双水相萃取影响因素
萃取技术—双水相萃取技术(药物分离纯化课件)
内侧流 外侧 分配 萃取物
体 流体 系数
细胞色素 C 磷酸盐 PEG 0.18 肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 过氧化氢酶 磷酸盐 PEG 0.12 尿激酶 磷酸盐 PEG 0.65
内侧流 速,cm/s
16.3 4.0 16.3 16.3
外侧流 传质系 速,cm/s 数,cm/s
6.6 5.5?0 -6 5.0 7.5?0 -7 5.0 2.8?0 -5 5.0 2.0?0 -4
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
1.双水相萃取的应用
双水相分离条件 （1） 目的分子与细胞应分配在不同的相 （2） 分配系数应足够大 （3） 离心机容易分离
双水相萃取的应用
分离物质
举例
体系
NaDS-硫酸葡聚糖
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素
细胞组织
过氧化氢酶的分离 分离有活性核酸DNA 人生长激素的纯化 脊髓病毒和线病毒纯化 分离β－干扰素
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
2.双水相萃取分离技术的发展方向 （1）廉价双水相体系的开发
优点： (1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于
5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。 ⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg
系线
TMB：系线连接双节线上两点的 直线。
在临界点处，分配系数为1
临界点
药物分离与纯化技术课程
3．双水相相图
系线反映的信息:
(1)系线长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差 别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点）， 两相差别消失，成为均一相。
双水相萃取原理
双水相萃取原理双水相萃取是一种常用的分离和提取技术，广泛应用于化工、生物制药、环境保护等领域。
它是利用两种不相溶的溶剂（通常是水和有机溶剂）之间的相互作用，将目标物质从一种相中转移到另一种相中的过程。
在这个过程中，萃取剂的选择、相互作用机理、萃取条件等因素都对萃取效果有着重要的影响。
首先，我们来谈谈双水相萃取的基本原理。
在双水相系统中，两种相的界面上存在着大量的界面活性剂，这些界面活性剂能够形成胶束结构，使得两种相之间形成了一定的亲和力。
当目标物质存在于其中一种相中时，由于界面活性剂的存在，目标物质会在两种相的界面上分配，从而实现了目标物质的转移和分离。
其次，双水相萃取的原理还涉及到了萃取剂的选择。
通常情况下，我们会选择一种水相和一种有机相作为双水相系统的溶剂。
这两种溶剂的选择应该考虑到目标物质的亲和性，以及两种相之间的亲和性。
另外，萃取剂的选择还应该考虑到工艺操作的便捷性、回收利用的可行性等因素。
另外，双水相萃取的原理还受到了萃取条件的影响。
萃取条件包括温度、pH 值、搅拌速度等因素，这些条件会直接影响到目标物质在两种相中的分配情况。
通过合理地控制萃取条件，我们可以实现目标物质的高效分离和提取。
最后，双水相萃取的原理还涉及到了相互作用机理。
在双水相系统中，两种相之间的相互作用是通过界面活性剂来实现的。
界面活性剂的存在使得两种相之间形成了一定的亲和力，从而实现了目标物质的转移和分离。
同时，界面活性剂的种类和用量也会直接影响到双水相萃取的效果。
综上所述，双水相萃取是一种重要的分离和提取技术，其原理涉及到了萃取剂的选择、萃取条件的控制、相互作用机理等多个方面。
通过对这些因素的合理把握，我们可以实现对目标物质的高效分离和提取，为化工、生物制药、环境保护等领域的生产实践提供了重要的技术支持。
希望通过本文的介绍，读者能够对双水相萃取的原理有一个更加深入的了解。
双水相萃取解析
➢ 一般采用室温操作： 成相系统聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋 白质不会发生变性； 常温下溶液粘度较低， 容易相分离； 常温操作节省冷却费用。
4.双水相萃取技术的发展
（1）历史：
➢ 早在1896年，Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与 可溶性淀粉溶液相混时，得到一个混浊不透明的溶液，随 之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉）， 这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility）； ➢ 20世纪60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A及同事 最先提出了双水相萃取技术； ➢ 1979年，西德的Kula M R等人首次将ATPE应用于生物产 品分离；
➢大量研究表明：生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统 间的各种相互作用，主要有静电作用、疏水作用和亲和作用等， 其分配系数可为各种相互作用之和。
ln m ln me ln mh ln ml
①静电作用：两相系统中若有带电溶质存在，会ห้องสมุดไป่ตู้大分子在两 相间的分配系数产生影响。（图5-15） Donnan Potential:当大分子或粒子带有静电荷时，在带有电荷 分配不相等时，就会在两相间产生电位差，称为道南电位。 ②疏水作用：某些大分子物质表面具有疏水区，溶质的表面疏 水性会对其在两相间的分配系数产生影响。
3.影响双水相分配的主要因素
高聚物的相对分子质量 高聚物的浓度 盐的种类和浓度 PH值 温度
（1）高聚物的相对分子质量：
➢在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的相对分子质 量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如细 胞或细胞碎片和细胞器，将更多地分配于该相。
以PEG-Dextran体系为例，↓Dextran→K↓ ↓PEG→K↑（表5-4）
双水相萃取
介绍你所知道的新型分离技术。
双水相萃取：双水相萃取是两种水溶性不同的聚合物或者一种聚合物和无机盐的混合溶液,在一的浓度下, 体系就会自然分成互不相容的两相。
被分离物质进入双水相体系后由于表面性质电荷间作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键)等因素的影响, 在两相间的分配系数K 同, 导致其在上下相的浓度不同, 达到分离目的。
现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业化生产迈进，展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方面的巨大应用前景，将有力推动生物技术的发展。
利用聚乙二醇( PEG ) /磷酸盐双水相体系提取天然发酵物中的碱性木聚糖酶, 确定最佳体系是22% PEG6000, 10% K2HPO4和12% NaCl活性酶的产率可达98% 。
除此以外,在近几年的报道中双水相萃取已用于多种蛋白质和生物酶的分离, 如牛血清蛋白( BSA )、牛酪蛋白、β- 乳球蛋白、血清蛋白; α- 淀粉酶和蛋白酶、胆固醇氧化酶、脂肪酶、磷酸甘油酸激酶( PGK )和磷酸甘油醛脱氢酶( GAPDH )、葡糖淀粉酶、L- 天门冬酰胺酶等都在双水相体系中得到较好的分离。
β- 内酰胺类包括青霉素和头孢菌素, 是应用广泛的抗生素药物; 大环内酯类抗生素如:红霉素和乙酰螺旋霉素都利用ATPE 技术得到了较好的收率; 在多肽类抗生素中,用双水相体系对万古霉素的提取也得到了满意的结果。
双水相萃取技术的特点ATPE 作为一种新型的分离技术, 对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势:(1)含水量高( 70% -90% ), 在接近生理环境的体系中进行萃取, 不会引起生物活性物质失活或变性;(2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质, 还能不经过破碎直接提取细胞内酶, 省略了破碎或过滤等步骤;(3)分相时间短, 自然分相时间一般为5 m in -15 m in;(4) 界面张力小( 10- 7 -10- 4mN /m) , 有助于两相之间的质量传递, 界面与试管壁形成的接触角几乎是直角;(5)不存在有机溶剂残留问题, 高聚物一般是不挥发物质, 对人体无害;(6)大量杂质可与固体物质一同除去;(7)易于工艺放大和连续操作,与后续提纯工序可直接相连接,无需进行特殊理;(8)操作条件温和, 整个操作过程在常温常压下进行;(9)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。
双水相萃取全解
1、双水相体系的组成
双水相体系的主要成因——聚合物的 不相溶性
双水相现象是当两种聚合物或一种聚 合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合 物之间或聚合物与盐之间的分子空间阻碍 作用，无法相互渗透，当聚合物或无机盐 浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两 相，因为使用的溶剂是水，所以称为双水 相。
① 聚合物∕聚合物双水相
影响双水相萃取平衡的主要因素有： 组成双水相体系的高聚物类型、高聚物 的平均分子量和分子量分布、高聚物的 浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的 离子浓度、pH值、温度等。
1）聚合物的类型
不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水 性，聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄 糖硫酸盐糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基 纤维素＜聚乙二醇＜聚丙三醇，这种疏水性 的差异对目的产物的作用是重要的。
双水相萃取全解
主要内容：
一、双水相萃取的基本理论 二、双水相萃取工艺流程操作 三、影响双水相的因素 四、双水相萃取的应用 五、双水相萃取技术的发展
前言
• 双水相萃取现象最早是1896年由Bei jerinck 在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的， 这种现象被称为聚合物的“不相溶性” (incompatibility)。
但一般来说，当双水相系统离双节线足够远 时，温度的影响很小，1-2度的温度改变不影 响目标产物的萃取分离。
大规模双水相萃取操作一般在室温下进行， 不需冷却。这是基于以下原因：
(l)常温下，溶液的粘度较低，容易分相 (2)成相聚合物PEG对某些具有生物活性溶质 如蛋白质有稳定的作用，常温下蛋白质一般不 会发生失活、变性。 (3)常温操作节省冷却费用。
6）无机盐的浓度
盐的正、负离子在两相间分配系数不 同，两相间形成电位差，从而影响带电 生物大分子的分配。无机盐浓度的不同 能改变两相间的电位差。
双水相萃取
2.2％的葡聚糖水溶液
0.72％甲基纤维素钠的水 ％ 溶液 葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
{
发现, 早在1896年,Beijerinck发现 当明胶与琼 年 发现 脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个 混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含 明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称 聚合物的不相溶性（ 为聚合物的不相溶性（incompatibility） 聚合物的不相溶性 ） 从而产生了双水相体系(Aqueous two phase 双水相体系(Aqueous 双水相体系 ATPS)。 system, ATPS)。
当两种高聚物水溶液相互混合时， 当两种高聚物水溶液相互混合时， 它们之间的相互作用分为三类： 它们之间的相互作用分为三类： 互不相溶(imcompatibiliy) 互不相溶 复合凝聚(complex coacervation) 完全互溶(complete miscibility)
2.2 双水相体系的组成
pH影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋 影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋
白质所带电荷和分配系数。
离子环境也有影响。
5.3 疏水反应的影响 疏水反应的影响
消除电化学效应后， 消除电化学效应后，粒子表面的疏 水性占主要地位。 水性占主要地位。如被分配的蛋白 质具有疏水性的表面，则其分配 可以改变。 系数可以改变。
(4)分相时间短，自然分相时间一般 5min～15min； 为5min～15min； (5)界面张力小(10-7～ 10-4mN／m)， (1010-4mN／m)， 有助于两相之间的质量传递； 有助于两相之间的质量传递； 不存在有机溶剂残留问题， (6)不存在有机溶剂残留问题，高 聚物一般是不挥发物质， 聚物一般是不挥发物质，对人体 无害； 无害；
双水相萃取
各种双水相系统
聚合物1 聚合物1 聚丙二醇 聚合物2 聚合物2或盐 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚 糖 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 聚乙烯醇，葡聚糖， 羟甲基葡聚糖，葡聚糖 羟甲基葡聚糖， 葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠， 石酸钾钠， 石酸钾钠，磷酸钾
4、电化学分配 、 i、盐的种类及浓度 、
pH 升高, H2PO4- HPO42- PO43在PEG / K2HPO4 系统使带负电蛋白 蛋白有较高的K。 蛋白
ii、 pH 值的影响 改变两相的电位差 如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大， 则蛋白质在两相中分配越不均匀。 pH 值的变化也会导致组成体系的物质电 性发生变化，也会使被分离物质的电荷发 生改变，从而影响分配的进行。
6、双水相萃取的工艺流程 、 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取; 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取 PEG的循 的循 无机盐的循环。 环; 无机盐的循环。
一、目的产物的萃取： 目的产物的萃取： 第一步，匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进 和无机盐在萃取器中混合， 第一步，匀浆液与 和无机盐在萃取器中混合 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（ 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（PEG相）， 相 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（ 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（富盐 相） 。 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系， 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系，将目标蛋白 质转入富盐相，从而将蛋白质与PEG分离，以利于使用超 分离， 质转入富盐相，从而将蛋白质与 分离 滤或透析将PEG回收利用。 回收利用。 滤或透析将 回收利用 的回收循环： 二、PEG的回收循环： 的回收循环 加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收PEG; ①加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 相通过离子交换树脂， ②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 相通过离子交换树脂 用洗脱剂先洗去PEG，再 ， 洗出蛋白质。 洗出蛋白质。 无机盐的循环： 三、无机盐的循环： 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。 相的盐。 膜分离法回收盐类或除去 相的盐
5.3 双水相萃取
5.3.5 双水相萃取体系的影响因素
8
盐类的影响
7 6 5 4 3 2 1 0 0 0.1 0.2 ×Ë Á á ¼ Ø £ ¨ 0.3
µ KÖ
盐浓度对K值的影响
○普鲁兰酶，9%PEG4000 /1.25%DexT500 ,pH7.8 □富马酸脱氢酶，9%PEG4000 /2%DexT500 , pH7.5 ●甲醛脱氢酶，9%PEG4000 /2%DexT500 , pH7.5 ▣1,4-葡萄糖磷酸化酶，7.2%PEG4000 /6.7%DexT500 , pH7.5
5.3.5 双水相萃取体系的影响因素
聚合物分 子量的影响
1.9
ý K µ Ê ä Ï ·Å Ö
1.4 0.9 0.4 0 0.5 1 1.5 2
Ͼ Æ ÛÌ Ç· Ö× ÓÁ ¿× 100000
葡聚糖平均分子量对酶的分配系数的影响
■ 异亮氨酰基-tRNA 合成酶，9.3%PEG/6.2%Dex,73mM 磷酸钾，pH7.0 ▤ α -糖苷酶，10%PEG/5%Dex,100mM 磷酸钾，pH6.3
• 酶的双水相萃取可以在室温下进行.
• 使用 PEG/(NH4)2SO4 相系统从细菌中萃取荧光素酶时， 温度对分配系数的影响不明显。
5.3.5 双水相萃取体系的影响因素
双水相体系的性质
• 黏度：
• 两相密度差：
• 表面张力：
不仅影响相分离速度 和流动特性，而且影 主要决定于体系的组成 响物质的传递和颗粒 和两相间组成的差别， 在两相中的分配； 在相图上体现在与结线 的长度成线性关系； 一般加入不同比例 的磷酸盐和氯化钠 来控制相间电势
1）定义： •将对目的酶具有离子交换、疏水作用或适当亲和力的亲和
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双水相萃取影响因素
双水相萃取（SDME）是一种新型、高效的样品前处理技术，可用于化学分析和生物分
析等领域，尤其是在食品、环境和药物分析中应用广泛。
本文从理论和实际应用的角度，
分析了双水相萃取的影响因素，以期为相关领域的研究和应用提供参考。
一、原理和机理
SDME的原理是利用不同极性的两种液体（称为萃取相和反萃取相），通过界面活性剂的作用，形成两个不相溶的液相，样品分子在两个液相之间分配。
通常情况下，萃取相为
有机相，反萃取相为水相，通过萃取相与水相之间的互相渗透和传递，达到从样品中提取
目标化合物的目的。
具体实现过程如下：
1. 在反应器基底加入水相；
2. 加入萃取相和表面活性剂，搅拌混合数分钟，形成两相；
3. 将要分析的溶液加入反应器中，搅拌混合数分钟；
4. 将萃取相吸取至分析管中分析。
根据分析需要，萃取相和反萃取相的性质可根据实际情况选择。
例如：反萃取相可以
是水，也可以是其他非极性的有机溶剂（如正己烷）；萃取相可以是极性的醇类（如乙醇、异丙醇等）或非极性的烃类（如十二烷、环己烷等）。
表面活性剂通常选择SDS、Tween-80、CTAB等。
二、影响因素
1. 萃取相和反萃取相的性质
萃取相和反萃取相的性质包括极性、表面张力和相容性等，是影响SDME效果的关键因素。
通常情况下，萃取相为有机相，反萃取相为水相，且两种相应具有较好的互相溶解性。
萃取相的极性越大，提取的目标化合物就越多。
同时，需要注意的是，萃取相和反萃取相
之间的相容性不能太强，否则会影响其形成两相的能力。
2. 表面活性剂的种类和浓度
表面活性剂的种类和浓度是影响SDME效果的另一个重要因素。
表面活性剂的作用是促进萃取相与反萃取相的形成，同时还可以增加两相之间的交互面积，从而提高样品分子在
两个液相间的分配速度和效率。
SDS、Tween-80和CTAB等表面活性剂均可应用，不同表面活性剂对于不同种类的目标化合物具有不同的选择性。
同时，表面活性剂的浓度也会影响SDME的效果，浓度过大，会形成胶体，浓度过低，会影响SDME两相的形成。
3. 混合液的搅拌速度和时间
混合液的搅拌速度和时间是影响SDME效果的重要因素。
搅拌速度过快，会让混合液形成乳液，影响SDME的效率。
搅拌时间过短，则无法充分使目标化合物在两个相中分配。
一般来说，合适的搅拌速度和时间可以有效地促进两相之间的均匀混合和化学反应。
4. 目标化合物的性质
目标化合物的性质对SDME效果也有着较大的影响。
例如在高pH条件下，一些硫代硫
酸盐化合物的溶解度较低，在SDME过程中难以被抽取。
因此，在设计SDME实验时，需要
根据分析目的，结合目标化合物的性质，选择合适的反萃取相和萃取相。
5. 样品的性质
样品的浓度和溶解度、样品的复杂程度和pH值等，也是影响SDME的因素。
例如，在
样品复杂的情况下，必须选择合适的提取方法，以保证目标化合物提取效果。
此外，SDME
过程中目标化合物的浓度也应根据测试目的进行适当调整。
三、应用实例
SDME已广泛用于各个领域，例如环境和食品领域的农药残留分析、药物代谢产物和生物标志物的提取、天然产物和化合物的制备等。
以下以药物代谢产物为例，介绍SDME的应用实例。
1.物质及试剂
头孢他啶酯（CET）标准品(CET; purity≥ 99.5%)，乙醇，n-十二烷（analytical grade），十二烷基三甲基氯化铵（CTAC）（analytical grade）, 硫酸氢钠（analytical grade），无水硫酸钠（analytical grade）。
2.方法
选用CET及其代谢产物作为实验分析的目标物质。
在实验过程中，取一定量的n-十二烷和CTAC，与一定量的900 mmol/L的NaCl溶液脱水乙醇混合均匀，搅拌，形成一个有机相和水相。
将萃取相吸到试管中，加入一定量的无机盐和乙酸溶液，过滤吸取液，制备分
析样品。
3.结果
通过对头孢他啶酯代谢产物的分析，证明SDME能够有效地提取头孢他啶酯的代谢产物。
总之，SDME是一种高效、易于操作的样品前处理技术，具有高灵敏度、高选择性和高通量等优点，因此受到广泛的关注和应用。
通过对SDME的影响因素的探究和实践应用的总结，可以为相关领域的研究和应用提供参考。