋白质N-末端aa序列 简并探针degeneracy 选取简并程度低的aa序列
° 根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针 ° 设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛 选的阳性acteria in pure culture is typically the first step in investigating bacterial processes.
standard culturing techniques account for 1% or less of the bacterial diversity in most environmental samples
sequencing of ribosomal RNAs and the genes encoding them was introduced to desnment.
The most startling result of the many microbial diversity studies that have employed 16S RNA culture-independent methods is the richness of the uncultured microbial world.
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter
其他标记: gfp, Kan
质粒复制单位的克隆 Amp ori
MCS
目标宿主可用的 抗性gene
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位
• 功能缺失
在获得相应突变体的前提下
a suite of culture-independent techniques are needed to complement efforts to culture the thousands or millions of unknown speci能的话 设计一对, 用PCR产物作探针
三、免疫
在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选
四、高表达基因
高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织 红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数
五(1)、差别杂交 五(2)、扣除杂交
六、mRNA差别显示
Differential display PCR, DD PCR
如无特殊需要(如单个λ phage不能包容靶基因片段 或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克 多
YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段
BAC 可减少DNA分子间的重组
DNA
Plasmid λ Phage Cosmid BAC YAC
<10kb 0-23kb ~45kb ~ 100kb ~ 300kb-1.2Mb
粘粒克隆所需的克隆子数是λ phage的一半， 如λ 需700000时，cosmid需350000个
七、酵母双杂交系统
用于分离与某一已知蛋白发生相互作子，该蛋白结合 在gal基因上游激活区(UAS)可启动gal基因的转录
GAL4蛋白：可分为两个区域 DNA-BD: DNA结合域, N-末端 1-147aa AD: 转录激活域， C-末端 768-881aa