T-a克隆说明书
T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究中期报告
T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究中期报告
研究目的：
本研究旨在利用T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因，以深入了解水稻基因的功能和调控机制。
研究进展：
1.构建T-DNA(Ds)基因库
利用T-DNA插入物Ds，构建了一个水稻基因库。
通过PCR筛选，初步鉴定出有潜在功能的插入突变体共计500个，其中包括生长发育异常、叶片变异、花和果实发育受阻等表型。
2.筛选和鉴定候选基因
对上述500个插入突变体进行了细致的鉴定和筛选，最终确定了10个有潜在功能的基因。
使用RT-PCR技术检测了这些基因的表达情况，发现它们在水稻不同器官和阶段都有相应的表达。
3.克隆目标基因
在10个候选基因中，选择了其中表达量较高的一个基因进行深入研究。
通过PCR扩增、克隆和DNA测序，成功克隆出了该基因的DNA序列。
4.功能分析
利用生化和细胞学方法，对克隆出的基因进行了功能分析，发现其编码的蛋白质可能参与了水稻抗逆和光合作用等方面的调控。
进一步的实验证明了其参与抗逆和光合作用的功能。
结论：
本研究利用T-DNA(Ds)标签法成功克隆出了一个潜在的抗逆和光合作用相关的水稻基因。
该基因可能在水稻生长发育和逆境应答过程中起
着重要的调控作用，为深入了解水稻基因功能和调控机制提供了新的研究思路和方法。
同时，该研究还为今后利用T-DNA标签法克隆和研究其他作物基因提供了参考和借鉴。
TA克隆方法克隆果蝇Cyt-c-p基因 分子实验设计
TA克隆方法克隆果蝇Cyt-c-p基因摘要：细胞色素c (cyt-c)是生命体中一种重要的水溶性氧化还原血红蛋白,在线粒体电子传递、细胞凋亡中起重要作用，本研究目的是探究其克隆方法。
基因克隆的方法之一是在体外将目的基因同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究。
通过PCR法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。
本实验应用RT-PCR技术从黑腹果蝇RNA中扩增Cyt-c-p 基因cDNA片段，并克隆到质粒载体pMD18-T，鉴定测序。
关键词：基因克隆；T-A克隆；黑腹果蝇；Cyt-c-p基因基因Drosophila Melanogaster (fruit fly) Cyt-c-p gene cloning（Original TA Cloning Kit）(College of Life Science, Beijing Normal University, Beijing 100875, China)Abstract: Cytochrome c (Cyt-C) is one of the important water soluble redoxhemoglobin,play an important role in mitochondrial electron transfer and apoptosis, the purpose of this study is to explore the cloning method of CYt-c-p.Gene cloning is connected gene with thecarrier to replicateitself, and diverted it to express and further studies. Amplification of target gene fragments by PCR method in the process due to the often unclear target gene sequencesof DNA, andmethods of obtaining the objective piece usually requires a TA cloning, recombinant t-carrier, through the sequencing of known DNA sequences.Experimental application of RT-PCR amplified cDNA Cyt-c-p gene in the Drosophila melanogaster RNA fragment and cloned into the plasmid vectorpMD18-T, identification of sequencing.Key words: Gene cloning ;T-A cloning; Cyt-c-p gene1 引言1.1 研究背景细胞色素c (cyt-c)是生命体中一种重要的水溶性氧化还原血红蛋白，整个分子由一条肽链包裹着一个血红素(中心卟啉铁)组成，广泛存在于原核生物和真核生物细胞的线粒体内膜上，是生命体内氧化还原反应电子传递中的一个环节。
实验四_T_A_克隆及转化
PCR产物的连接及转化
一、实验目的
• • • • 弄清T载体的结构和T-A克隆的原理； 弄清蓝白斑筛选的原理； 学会PCR产物连接方法； 学会连接产物转化大肠杆菌感受态方法。
二、实验原理
• 1、T-A克隆原理
通过PCR的方法扩增目的基因片断，为了后续实验的需要，
往往需要将获得的目的片断通过TA克隆的方法，重组到T-载体 中。外源DNA与载体分子的连接称之为DNA重组，这样重新组 合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在T4 DNA连 接酶作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分 子与外源DNA分子进行连接。
• • • • • • （低温、加温）水浴锅 离心机 PCR扩增仪 恒温培养箱 摇床 超净工作台等
主要试剂
• • • • pMD 18-T Vector试剂盒 PCR扩增回收纯化的片段 200 mg/ml的IPTG 过滤除菌 20 mg/ml的X-gal 溶于二甲基甲 酰胺，避光保存。（低温、加 温）水浴锅 • LB培养基（ 含IPTG，X-gal， 50mg/ml 氨苄青霉素)
四、实验步骤
• 1、
产生不同末端的DNA聚合酶
• α互补 原理
许多载体（包括pMD18-T）都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码 其N端氨基酸（α肽链）的片断基因。宿主具有编码β半乳糖苷酶的C端基因。当 二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为α互补。由α互补形成 的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用X-gal显色测定出来，它能将无色的化合 物X-gal切割成半乳糖和蓝色底物。当外源DNA片断插入到多克隆位点后，就会
破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽
【国家自然科学基金】_t-a克隆_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140802
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47
科研热词 克隆 原核表达 金黄色葡萄球菌 真核表达载体 生物信息学分析 松辽黑猪 基因克隆 启动子 高迁移率族蛋白 鞘磷脂酶类溶血素 问号钩端螺旋体 重组表达 转录水平 趋化 腺病毒载体 腺病毒科 脱落酸 绿色荧光蛋白 紧密连接 空肠弯曲菌 真核表达 溶血活性 溶菌糖基转移酶 活性基因 株1s 接受甲基趋化蛋白 快速扩增技术 序列分析 幽门螺杆菌 家蝇抗菌肽 基因治疗 功能预测 副结核分枝杆菌 乳腺癌 synoviolin sirt2 oschlh igf-ⅰ基因 igf-i基因 hsp65基因 fnbp配体结合区 fnba eef1a2 diptericin基因 claudin-6 cdna cag致病岛
科研热词 推荐指数 克隆 2 鞘磷脂酶类溶血素 1 防御素 1 问号钩端螺旋体 1 重组表达 1 重组 1 酵母表达载体 1 酪氨酸羟化酶 1 遗传学技术 1 遗传 1 转染 1 苦瓜 1 肝癌 1 肌动蛋白 1 聚合酶链反应(pcr) 1 细胞凋亡 1 真核表达载体 1 白纹伊蚊 1 甲基化 1 甲型副伤寒杆菌 1 猪囊尾蚴 1 溶血活性 1 植物蛋白质类 1 梯度降落pcr 1 核糖体蛋白质类 1 条件优化 1 抗原cc1 1 截短 1 幽门螺杆菌 1 实时定量聚合酶链反应 1 实时定量pcr 1 天然免疫 1 多克隆抗体 1 基因克隆 1 基因 1 哮喘 1 原核表达 1 内参照物 1 免疫原性 1 免疫保护性 1 信号传导及转录活化因子 1 亚硫酸氢钠测序法 1 t细胞免疫球蛋白黏蛋白-4(tim-4)1 t-a克隆法 1 sph2基因/重组表达/瞬时表达 1 pgem-t载体 1 pegfp-c3 1 overlap-pcr 1 ompa基因 1 map30 1 gp45 1 eiav_(fddv) 1
PCR说明书-天根
反应举例
注意：以下举例仅供参考，实际反应条件因模 板、引物等的结构不同而各异，需根据实际情 况，设定最佳反应条件。 1. 用2×Taq Plus PCR MasterMix产品，以人基
因组DNA为模板，扩增1 kb的片段，反应体系 为25 µl（如反应体系不同，可按此比例增加 或减少用量）。
组成成份
版本号: KT121221
2×Taq Plus PCR MasterMix
目 录 号：KT205 储存条件: -20℃可长期保存，多次冻融不会影响
活性。如需经常使用，可存放于4℃。 产品内容：
产品组成
2×Taq Plus PCR MasterMix ddH2O Loading dye in MasterMix
产品组成（2×）
0.1 U Taq Plus Polymerase/µl 500 µM dNTP each 20 mM Tris-HCl (pH8.3) 100 mM KCl 3 mM MgCl2 其它稳定剂和增强剂
质量控制
经检测无外源核酸酶活性；能有效地扩增人基因 组中的单拷贝基因；室温(15-25℃)存放一周，无明 显活性改变。
适用范围
基因检测：本产品不同批次之间误差很小，特别 适合大规模基因检测，半定量PCR实验和微量DNA 的检测。
保真度较高的DNA扩增和一些有特殊结构的复 杂模板如GC含量高（>60%），有二级结构等的扩 增：DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、 序列测定等。PCR产物如需克隆，纯化后可直接进行 T/A载体克隆，如需提高克隆效率，建议加A后再进 行T/A载体克隆。
体积
Template
< 1 µg
Primer 1(10 µM)
T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究开题报告
T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究开题报告题目：T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究研究背景：现代农业发展需要应用高效的基因工程技术，以快速获取适应新环境和抗病虫害的新品种。
水稻是人类主要粮食作物之一，其基因组已经被完全测序。
基于水稻基因组序列，利用T-DNA(Ds)标签法对水稻基因进行定向克隆是目前最常用的方法之一。
研究内容：本文旨在应用T-DNA(Ds)标签法将水稻基因进行克隆，并对克隆后的基因进行分析。
具体内容包括：1.构建T-DNA(Ds)标签载体和转化水稻本研究计划设计特定的T-DNA(Ds)标签载体，并通过Agrobacterium 菌体介导法将其转化到水稻中。
转化后的水稻株系将筛选、鉴定，获取阳性转化株系，并使用PCR等技术验证T-DNA(Ds)标签的插入和稳定性。
2.利用T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因根据T-DNA(Ds)标签载体的设计，利用PCR和Southern分析等技术对转化获得的水稻植株中的T-DNA(Ds)标签位置和基因插入情况进行确定。
通过PCR扩增并克隆标签处的DNA序列，并进行基因注释和同源性分析，得到克隆的水稻基因信息。
3.对克隆后的水稻基因进行功能和表达分析通过生物信息学分析和转基因水稻杂交等筛选方法，验证克隆基因在水稻中的生物学功能。
利用实时荧光定量PCR技术，研究基因在不同生理和生态环境下的表达模式及其规律。
并探究基因参与水稻的生长和发育、抗逆性等生物学过程。
预期结果：本研究计划应用T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因，探究基因的生物学功能和表达模式及其对水稻的生长和发育、抗逆性等生理生化习性的影响。
期望为水稻基因组研究提供新的思路与途径，进一步推动水稻育种繁育工作的进展。
T载体克隆连接原理、制备及载体序列
T载体克隆连接原理、制备及载体序列T载体的定义：T载体（T-Vector）是一种高效克隆 PCR 产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。
T载体的作用原理：大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性（下图红色框内所示位置）。
因此，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提高了PCR产物连接和克隆的效率。
T载体进行TA克隆的优势：相对于另一种非定向克隆——平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快速、高效、一步到位的非定向克隆法。
有研究曾证明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率高。
T载体的制备：：1 商业化T载体：一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72～75℃反应，进行末端的加T。
2 自制T载体：一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI，其识别和切割特点如下：其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG，而切割序列则为中间三角箭头所指的N（N代表任意碱基）。
由于N可以是任意碱基，所以如果将切割位置的N设置为T，那么在该酶的切割下，就可以产生一个3’ T末端。
相似的，在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点（保证切割位点为T即可）就可以产生另一个T末端。
一般可以在商业化的T载体基础上进行改造，通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。
连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存，使用时用XcmI进行完全酶切（这里的酶切必须保证完全，否则载体易自连，所以XcmI酶最好过量，或者适当延长消化时间），就可以制备得到T载体。
[3]常见T载体及序列：虽然上面提到可以自制T-Vector，但实际上现在的商业化载体已经做到比较便宜，而且批次间稳定性保持的不错。
TA克隆(pMD18-T载体)
pMD18-T Vector:●制品说明pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。
本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。
此外，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。
本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control反应。
●制品内容pMD18-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支Control Insert（50 ng/μl） 10 μl×1支Solution I* 30 μl×5支* 使用时请于冰中融解。
●保 存： -20℃●纯 度■ Control Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。
■ Control Insert经克隆后，用双脱氧测序法确认多克隆酶切位点及T 碱基的存在。
●用 途■ 进行TA克隆，克隆PCR产物。
■ 对克隆后的PCR产物使用BcaBESTTM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。
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pUCm T-载体试剂盒组成编号规格SK2211 1 µgSK2212 5 µg保存方法及注意事项该产品低温运输，-20°C保存，有效期为一年。
产品介绍pUCm-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T Cloning）的专用载体。
本载体由pUC系列载体改建而成，在pUC载体的多克隆位点处插入特殊的限制性内切酶识别位点，酶切后能在载体的3’端形成悬挂的“T”末端。
很多DNA 聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。
这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
大大提高了3’末端A突出PCR产物的连接、克隆效率。
pUCm-T载体图谱及多克隆位点序列pSG-TS19载体试剂盒组成编号规格SK2221 1 µgSK2222 5 µg保存方法及注意事项该产品低温运输，-20°C保存，有效期为一年。
产品介绍pSG-TS19 Vector是用于克隆含有A末端PCR产物的理想载体。
该载体基于pUC19的T simple载体，与现行T载体相比，消除了多克隆位点区大多数酶切位点，避免载体上存在的位点和插入片段中设计的位点发生干扰。
在T突出两端设计两个Hin d III位点，可以用单一的酶Hin d III进行插入子鉴定，该位点的设计使得载体具有如下特点：A、对于有插入片段的载体，Hin d III酶切后将切下和插入片段大小一致的片段；B、对于掉T自连的载体，Hin d III不能切割；C、对于酶切不完全自连的载体，Hin d III酶切后掉下25 bp片段，大小可以在琼脂糖凝胶上分开。
由于Xcm I酶切不完全或者因为两端掉T的情况，载体自连所产生的转化子均为蓝斑，从而降低假阳性率。
插入位点两侧的距离经过优化，如使用M13通用引物进行测序，在获得良好的序列读取的同时，尽量减少载体序列残留。
pSG-TS19载体图谱及多克隆位点序列pUCm-B载体试剂盒组成编号规格SK2231 2 µg 1.5 ml 选择液SK223210 µg7.5 ml 选择液保存方法及注意事项该产品低温运输，-20°C保存，有效期为一年。
产品介绍pUCm-B Vector是一种高效快速克隆平末端DNA片段的载体。
它是由Sma I酶切后产生的即用型线性载体。
Sma I位点位于自杀基因之中，载体自身连接转化后不能生长，最后得到的转化子几乎都是含有平末端DNA 插入片段的重组子。
该试剂盒使用方便，可以直接用于连接反应，免去繁琐的酶切、电泳检测、纯化、去磷酸化、再纯化等步骤。
可用于克隆酶切产生的平末端DNA、Pfu酶扩增的PCR片段、cDNA 片段、3'和5'RACE 片段、Taq酶扩增的PCR 片段(部分为平末端）等。
pUCm-B 载体图谱及多克隆位点序列Acc I MluT-载体PCR产物克隆试剂盒试剂盒组成组分SK2213，20次SK2214，100次T Vector 1 µg 5 µg10×Ligation Buffer50 µl200 µl50% PEG 400050 µl200 µlT4 DNA Ligase, 5 U/µl100 U500 USterilized ddH2O 1 ml 1 ml操作手册1份1份保存方法及注意事项该产品低温运输，-20°C保存，有效期为一年。
产品介绍pUCm-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。
本载体由pUC系列载体改建而成，在pUC载体的多克隆位点处插入特殊的限制性内切酶识别位点，酶切后能在载体的3’端形成悬挂的“T”末端，大大提高了3’末端A突出PCR产物的连接、克隆效率。
本载体在插入位点两端独特设计了两个Pst I 识别位点，可以用Pst I 单酶切对插入片段进行检测，大大方便了客户的酶切检测步骤。
经本载体克隆的PCR片段，可以用M13通用引物和T7启动子引物进行测序。
16实验准备☑ PCR产物3’末端带有突出的A碱基：Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物3’末端均带有突出的A碱基。
建议扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行回收，再进行连接转化实验，可以使用生工产品柱式DNA胶回收试剂盒（SK8131/8132）。
如果PCR扩增产物特异性很高，可直接使用生工产品柱式PCR产物纯化试剂盒（SK8145/8146）纯化PCR产物。
☑ PCR产物3’末端没有突出的A碱基：Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性，其扩增的PCR产物末端可能不带有3’ A，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先对其进行3’末端加A，再进行连接转化实验。
建议选用生工产品dA-T ailing Kit（SK2291/2292）进行加Ａ实验。
☑ 自备试剂：SOC培养基、IPTG、X-gal等。
标准操作步骤1.在0.2 ml PCR管中配制下列连接体系：反应组分10 µl 反应体系插入的目的片段X µl（0.2 pmol）pUCm-T Vector 1 µl（50 ng）10×Ligation Buffer 1 µl50% PEG 4000 1 µlT4 DNA Ligase 1 µlSterilized ddH2O补足至10 µl2.16 °C连接1-12 h。
3.将100 µl感受态细胞置于冰上解冻后，加入上述10 µl连接液，轻轻混匀，冰上放置30 min。
4.42°C水浴热激90 sec，再冰上放置5 min。
5.加入900 µl SOC培养基，37°C振荡培养1 h。
6.4000 rpm离心3 min，用枪头吸掉750 µl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
7.将细菌悬液均匀涂布在含20 µl IPTG（100 mM ）和100 µl X-gal（20mg/ml）的氨苄青霉素抗性的LB平板上。
8.将平板于37°C培养1 h，然后倒置培养过夜。
9.用牙签挑取白色菌落，以M13通用引物或基因特异性引物进行PCR扩增，确认载体中插入片段的长度大小。
或将白色菌落挑至含氨苄青霉素的液体培养基中37°C培养过夜，提取质粒后进行酶切鉴定。
16操作提示1.PCR产物的纯度A.连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，如果电泳检测PCR产物条带弥散，或出现非特异条带，则需要切下目的条带，用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。
若PCR产物电泳检测只有预期大小的明显条带，也应使用PCR产物纯化试剂盒直接纯化PCR产物，以除去引物二聚体。
不经纯化的PCR 产物在某些条件下可直接用于连接，但由于引物二聚体和PCR产物中其它物质的影响，造成含有插入片段的阳性克隆数减少，因而需要筛选很多克隆方可得到含有目的PCR产物的阳性克隆。
2.平端PCR产物A.具有校正活性的热稳定性DNA 聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在进行PCR扩增时产生平端PCR产物。
这种平端PCR 产物可以进行3’末端加A尾后连接到pUCm-T载体中，采用这种方法进行连接，可大大提高克隆的效率。
3.优化插入片段和载体的摩尔比A.pUCm-T载体优化的插入DNA片段和载体的摩尔比为3:1，采用3-10:1 的连接比例也可成功进行连接。
如果你的PCR产物开始连接的不理想，则有必要优化连接比例。
B.PCR 产物的量可采用以下公式进行换算：PCR片段的量（ng）= [ 加入载体的量（ng）×插入片段大小（kb）/载体大小（kb）] × 插入片段和载体的摩尔比4.筛选含插入片段的转化子A.插入片段成功克隆到pUCm-T载体中，可阻断β 半乳糖苷酶的编码序列，因而重组克隆可在指示培养基上通过颜色进行筛选。
大多数情况下含有PCR产物的克隆菌为白色，如果PCR片段和LacZ 基因在同一读码框内，即PCR片段碱基数是3的整数倍（含3’-A），并且读码框无终止密码子，则重组克隆菌可能为蓝色。
快速DNA连接试剂盒试剂盒组成组分SK2241SK2242Fast DNA Ligase20 µl100 µl5×Rapid Ligation Buffer200 µl 1 mlSterilized ddH2O 1 ml 5 ml操作手册1份1份保存方法及注意事项该产品低温运输，-20°C保存，有效期为一年。
产品介绍快速DNA连接试剂盒是通过T4 DNA连接酶催化双链DNA的3'-OH 和5'-P形成磷酸二脂键，把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，T4 DNA连接酶对粘末端DNA和平末端都能进行有效连接，成为一个完整的重组分子。
本试剂盒操作简单、快速。
全过程只需30分钟即可完成。
实验准备☑ 连接反应体系中，插入DNA与载体DNA的浓度比率为1:10，可获得相当数量重组体DNA。
☑ 自备试剂：载体等。
标准操作步骤1.在1.5 ml 无菌干净的离心管中配制下列连接体系：反应组分20 µl 反应体系5×Rapid Ligation Buffer 4 µl插入片段0.5 µg载体50 ngFast DNA Ligase 1 µlSterilized ddH2O补足至20 µl2.在离心机上微离3-5 s，室温放置20 min。
3.将混合物置于冰上，可直接用于转化，也可-20°C保存备用。
16双链DNA补平和连接试剂盒试剂盒组成组分SK2245，10次SK2246，20次Klenow DNA polymerase, 3 U/µl15 µl30 µl10×Klenow Reaction Buffer100 µl200 µl0.5 mM dNTP Mix20 µl40 µlT4 DNA Ligase, 2 U/µl20 µl40 µl10×Ligation Buffer100 µl200 µl50% PEG 4000300 µl600 µl Sterilized ddH2O 1.5 ml 1.5 ml操作手册1份1份保存方法及注意事项该产品低温运输，-20°C保存，有效期为一年。