双水相萃取PPT课件

• 操作简便，经济省时，易于放大.由于很容易达到 平衡，用商业上的离心机能使相分离完全，分配 系数的值重演性很好，故可直接放大
• 改变体系的pH和电解质浓度可进行反萃取
应用范围： 胞内酶的提取（双水相系统可用于除去细胞破碎后 的匀浆液中的碎片以及酶的进一步精制）
（四）影响物质分配平衡的因素
主要有聚合物的分子量和浓度/pH/演的种类 和浓度/温度等。适当的选择各参数即在最 适条件下，可达到较高的分配系数和选择 性
当聚合物相对分子质量降低时，蛋白质易 分配于富含该聚合物的相中。
例如：PEG/DX系统中当PEG的分子量降低时，会
使蛋白质易分配于富含该PEG的相中，使分配系数 增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降 低，这是一条普遍规律
➢ 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
• 高聚物与高聚物形成两相是由于高聚物的不相容 性
• 高聚物与无机盐溶液也能形成两相，这是由于盐 析作用。
• 生化工程中，多应用聚乙二醇—-葡聚糖和聚乙二 醇-无机盐系统。
只有当P和Q达到一定浓度才能形成两相
双节线
系线
（具体的证明过程省略）
系线的长度是衡量两相间差别的尺度， 系线越长两相间的差别越大，反之越 小。
当系线向下移动时，长度逐渐减小， 这说明两相的差别减小，当达到K点 时，系线的长度为0，两相间差别消 失，点s成为临界点。
（三）分配理论
和溶剂萃取法一样，蛋白质在两水相间的分 配，有分配系数
两种亲水性聚合物混合
1 混合熵的增加 —自发进行—分子的数目 2 分子间作用力 —分子间各基团相互作用之
和——分子的大小 • 对大分子而言，由于相对分子质量较大，
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
目录
（一）两水相的形成 （二）相图 （三）分配理论 （四）影响分配的参数 （五）应用
Question
• 常用的溶液萃取法能用来提 取生物大分子如蛋白质吗？
Reason
➢大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相 ➢蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活 ➢有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。
so
K=C1/C2 C1代表上相浓度，C2代表下相浓度。当相
系统固定时，分配系数为一常数只取决于 被分离物质本身的性质和特定的双水相体 系，与蛋白质的浓度无关。
当物质进入双水体系后，由于表面性质/电 荷作用和各种力（如憎水键/氢键和离子键） 的存在和环境的影响，物质在上相和下相 间进行选择性分配，
双水相系统
PEG = 聚已二醇 Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖
双水相萃取:
利用生物大分子在两种水相之间的分配比 例不同而达到分离纯化生物大分子的目的。
（二）相图
两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例 混合时，可形成均相或两相，这种水性两相 的形成条件和定量关系，常用相图来表示， 它是一条双节线。
pH的微小变化会使蛋白质的分配系数 改变2～3个数量级。
温度影响相图，特别在临界点附近，因而 也影响分配系数，
温度越高发生相分离所需的高聚物浓度越 高
工业方面
小分子分离和纯化 技术的新发展
双水相萃取系统的优点
• 直接从cell碎片匀浆中萃取prot、而无需将细胞 碎片分离
• 双水相系统平衡时间短，含水量高，界面张力低 ，成相聚合物对蛋白质有稳定作用，为生物活性 物质提供了温和的分离环境
在双水相聚合物系统中，加入电解质，首 先阴阳离子会有不同的分配。
盐的正负离子在两相间的分配系数不同， 由于各相应保持电中性，因而在两相中形 成电位差，这对带电生物大分子的分配， 产生很大的影响。
K-＞1 分配在上相 K+≈1 分配在下相
在pH6.9时溶菌酶带正 电，卵蛋白带负电。当 加入NaCl时，其浓度低 于50mmol/L时可见上 相电位低于下相电位， 使溶菌酶分配在上相， 从而分配系数增大。 而卵蛋白的分配系数减 小，。
•通常的溶剂萃取法应用于提取生物大分子是有 困难的； •但双水相萃取法含水量高，接近生理的环境中 进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性
双水相Байду номын сангаас系简介
• 1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂和 可溶性淀粉的水溶液混合时先得到一个混 不透明的溶液，随之分为两相，上相富含 明胶，下相富含琼脂（或淀粉），这种现 象被称之为聚合物的不相溶性，从而产生 了双水相体系。
双水相系统
• 是指某些高聚物之间或高聚物 与无机盐之间在水中以适当的 浓度溶解会形成互不相溶的两 水相或多水相系统
• 葡聚糖（Dextran）与聚乙二醇（PEG） 按一定比例与水混合，溶液混浊，静置平 衡后，分成互不相溶的两相，上相富含 PEG、下相富含葡聚糖，见下图
（一）两水相的形成 原理
这是因为成相聚合物的疏水性对酶等亲 水性物质的分配产生较大的影响。
同一聚合物的疏水性随分子量的增大而 增大，当PEG的分子量增加是，在质量浓 度不变的情况下，其两端羟基数减少，疏 水性增加，亲水性的蛋白质不再向富含 PEG相中聚集，而转向另一相。 那么，分子量降低时，蛋白质就易分配 于富含PEG的相了
当接近临界点时，上相和下相的组成相同蛋白 质均匀的分配于两相中，分配系数接近于1。
当成相系统的总浓度增大时，系统远离临 界点，系线长度增加，两相性质的差别增 大，蛋白质分子的分配系数（分配系数为一常数只
取决于被分离物质本身的性质和特定的双水相体系，与蛋白质的浓度
无关。）就会偏离临界点的值（=1），即大 于1或小于1。
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。