马铃薯腐烂茎线虫28SrDNA_D2_D3区序列分析
一种马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列[发明专利]
![一种马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/97ccb85065ce050877321399.png)
专利名称：一种马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列专利类型：发明专利
发明人：魏利辉,邵颖,万景旺,赵雷,张红艳
申请号：CN201210075653.7
申请日：20120321
公开号：CN102634526A
公开日：
20120815
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列，该基因cDNA全长
1183bp，自110bp至1108bp区段为其开放阅读框，编码333个氨基酸，5’非编码区长
109bp，3’非编码区长75bp，有多聚核苷酸尾巴，该基因在线虫耐寒作用机制中起作用，同时还在抗线虫转基因作物方面应用。
申请人：江苏省农业科学院
地址：210014 江苏省南京市玄武区钟灵街50号
国籍：CN
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甘肃省党参根结线虫病发生、分布及病原种类鉴定
甘肃省党参根结线虫病发生、分布及病原种类鉴定
石明明;李惠霞;刘永刚;李文豪;倪春辉;韩变;连芸芸;姜伟
【期刊名称】《植物保护》
【年(卷),期】2022(48)3
【摘要】为明确甘肃省党参根结线虫病的发生、分布及病原种类,在甘肃省党参主产区调查、统计田间根结线虫病发生情况,并通过形态学和分子生物学方法进行种类鉴定。
结果表明,甘肃省6个党参主产区均有根结线虫病发生,病田率、病株率分别为40.7%、13.2%,病情指数为10.4。
依据根结线虫各虫态的形态测量值和雌虫会阴花纹等特征,将危害党参的根结线虫初步鉴定为北方根结线虫Meloidogyne hapla Chitwood,1949。
rDNA-ITS区段和28S rDNA D2D3区段序列比对和系统发育树显示,6个根结线虫群体无核苷酸差异,与多个北方根结线虫聚为一支且有较高的置信度。
利用特异性引物Mh-F/Mh-R扩增得到北方根结线虫的特异性片段,大小为462 bp。
故综合形态学和分子生物学特征,将危害甘肃省党参的根结线虫鉴定为北方根结线虫。
【总页数】11页(P181-191)
【作者】石明明;李惠霞;刘永刚;李文豪;倪春辉;韩变;连芸芸;姜伟
【作者单位】甘肃农业大学植物保护学院;甘肃省农业科学院植物保护研究所【正文语种】中文
【中图分类】S435.67
【相关文献】
1.福建省部分地区蔬菜根结线虫病的病原种类鉴定
2.云南三七主产区根结线虫病病原线虫种类鉴定及分布
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5.福建省直播稻根结线虫病的病原种类鉴定
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腐烂茎线虫rDNA_ITS序列分析
ＧｅｎＢａｎｋ 上进行 ｂｌａｓｔ 同源性检索，发现均与 Ｄ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ
的 ｒＤＮＡ－ ＩＴＳ 序列 （ＧｅｎＢａｎｋ ＮＯ：ＡＹ９８７００７） 同源性较
高，尤其是 Ｄｅｓ－ １ 群体的同源性最高，达到 １００ ％。根据
１：Ｄｅｓ－ １，２：Ｄｅｓ－ ２，３：Ｄｅｓ－ ３，４：Ｄｅｓ－ ５，５：Ｄｅｓ－ ６，６：Ｄｅｓ－ ７，７：ＣＫ
单条线虫 ＤＮＡ 的提取：根据 Ｓｕｂｂｏｔｉｎ 等 ２００５ 年的方法，略有改进［１２］。 １．４ 线 虫 ｒ ＤＮＡ－ ＩＴＳ 区 的 ＰＣＲ 扩 增
用已提取的 Ｄ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ 基因组 ＤＮＡ 为模板，扩增引物为 Ｖｒａｉｎ 等 公 ［１３］ 布的扩增线虫核糖体 ＤＮＡ－ ＩＴＳ 区 的 通 用 引 物 ， 序 列 如 下 ：ｒＤＮＡ１ （５ － ３′）：ＴＴＧＡＴＴＡＣＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＴ；ｒＤＮＡ２ （５ － ３′）：ＴＴＴＣ ＡＣＴＣＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＡＧＧ。ＰＣＲ 反应体系：２．５ μＬ 的 １０×Ｔａｑ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ，１．５ μＬ 的 Ｍｇ２＋（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）， ０．５ μＬ 的 ｄＮＴＰ（１０ μｍｏｌ／Ｌ），ｒＤＮＡ１（１０ μｍｏｌ／Ｌ）和 ｒＤＮＡ２（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各 １ μＬ；０．２ μＬ 的 Ｔａｑ 聚合酶（５ Ｕ／μＬ）， 加水补足 ２５ μＬ。ＰＣＲ 反应条件：９４ ℃预变性 ２．５ ｍｉｎ；９４ ℃变性 １ ｍｉｎ；５３ ℃退火 １ ｍｉｎ；７２ ℃ 延 伸 ２ ｍｉｎ， 设 ４０ 个循环；最后 ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎ。扩增产物在 １．０ ％的琼脂糖凝胶中电泳分离后，通过 ＡＬＰＨＡ ５５００ 的凝胶呈像系统显示记录电泳结果。 １．５ ＰＣＲ 产物的克隆
国家科技支撑计划—进境有害生物检测关键技术研究项目（编号：２００６ＢＡＫｌ０Ｂ０６－ ２）资助。 刘先宝 男，１９７７ 年生，硕士，助理研究员。研究方向：植物病原线虫。电话：０８９８－ ２３３０２８２６。 ＊ 通讯作者 葛建军，电话：０１０－ ６４９１２７４２，Ｅ－ ｍａｉｌ：Ｊｉａｎｊｕｎ１１＠１６３．ｃｏｍ。 收稿日期：２００７－ ０７－ ０９ 修回日期：２００７－ １２－ ０３
不同地理来源腐烂茎线虫种群杂交后代致病力测定
不同地理来源腐烂茎线虫种群杂交后代致病力测定王宏宝;毛佳;李茹;赵桂东;林茂松【摘要】利用室内人工接种方法对腐烂茎线虫杂交后代进行致病力、繁殖力的测定,结果表明:同一基因型内各组合中均能杂交成功,比较发现各种群的后代数目与对照亲本的数目有显著差异,各杂交组合中杂交率与F1数量均低于对照组(对照组为亲本自交)；各杂交群体在致病力、繁殖力表现方面与对照DeSD种群在P0.05水平上均存在差异；各种群正反交群体致病力、繁殖力与对照相比,对照DeSD种群所在的反交组合表现特征均高于其正交组合；相关性分析,腐烂茎线虫两类基因型各种群基因型内杂交群体致病力与繁殖力均存在正相关.本研究对模拟我国不同地理来源腐烂茎线虫种群扩散后所产生杂交代的致病力分化情况,腐烂茎线虫遗传多样性具有重要的应用价值,并为不同地理来源有害生物入侵分险评估提供理论依据.%Using artificial inoculation methods, on offspring of Ditylenchus destructor, the pathogenicity, fecundity of that were determination, the results showed that: hybrids combinations within the same genotype can successfully. Compared of the number of descendants, found in the various groups and control parents were significantly different, the hybridization rate and the number of F, hybrid were lower than the control group (the control group as the parents selfed) ;The hybrid groups and control DeSD population, in pathogenicity, reproductive performance, there were differences at the P0.05 level;Compared with groups of reciprocal groups and the control population in the pathogenicity, fecundity, performance characteristics of the anti-crosses was higher than the orthogonal on the control DeSD; Correlation analysis was showed thatpathogenicity and fecundity of Ditylenchus destructor hybridization groups were positively correlated. This study has important applications on the genetic diversity of Ditylenchus destructor and the virulence differentiation of simulating proliferation of hybrids of Ditylenchus destructor populations in different geographical origin, at the same time, This was provided a theoretical basis on the risk assessment of pest invasion from different geographical origin.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2011(026)006【总页数】5页(P212-216)【关键词】生物学杂交;腐烂茎线虫;致病力;繁殖力【作者】王宏宝;毛佳;李茹;赵桂东;林茂松【作者单位】江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所,江苏淮安223001;南京农业大学植保学院,江苏南京210095;南京农业大学园艺学院,江苏南京210095;江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所,江苏淮安223001;江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所,江苏淮安223001;南京农业大学植保学院,江苏南京210095【正文语种】中文【中图分类】S435腐烂茎线虫(Ditylenchus destuctor)是一种迁移性的内寄生线虫，主要为害植物的地下部分(根瘤、匍匐茎、球茎、根茎和块根)，很少为害地上部分，缺少高等植物时，可以取食土壤真菌存活。
马铃薯腐烂茎线虫在甘薯上的形态鉴定
马铃薯腐烂茎线虫在甘薯上的形态鉴定马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）是一种全世界分布广泛的植物寄生性动物，广泛存在于农作物种植区域，主要危害马铃薯等根茎作物，可导致茎瓤叶变黑枯死，经济损失极大。
甘薯也是马铃薯腐烂茎线虫的宿主之一，但往往出现子母不对应，鉴定和认定被感染者时，要视具体情况进行实地鉴定。
马铃薯腐烂茎线虫可以使甘薯叶片与叶脉变黑、潮烂，也可以出现蔫萎、绿叶变白、表皮粗糙等症状。
也可能出现灰白色的病斑，病斑处经过按压或抠取时会检查到狭长的成虫或褐色的卵。
此外，甘薯根中的马铃薯腐烂茎线虫也可能长期潜伏，成熟者不能很容易被发现，因而检疫要特别当心，及早发现和防治。
为了准确鉴定马铃薯腐烂茎线虫存在情况和治疗情况，需先进行常规检查和实验室检测，同时进行模拟试验，全面分析对马铃薯腐烂茎线虫影响因素所造成的蔓延状况，根据检查结果及时采取合理的防控措施。
我们可以利用细胞凝聚和入侵的实验，进行靶物的分离、检测，采用荧光显微镜观察叶片上卵和幼虫的形态特征，及时确认病原及其传播蔓延情况，并采取科学的防控措施，尽早控制病害的发展和经济损失，确保农作物的平安产量。
鉴定马铃薯腐烂茎线虫在甘薯上的形态首先应到种植或病害发生原位查看，关注甘薯叶片是否出现植物萎蔫发黄、叶肉变黑等症状，出现有病斑的话，应将病斑取出及时浸泡，以提高动物的表观密度。
同时，应采用洗涤的方法将病斑表面的植物残渣洗净，然后仔细观察叶片表面，可以发现褐色粒状的卵、灰白色的成虫，以及褐色小虫、灰褐色小虫等，经过确认就可确定马铃薯腐烂茎线虫感染情况。
另外，还可以进行发芽实验，将病害发生区甘薯叶片在75℃水里浸泡，共浸泡2小时，再将其浸出，移植到湿土中，用文房四宝在植物叶片下编号，每天清洗观察包含的褐色卵和灰白色的成虫是否孵化，若有，则说明病情严重平时动物积累已达到有感染的程度。
综上所述，用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫在甘薯上的形态，需要对植物叶片、叶肉、病斑进行一一分析查看，结合发芽实验和显微镜查看，观察褐色的卵和灰白的成虫，并采取有效的防控措施，及时鉴定并处理马铃薯腐烂茎线虫在甘薯上的形态。
伞滑刃线虫属部分种群28S RNA基因中D2-D3区的特征
ｓ ｐｈｅｌ ｎｃ ｓ ｓｐ ｃｔ ｓ ＪＡＮＧ —ｉ ａ ｅ ｈｕ ｅ ｅ Ｉ Ｌｉ ｎ，ＺＨＥ ｑ ＮＧ ｉｇＷＨ （ｎｔｕｅｏ ｉｔ ｈｏｏ ｙ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｒ ｕｔｒ Ｊｎ — Ｉｓ ｔ ｆ ｏｅ ｎ ｌｇ ， ｏｌ ｅｏ ｉ ｌ ｅ ｉｔ Ｂ ｃ ｅ Ａｇ ｃ ｕ
ａｄＢｏ ｃｎ ｌｇ ， ｈｊ ｇＵ ｉ ｒｉ ， ｎ ｚｏ １０ ９， ｈｎ ） ｎ ｉｔ ｈ ｏ ｙ Ｚ ｅａ ｎｖ ｓｙ Ｈａｇｈｕ３０ ２ Ｃ ｉａ ｅ ｏ ｉ ｎ ｅ ｔ
ａｌｔ ｅ ｓ ｅ ｉｓ ａ ｄ ｐ ｐ ｌ ｔ ｎｓｏ ｒ ａ ｅ ｅ ｃ ｓａ ｄ Ｅｋａ ｌ ｈ ｐ ｃ ｅ ｏ ｕ ａ ｏ ｆＢｕ ｓ ｐｈ ｌｎ ｈｕ ｔｐｈｅｅ ｃ ｏ ｄ ｓｕｓ ｄ ｉ ｅ ｓｕｄ ｒ ｆｅ ｅ ｔａｅ ｎ ｉ ｎ ｌ ｎ ｈ ｉ ｅ ｅ ｎ ｔ ｔ ｙ ｗｅ ｅ ｄ ｆｒ ｎ ｔｄ ｈ ｉ ｉ ｂ ｉ ｅ ｔ ｎ ｏ 一 ｘ ｎ ｓｏ ｅ ｉ ｎ ｆ２ ｙ ｄ ｇ ｓ ｏ ｆＤ２ Ｄ３ ｅ ｐａ ｉ ｎ ｒ ｇ ｏ ｓ ｏ ８Ｓ ＲＮＡ ｅ ｅ ｗｉ ｈ ２３ ．Ｔｈ ｈ ｌ ｇ ｎ ｔｃ ｔｅ ｒ ｏ — ｉ ｇ ｎ ｔ Ｂｓ Ｉ ６ Ｉ ｈ ｅ ｐ ｙ ｏ ｅ ｅｉ ｒ ｅ ｗｅ ｅ ｃ ｎ
Байду номын сангаас
制性 内切酶对其进行 Ｐ Ｒ Ｒ Ｌ Ｃ ．Ｆ Ｐ分 析 ， 除松材 线虫 与拟 松材 线虫 的酶 切 图谱 比较 接 近外 ， 它伞 滑 刃线 虫种 群获 得不 其
马铃薯腐烂茎线虫类毒液过敏原蛋白基因cDNA全长的克隆与序列分析
（ｙｔｉｅｒ ｈ ｓｃｅｏｙ ｐｏｅｎ Ｃ ＩＰ） 族 的 一 肽 ， ｃ ｓｅ —ｉ ｅｒｔｒ ｒ ｔｉ， Ｒ Ｓ 家 ｎ ｃ 表达场所 在亚腹 食道腺 ， 在植物 寄生线虫 与寄 主
员 ［ ， 家族蛋 白在植 物 和动 物 中分 布广 泛 。类 毒 互作 的功能 还不 明确 。而 编码在植 物食道腺 细胞表 ２该 ］
克 隆在 食道腺 细胞 的编码分 泌蛋 白的寄生基 因
８ ｊ 及 自由生活线虫 秀丽小 杆线 虫 （ ａｎ ｒａ ｄ ｔ ｌ— 对理 解线虫 对植物 的寄生起 关键作 用ｌ 。 目前 国内 Ｃ ｅ ｏｈ ｂ ｉ ｓ ｅ ｉｅ ｇ ｎ ）６中也 有发 现 和报 道 。该类 基 因 目前 在 根结 外 没有马铃 薯腐烂茎 线虫类 毒液过 敏原蛋 白基 因的 ａ ｓｌ ］
克 隆到类 毒液 过敏原 蛋 白基 因 （ －ａ 一 ） Ｄｄｖ ｐ ２ 。
毒液 过敏 原 蛋 白基 因 Ｍｂ ｐ １ Ｎｏ ｔｅｎ杂 交 分 ｍｓ ， ｒ ｒ ｈ
１ 材 料与 方 法
析显 示该基 因在侵染前 ２ 龄幼 虫和侵染 期 ２ 幼虫 １１ 供 试 材 料 龄 ． 利用 中 国农业 科学 院植物保 护研究 所线虫 实验 均有 信号 ， 在 成 熟 雌 虫 中 未检 测 到 信 号 。Ｗａ ｇ 但 ｎ 等 ｌ从 南方根结 线虫 中获得第 ２ 类毒 液过敏原 蛋 室 已有 的马铃薯腐 烂 线 虫纯 培 养体 系 ， 河北 省 昌 ２ ］ 个 从
第 ３ 卷 第 ２期 Ｏ ２１ 年 ４ ０１ 月
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中
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学
学
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Ｖｏ ． ０ Ｎｏ ２ １３ ．
Ａｐ ．２ １ ， ８ ￣ １ ６ ｒ ０ ｌ１ ２ ８
马铃薯腐烂茎线虫病害的发生及其防治措施
严 重 损 失 。根 据 无公 害 生 产技 术 的 要 求 ， 治 腐 烂 茎 线 虫最 根 本 、 安 全 的 措 施 是 在 种 植 抗 病 品 种 的 基 础 防 最
上， 进行轮作倒茬及 生物 防治与化 学农 药相结合 ， 使各种措 施有机 协调 ， 阻止 腐烂线 虫对任何 一项措施 产生
下， 因此 不易 觉察 。线虫 学 家 Ｊ Ｎ Ｓ ｓ ｒ ： 线 ． ． ａｓ 称 “ ｅ 虫 是农业 隐 蔽 性 敌 害 。 马 铃 薯 腐 烂 茎 线 虫 以 ”
病 的 防治 ， 保 证 马 铃 薯 生 产 安 全 ， 高 经 济 效 是 提 益 的重要 措施 ， 是 目前 马铃 薯 生 产 上 亟待 解 决 也
马铃 薯腐烂 茎 线 虫病 是 植 物侵 染 性 病 害 ， 被 我 国列入 植物 线虫 检 疫对 象 名 录 。１植物 线 虫 病 ＿ 害没 有 明显 的病 状 特 征 ， 与 一 般 的缺 水 、 肥 常 缺 和一 些 昆虫分 泌毒 素 引起 的症 状 相 混 淆 。加 之 ， 线 虫个体 细 小 ， 眼难 以 看 见 ， 肉 为害 部 分 又 在 地
ｌ ｔｏ ｕ ｉ ｎ—ｆｅ ｒ ｄ ｔｏ ｅ ｈ ｏ ｏ ｙ，ｔ ｅ ｍｏ ｔｆ ｎ ａ ｎ ａ ，ｍｏ ｔｓ ｃ ｒ ａ ｕ ｅ ｎ ｔ ｅ ｂａ ｉ ｆｐ ａ ｉ ｇ ｒ － ｒ ｅ ｐ ｏ ｕｃｉｎ ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｈ ｓ ｕ ｄ ｍｅ ｔｌ ｓ ｅ ｕ ｅ ｍｅ ｓ ｒ ｓ ｏ ｈ ｓｓ ｏ ｌｎｔ ｅ ｎ ｓｓａ ｔｖ ｒｅ ｉｓ，ｃｏ ｏａ ｉｎ ａ ｄ ｂｉｌｇ ｃ ｌｃ ｎ ｒｌ， ｏ ｉａ ｉｎ ｏ ｈ ｍｉａ ｅ ｔｃｄｅ ．ｏ ｇ ｎ ｃ ｃ ｏ ｄ ｎ ｔｏ ｉｔ ｎ ａ ｉｔｅ ｒ ｐ ｒ ｔ ｔ ｎ ｏ ｏ ｉａ ｏ ｔｏ ｃ ｍｂｎ ｔｏ ｆｃ ｅ ｃ ｌｐ ｓｉｉ ｓ ｒ ａ ｉ ｏ ｒ ｉ ａｉ ｎ ｏ ｏ ｈｅ ｖ ｒｏ ｓ ｍｅ ｓ ｒ ｓ，ｔ ｒ ｖ ｎ ｏ ｅ ｔｄ ｅ ｉｔ ｎ ｅ ｔ ｎ ａ ｕ ｅ ． ｆｔ ａ ｕ ａ ｕ ｅ ｉ ｏ ｐ ｅ ｅ ｔｒ ｔｎ ｍａ ｏ ｅ ｒ ｓｓａ ｃ ｏ ａ ｙ ｍｅ ｓ ｒ ｓ Ｋｅ ｒ ｓ： ｏ ａｏ ｒ ｔｎ ｍａｏ ｅ；Ｐ ｔｔ ｙ ｗｏ ｄ Ｐ ｔｔ ｏ ｅ ｔ ｄ ｏ ａｏ；Ｃｏ ｔｏｌｎ ａ ｕ ｅ ｎ ｒ ｌｉ ｇ ｍｅ ｓ ｒ ｓ
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植物病理学报A CTA PHY TO PA THO LOG ICA SI N ICA 39(3):254 261(2009)收稿日期:2008 03 21;修回日期:2009 04 15基金项目: 973 项目(2009CB119200);国家自然科学基金资助项目(30871627);国家 十一五 科技支撑计划(2006BAD08A14)通讯作者:彭德良,研究员,主要从事植物线虫分子生物学研究;E m ai:l dlpeng @caas .n et .cn第一作者:于海英(1981-),女,吉林白城人,云南农业大学2005级硕士研究生,主要从事植物线虫学研究;E m ai:l yuhai y i ng1981@163.co m 。
马铃薯腐烂茎线虫28S rDNA D2/D3区序列分析于海英1,2,彭德良1,胡先奇2,黄文坤1(1中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100193;2云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室,昆明650201)摘要:我国危害甘薯的马铃薯腐烂茎线虫rDNA IT S 基因片段长度存在A 型(900bp)和B 型(1100bp)2个类型,A 型腐烂茎线虫群体的IT S 片段比B 型群体少200bp 。
为了进一步研究这2种类型群体的发育关系,本文用线虫通用引物D 2A 和D 3B 对来自国内的21个马铃薯腐烂茎线虫群体和1个韩国的马铃薯腐烂茎线虫28S rDNA D 2/D 3区进行了PCR 扩增,均产生大小一致的片段,长度约为780bp ,克隆、测序后用DN AM AN 5.2软件和M EG A 4软件进行分析比对,结果表明我国21个马铃薯腐烂茎线虫群体28S rDNA D 2/D 3区只有20余个碱基的差异,相似率达97.2%。
基于U PGM A 构建的系统发育树很好地区分了马铃薯腐烂茎线虫A 型和B 型群体,展现出了群体的来源及发育关系。
关键词:马铃薯腐烂茎线虫;D 2/D 3区片段;序列分析M o lecu la r c lo n ing a nd sequ en ce s an a l y s is o f 28S rDNA D2/D3reg i o ns o f D ity len chus d es tru cto r o n sw ee t po ta to in Ch ina YU H a i y i n g 1,2,PENG D e liang 1,HU X i a n qi 2,HUANG W en kun 1(1The S t a te K ey L abora t o ry fo r B i o l o gy o f D isease and Insect Pe sts ,In stitute o f P lan t P ro tec tion ,Ch inese A cade m y o f A gr i cult ural Sc i ences ,Be iji ng 100193,Ch i na ;2K ey L abo ra t o ry o f A g ricultura l B iodive rsit y and Pe sts Con tro ,lM i n istry of Educa tion ,Y unnan A g r i cultural U n i v ersit y,K un m ing 650201,Ch i na)Ab stra ct :Tw o types of r D NA I TS (Type A,900bp and Type B,1100bp)w ere de m onstrated to ex ist in D ity lenchu s destructor populations on s w eet po tato i n Ch i n a .The D 2/D 3reg i o ns o f 28S r D NA fro m 22popu lation s ofD.destructo r w ere a m p lifi e d w it h un iversal pri m er pairsD 2A and D 3B .A ll 22populations y ie l d ed one sing l e frag m ent about 780bp .Sequence ana l y sis and align m ent w ere conduc ted by usi n g the so ft w are M EGA 4and DNAM AN5.2and a ll22sequencesw ere sub m itted at t h e G enB ank .The results show ed t h at se quence d ifference s of D 2/D3reg i o n w ere only in a fe w sites ,and t h at t h e si m ilarity w a s 97.2%.Tw o types cou l d be disti n g uished i n t h e phy l o g enetic tree by usi n g UPGM A m ethod .The evo l u tionary re lationship be t w een t w o types and t h e o rig i n o fD ity lenc hu s spec i e sw ere d iscussed .Key w o rd s:D ityle nchus destructo r;D 2/D3expan si o n segm en ts ;sequences analy sis中图分类号:S435.31 文献标识码:A 文章编号:0412 0914(2009)03 0254 08马铃薯腐烂茎线虫(D ity lenchu s destructo r )是我国重要的进境植物检疫性有害生物[1],在我国主要分布于河北、山东、北京等地,主要危害甘薯,是甘薯生产上重要的病害之一。
线虫形态特征的重叠交错和形态的多样性使得传统的形态学鉴定变得困难,随着分子生物学技术的飞速发展,分子诊断成为植物线虫研究的新途径[2]。
物种的多样性最本质的体现在核酸的结构差异上,对核酸的分析可使我们了解物种进化历史的精确信息。
在真核生物中核糖体RNA 包括大小3期于海英,等:马铃薯腐烂茎线虫28S rDNA D2/D3区序列分析亚基,核糖体小亚基的序列被广泛应用于分子系统发育的研究,尤其是关于生物体也包括线虫的深层进化关系的研究[3]。
目前,通过对整个线形动物门中不同分类群体的核糖体小亚基序列的研究,为线虫的分子系统发育关系的研究提供了较全面且可靠的方法[4],但是有关大亚基在线虫分类中的研究相对很少。
线虫中核糖体大亚基一般指的是28S RNA基因,28S r D NA是核糖体大亚基r RNA的转录基因,序列中既有保守区又有可变区。
在进化过程中, 28S r D NA中的D区序列片段一直被认为是丰余的结构,因为这些片段不会妨碍核糖体的功能,但是D区序列片段也可以用来解释基因片段中的部分变异,特别是D3区常常用于研究不同地理来源的不同线虫种样品间的序列多样性[5]。
近年来, 28S r D NA D2/D3区大量的应用于许多物种的研究,在属、种的分类及亲缘种的鉴定等方面发挥了重要作用[6,7],并且在线虫中也开展了广泛的研究。
28S的D3序列可以很好地将4种常见根结线虫(M el o i d ogyne hap l a、M.a rena ria、M.inco gnita、M.j a vanica)区分开[8];28S r D NA D2/D3序列用于研究垫刃目的根腐线虫(Pra tylenchus),潜根线虫(H irschm anniella)、根结线虫(M e l o i d o gyne)、穿孔线虫(Rado pho lus)、螺旋线虫(H elico tylenchus)和盘旋线虫(Ro tylenchus)的系统发育关系[9~12]; L i等[13]对香蕉穿孔线虫r R NA基因的D2/D3区序列进行了分析比对,Jiang等[14]也成功地利用28S r D NA D2/D3区特征将伞滑刃线虫属部分种群进行区分,可见28S r DNA D2/D3区带有的系统发育信息,可为线虫系统发育比较和鉴定提供重要的依据。
本实验室已经对来源于国内21个马铃薯腐烂茎线虫群体和1个韩国马铃薯腐烂茎线虫群体的r DNA I TS进行了研究,扩增出942bp和1130bp 2个大小不同的片段,经克隆、测序和序列比对后发现I TS区存在很大差异,根据片段的大小将马铃薯腐烂茎线虫分为A型群体和B型群体,A型群体的I TS扩增片段明显比B型群体少了约200 bp,说明马铃薯腐烂茎线虫的不同群体间很可能出现了分化现象[15,16],设计构建并筛选出A型、B 型马铃薯腐烂茎线虫2对特异性引物D dS1/D dS2和D dL1/D dL2,分别扩增出A型马铃薯腐烂茎线虫、B型马铃薯腐烂茎线虫群体的特异片段252bp 和485bp;引入D3A/D3B作为内标,设计出一步双重PCR检测技术[16];本研究的目的是研究马铃薯腐烂茎线虫A型和B型群体在核糖体DNA28S 上的差异,分析系统发育的关系。
因此,对22个马铃薯腐烂茎线虫群体28S r DNA的D2/D3区域进行了序列扩增和分析,并且建立了系统发育树进行亲缘关系分析。
1 材料与方法1.1 材料供试的22个群体中21个马铃薯腐烂茎线虫群体分别采自安徽、北京、山东、江苏、河北、河南、吉林和内蒙古的甘薯病区,另有一个从韩国进口大蒜上获得的茎线虫群体(表1)。
用贝曼漏斗法从寄主植物中分离得到线虫,在显微镜下挑取活力较强的线虫200条左右,放在灭菌的指形管中用0.05%青霉素和0.05%氯霉素(青霉素!氯霉素= 1!1)消毒30m i n,再用灭菌水漂洗3次,然后接到长满半裸镰刀菌的培养基上,在25∀温箱中黑暗培养45d,得到大量纯化好的线虫后放入4∀冰箱中保存[17]。
1.2 线虫DNA的提取线虫DNA的提取参照Peng等[18]的方法进行,略有改动。
挑取5~10头茎线虫放入装有10 L ddH2O的离心管中,在-20∀的冰箱中冷冻,取出后,用75%酒精消毒的玻璃棒,在离心管中转动至冰融化,加入8 L的W LB(w o r m ly sis buffer),3 L蛋白酶K溶液(600 g/mL),10000r/m i n离心30s,-20∀下冷冻30m i n,促进细胞裂解。