基因敲除技术研究进展

图 ３ Ｐ ＣＲ 法 构 建 中 断 盒 ［８］
２．１．１ 位点特异重组酶介导报告基因的剔除 １９８９ 年 Ｃｒｅｇｇ［９］等 在 报 告 基 因 和 酵 母 同 源 序 列 之 间 加 入
８２
生物技术通报 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
２００８ 年第 ２ 期
了 ２μ质 粒 中 的 位 点 特 异 重 组 酶 识 别 序 列 ＦＲＴ。 缺 失 目 标 基 因 后 ， 再 转 入 ２μ质 粒 编 码 的 位 点 特 异 重 组 酶 基 因 ＦＬＰ， ＦＬＰ 基 因 的 表 达 造 成 ＦＲＴ 序 列 之 间 的 重 组 并 剔 除 报 告 基 因 。１９９４ 年 Ｓａｕｅｒ［１０］在 报 告 基 因 和 酵 母 同 源 序 列 之 间 加 入 了 Ｅ．ｃｏｌｉ 噬 菌 体 Ｐ１ 的 位 点 特 异 重 组 序 列 ｌｏｘＰ， 利 用 其 位 点 特 异 重 组 酶 Ｃｒｅ 剔 除 报 告 基 因 。 但 这 两 种 方 法 只 是 提 高 了 剔 除 报告基因的效率， 不能解决残留序列之间重组造成 的 染 色 体 重 排 。１９９９ 年 Ｓｔｏｒｉｃｉ［１１］等 成 功 解 决 了 这 一 问 题 。 以 往 的 研 究 表 明 ， 由 ８ｂｐ 核 心 序 列 加 上 两 端 各 １３ｂｐ 的 反 向 重 复 构 成 的 最 小 ＦＲＴ 序 列 就 可 以 在 ＦＬＰ 酶 的 作 用 下 完 成 定 点 重 组 ， 而 两 个 ＦＲＴ 的 ８ｂｐ 核心序列中一个碱基的差异即可导致重组不能发 生 。Ｓｔｏｒｉｃｉ 等 用 不 同 的 突 变 ＦＲＴ 构 建 中 断 盒 以 中 断 不 同 的 基 因 。由 于 各 突 变 ＦＲＴ 核 心 序 列 不 一 样 ， 避 免 了 残 留 ＦＲＴ 之 间 的 重 组 。而 且 ， 他 们 把 ＦＬＰ 基 因 直接克隆在中断盒里， 而不是由另外的质粒携带， 大 大简化了操作， 减少了对报告基因种类的需求［１２］。 ２．２ Ｒ ＮＡｉ 系 统 的 分 子 机 制
的 理 论 意 义 和 实 践 意 义［１］。
１ 原核中断系统 １．１ Ｒ ｅｄ 系 统 的 机 制
Ｒｅｄ 系 统 是 原 核 中 断 系 统 的 代 表 ， 由 λ噬 菌 体 ｅｘｏ、ｂｅｔ、ｇａｍ３ 个 基 因 组 成 ， 它 们 分 别 编 码 Ｅｘｏ、 Ｂｅｔａ、Ｇａｍ３ 种 蛋 白 质 。Ｅｘｏ 蛋 白 是 一 种 核 酸 外 切 酶 ， 单 亚 基 的 分 子 量 为 ２４ｋＤａ， 这 种 蛋 白 的 活 性 形 式 是 一种环状三聚物分子， 中间有一中空的通道， 通道 的 一 端 可 容 纳 双 链 ＤＮＡ 分 子 ， 另 一 端 只 可 容 纳 单 链 ＤＮＡ［２， ３］。Ｅｘｏ 蛋 白 可 结 合 在 双 链 ＤＮＡ 的 末 端 ， 从 ＤＮＡ 双 链 的 ５′端 向 ３′端 降 解 ＤＮＡ， 产 生 ３′突 出 端 。Ｂｅｔａ 蛋 白 是 一 种 退 火 蛋 白 ， 单 亚 基 的 分 子 量 为 ２５．８ｋＤａ。 在 溶 液 中 ， Ｂｅｔａ 蛋 白 自 发 地 形 成 环 状 结 构 ， 紧 紧 地 结 合 在 单 链 ＤＮＡ３′突 出 端 ， 防 止 ＤＮＡ 被
２ 真核中断系统 ２．１ 酵母中断系统
酵母中断系统是真核中断系统的代表之一。 １９９３ 年 Ｂａｕｄｉｎ 等 提 出 了 一 种 后 人 称 之 为 短 侧 翼 同 源 区 ＰＣＲ （ｓｈｏｒｔ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒｅｇｉｏｎ－ＰＣＲ， ＳＦＨ－ ＰＣＲ）介 导 基 因 中 断 的 方 法 。这 种 方 法 既 不 需 要 克 隆 目标基因， 也不需要寻找酶切位点， 整个中断盒的 构 建 只 需 一 次 ＰＣＲ 即 可 完 成 。 ＰＣＲ 的 引 物 由 两 部 分 构 成 ， 外 侧 部 分 与 目 标 基 因 ５＇ 或 ３＇ 非 编 码 区 同 源， 用于与酵母内的目标基因重组， 内侧部分与报 告 基 因 互 补 ， 用 于 ＰＣＲ 扩 增 报 告 基 因 ， 构 建 中 断 盒 。ＳＦＨ－ＰＣＲ 中 断 法 虽 然 更 加 简 便 ， 但 受 引 物 长 度 的限制， 用于体内重组的酵母同源序列不可能很 长 ， 中 断 的 效 率 往 往 较 低 。１９９６ 年 Ｗａｃｈ 提 出 了 长 侧 翼 同 源 区 ＰＣＲ （ｌｏｎｇ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒｅｇｉｏｎ － ＰＣＲ， ＬＦＨ－ＰＣＲ）介 导 的 基 因 中 断 法 。该 方 法 通 过 两 轮 ＰＣＲ 完 成 中 断 盒 的 构 建 。 第 １ 轮 ＰＣＲ 扩 增 目 标 基 因 的 ５＇ 和 ３＇ 不 翻 译 区 ， 第 ２ 轮 ＰＣＲ 以 第 １ 轮 ＰＣＲ 产 物 作 为 引 物 扩 增 报 告 基 因 。这 样 构 建 的 中 断 盒 内 酵 母 同 源 部 分 可 达 数 百 ｂｐ， 大 大 提 高 了 中 断 效 率 。与 传 统 的 中 断 方 法 相 比 ， ＰＣＲ 介 导 的 中 断 最 大的优点是不需克隆目标基因， 只要知道该基因的 序 列 信 息 ， 即 可 以 实 现 精 确 的 缺 失［７］（ 图 ３） 。
Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ Ｒ ｅｄ ｓｙｓｔｅｍ Ｙｅａｓｔ Ｒ ＮＡｉ
引言
基因敲除作为近几十年新兴的一种重要的重 组 ＤＮＡ 技 术 ， 在 微 生 物 代 谢 工 程 研 究 中 ， 利 用 λ 噬 菌 体 的 Ｒｅｄ 系 统 在 细 菌 中 进 行 的 基 因 敲 除 技 术 和 ＰＣＲ 介 导 的 酵 母 基 因 中 断 技 术 ， 广 泛 应 用 于 构 建具有特定突变的工程菌， 改变生物代谢途径， 阻 断副反应的进行， 防止副产物或有毒产物形成， 促 进 目 的 产 物 积 累 等 方 面 ； 在 生 物 医 学 研 究 中 ， ＲＮＡｉ 现象广泛存在于真核生物体内， 操纵着许多细胞功 能 ， 如 参 与 了 细 胞 正 常 的 生 长 、发 育 调 控 ， 稳 定 转 座 子 ， 同 时 调 控 机 体 抵 御 外 来 病 毒 的 入 侵 。总 之 ， 基 因 敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最 前沿， 并已对生物学和医学的许多研究领域产生深 刻的影响， 成为革命性的研究工具， 具有极其重要
收稿日期： ２００７－１１－２６ 基金项目： 生物环境科学与技术研究所科研启动项目“纳米生物技术在重金属污染生物修复中应用的研究”（ 编号 ０６Ａ０２） 作者简介： 李樊（ １９８０－） ， 女， 湖南永州人， 研究生， 从事生物技术研究 通讯作者： 何钢（ １９６５－） ， 男， 湖南湘潭人， 教授， 硕士， 从事生物技术教学和科研； Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｅｇｏｎｇ２６２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
图 １ Ｒｅ ｄ 重 组 机 制 示 意 图 ［５］
１．２ Ｒ ｅｄ 同 源 重 组 及 报 告 基 因 的 剔 除 （ 图 ２）
图 ２ Ｒｅ ｄ 同 源 重 组 技 术 用 于 基 因 打 靶 ［５］
Ｈａ 位 点 ； ｓｍ： 筛 选 标 记 Ｒｅｄ 重 组 技 术 利 用 较 短 的 同 源 序 列 ， 即 可 使 外 源 ＤＮＡ 片 段 与 靶 标 分 子 完 成 重 组 作 用 ， 但通常在靶标分子上留下筛选标记基因， 染色体或 载 体 上 含 有 筛 选 标 记 ， 有 可 能 影 响 其 生 物 功 能 。Ｒｅｄ 重组技术与其它基因工程技术结合运用， 有效地解 决 了 以 上 问 题 。目 前 利 用 Ｒｅｄ 重 组 技 术 进 行 基 因 工 程 研 究 的 策 略 主 要 有 以 下 ４ 种 ［６］：（ １） 一 步 筛 选 （ ２） 筛 选＋反 向 筛 选 （ ３） 筛 选＋位 点 特 异 性 重 组 （４）筛 选＋限制性酶切反应。其中第三种策略应用更为广 泛 ， 首 先 是 ， 筛 选 标 记 基 因 的 两 侧 含 有 可 被 Ｃｒｅ 或 ＦＬＰ 位 点 特 异 性 重 组 酶 识 别 的 特 殊 位 点 ， 经 过 第 一
关键词： 基因敲除 Ｒ ｅｄ 系统 酵母 Ｒ ＮＡｉ 干涉
Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ
Ｌｉ Ｆａｎ１，３ Ｌｉｕ Ｙｉ１，２ Ｈｅ Ｇａｎｇ２
（ １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００４； ２Ｉｎｓｔｉｔｕｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
·技 术 与 方 法·
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００８ 年第 ２ 期
基因敲除技术研究进展
李樊 １，３ 刘义 １， ２ 何钢 ２
（ １ 中 南 林 业 科 技 大 学 生 命 科 学 与 技 术 学 院 ， 长 沙 ４１０００４； ２ 中 南 林 业 科 技 大 学 生 物 环 境 科 学 与 技 术 研 究 所 ， 长 沙 ４１０００４； ３ 中 南 林 业 科 技 大 学 实 验 中 心 ， 长 沙 ４１０００４）
次筛选的重组分子可通过位点特异性重组酶的作 用 将 筛 选 标 记 基 因 删 除 ， 但 在 重 组 分 子 上 留 下 ３４ （或 ３６） ｂｐ 的 特 殊 序 列 。 Ｒｅｄ 同 源 重 组 技 术 同 其 它 ＤＮＡ 实 验 技 术 的 组 合 使 用 ， 大 大 丰 富 了 基 因 操 作 的技术手段。研究人员可灵活的运用这些实验技 术， 以达到不同的实验目的。
２００８ 年第 ２ 期
李樊等： 基因敲除技术研究进展
８１
单链核酸酶降解， 同时介导互补单链 ＤＮＡ 的退火［４］， 双 链 ＤＮＡ 退 火 完 成 后 ， Ｂｅｔａ 蛋 白 从 ＤＮＡ 双 链 上 解 离 下 来 。Ｂｅｔａ 蛋 白 在 Ｒｅｄ 同 源 重 组 过 程 中 起 着 决 定 性 的 作 且 重 组 效 率 远 高 于 ＲｅｃＡ 重 组 （ 图 １） 。