实验2 细菌的染色和形态观察
实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察
实验二细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察1.目的要求（1）学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。
（2）掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征。
（3）了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
2.基本原理（1）简单染色法用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
（2）革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
免疫学实验报告
实验一免疫学实验一、免疫细胞检测：1、淋巴细胞转化试验2、E花环形成试验3、大吞噬试验4、小吞噬试验二、凝集试验（玻片法）凝集+ 不凝集-细菌鉴定结果：三、酶联免疫吸附试验（ELISA）示教原理：结果：实验二细菌形态观察及革兰染色一、观察细菌的基本形态：1、球菌2、杆菌3、螺形菌葡萄球菌大肠杆菌霍乱弧菌（革兰染色）（革兰染色）（革兰染色）二、观察细菌的特殊结构：1、芽胞2、荚膜3、鞭毛破伤风杆菌肺炎链球菌伤寒杆菌（革兰染色）（荚膜染色）（镀银染色）三、革兰染色1、步骤：2、结果：葡萄球菌呈色，为革兰性菌；大肠杆菌呈色，为革兰性菌。
3、简述革兰染色的技术关键及医学意义。
实验三细菌人工培养及其代谢产物的观察一、常用培养基的制备：1、怎样配制100ml普通肉汤培基？2、含有%琼脂的培基为固体培基，制成平板用于；制成斜面用于。
3、含有%琼脂的培基为半固体培基，主要用于。
二、细菌在培养基中的生长情况1、平板划线分离培养结果（记录菌落形态）2、在液体培基中的生长情况：葡萄球菌：枯草杆菌：链球菌：3、在半固体培基中穿刺接种培养结果伤寒杆菌呈生长，运动；痢疾杆菌呈 生长， 运动。
三、细菌代谢产物的观察 1、糖发酵试验：产酸产气产酸不产气＋ 不分解－2、蛋白质分解试验：阳性＋阴性－3、细菌的色素：4、简述细菌代谢产物检查的意义。
实验四消毒灭菌与细菌分布试验一、记录并分析细菌分布检查的结果：根据上述检查结果，简述其在医学、药学工作中的实际意义。
二、高压蒸汽灭菌常用压力、温度及时间为：高压蒸汽灭菌器的使用要注意的是：三、紫外线杀菌试验1、培养后菌苔生长情况（绘图）：2、简述紫外线杀菌的特点及适用范围。
实验五药物的抗菌试验一、琼脂扩散法1、纸片法2、打孔法二、液体培养基连续稀释法（试管法）药物：浓度：菌种：结果：报告MIC：实验六病原性细菌一、观察下列细菌形态并绘图链球菌淋杆菌结核杆菌（革兰染色）（革兰染色）（抗酸染色）二、化脓性球菌1、葡萄球菌：阳性＋阴性－2、链球菌：3、抗链球菌溶血素“O”试验（简称抗“O”或ASO试验）：抗体效价为：简述其原理及临床意义：三、肠道杆菌：1、观察大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌在SS平板和双糖铁培养基中的菌落特点、生化反应、动力等。
试验二细菌的染色和细菌细胞构造的观察-海南大学
实验二 细菌的革兰氏染色
一、实验目的
• 掌握细菌的革兰氏染色 • 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 • 观察和识别细菌细胞的特殊构造
二、实验的基本原理
• 细菌细胞壁的结构和组成存在差异，因此不同细菌对革兰氏染色 有不同的反应（阳性和阴性）： • 革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多脂类，肽聚糖层较薄、交联度 低，当以95%酒精脱色时，脂类被溶解除去，使得细胞壁空隙变 大，肽聚糖因95%酒精处理，其孔径会缩小，但由于肽聚糖含量 较少，细胞壁孔径缩小有限，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复 合物被95%酒精洗脱出细胞壁之外，并被随后的红色复染剂染成 红色；
四、实验步骤
• 油镜的使用
1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2.调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜， 在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细 调至看清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头 上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油， 最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。
2-1棉塞制作方法
2-2移液管灭菌前 的包装
二、培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基的配制 （一）培养基配方： 牛肉膏 2.5g 蛋白胨 5.0g 、 NaCl2.5g、琼脂10.0g、自来水500mL、pH7.2~7.4 。 （二）操作步骤： 1. 取一个1000mL烧杯，装500mL蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶 解。 注意：a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成 分 b. 蛋白胨、肉膏可加热促进溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并 适当补充因蒸发而损失的水量。
实验1(实验二：细菌的革兰氏染色)实验报告
实验二细菌的革兰氏染色一、目的与要求了解革兰氏染色的原理，掌握革兰氏染色的主要操作步骤，学会革兰氏染色的方法。
二、实验原理革兰氏染色法能将细菌分成两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
在用乙醇进行脱色时，两种菌的细胞壁结构不同，阳性菌细胞壁为网状结构，比较厚，结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，而阴性菌细胞壁比较薄，颜色更容易洗脱出来，所以最终革兰氏阴性菌为红色，阳性菌为紫色。
三、实验材料菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
染色液：草酸铵结晶紫染液、路戈氏碘液、95%酒精、番红染液。
器皿及材料：洁净载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、酒精灯、接种环、镊子、无菌水、洗瓶、染色盘、载玻片架、记号笔、75%消毒酒精瓶、废玻片缸、火柴等。
仪器：显微镜。
四、实验方法与步骤1.染色步骤：（1）制片：接种环蘸取细菌液置于载玻片，酒精灯外焰加热玻片进行细菌固定。
（2）初染：添加结晶紫染色，1min后倾去染色液，蒸馏水冲洗至无色。
（3）媒染：吸干残留蒸馏水后，加入一滴碘液，作用1min，水洗。
（4）脱色：吸干残液后，加入95%酒精进行脱色，30s后水洗。
（5）复染：吸干残液后，用番红液复染，1min后，水洗。
（6）镜检：吸干残液后，低倍镜寻找目标物体，再用高倍镜放大目标物，目标视野添加香柏油进行观察。
2.平板划线（1）左手中指、无名指和小拇指托住无菌平皿。
（2）盖子用食指和拇指掰开，右手持接种环进行第一区划线。
（3）酒精灯灼烧接种环至通红，晾凉后进行第二区划线（4）重复（3）进行第三、四区划线（5）将平皿置于适宜温度的培养箱培养过夜。
五、实验结果将显微镜下观察到的2个菌种的革兰氏染色结果填于下表中，并描述菌体的颜色、形态、排列方式。
菌种名称大肠杆菌枯草芽孢杆菌菌体形态图菌体颜色紫色红色菌体形态圆形椭圆形菌体排列方式并列分散结论(G+或G-) G+G-。
实验二细菌的观察
细菌一般形态染色观察一、实验目的学习了解微生物染色的基本原理与方法学习掌握细菌的简单染色和革兰氏鉴别染色技术巩固显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理细菌的个体极微小，无色透明，必须借助于染色法，使细菌（或背景）着色，与背景（或菌体）形成明显的对比便于在显微镜下观察细菌的形态构造。
染色方法主要有：见下图简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用染料有：碱性染料：结晶紫、碱性复红、龙胆紫、番红、中性红、孔雀绿等。
酸性染料：酸性复红、刚果红、曙红等简单染色一般常用碱性染料进行染色原因：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，带正电荷，因此碱性染料很容易与细菌结合使细菌着色细菌细胞壁含有蛋白质或多肽，也就有等电点已知细菌的等电点pH为2～5。
革兰氏阳性菌为2～3，革兰氏阴性菌为4～5。
当细菌的培养液pH值大于等电点时，细菌带有负电荷；反之，带有正电荷。
一般，细菌的培养、染色、试验过程均在偏碱性（7～7.5）、中性、偏酸性（6～7）条件下，都高于细菌的等电点，故均带有负电荷革兰氏染色革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，根据细菌对这种染色反应的不同，可分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类，其机理是由于细菌细胞壁的化学组成及结构不同和通透性不同的缘故。
革兰氏染色对于细菌的分类、鉴定及食品卫生检测都有重要意义。
革兰氏染色原理影响革兰氏染色结果的因素菌龄培养基pH值染色技术：涂片质量、染色时间、脱色时间、染色脱色均匀度等三、实验器材1. 器材：显微镜，擦镜纸，二甲苯，香柏油，载玻片，接种环，酒精灯,火柴，吸水纸，无菌牙签。
2. 染色液及试剂：石碳酸复红染液、碱性美蓝染液、结晶紫染色液，路戈氏碘液，95％的酒精，蕃红染色液，黑色素水溶液，蒸馏水。
3. 菌种：白葡萄球菌、大肠杆菌的新鲜斜面菌种各1支。
四、操作步骤（一）简单染色涂片火焰固定染色水洗干燥镜检（二）革兰氏染色涂片→干燥→火焰固定结晶紫染色→水洗碘液媒染95%酒精脱色→水洗蕃红复染→水洗干燥镜检（三）口腔中微生物观察负染色五、实验报告1、实验结果绘图2、思考题（1）细菌制片过程应注意哪些？（2）试分析菌龄、培养pH、染色技术对革兰氏染色结果的影响。
微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色_图文_图文
染色结果
金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果
染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果
染色结果
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果
四、实验结果
显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数
绘图记录观察结果
思考题
1、在制作涂片中，为什么要进行固定这 一步？
2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳 性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁 的结构和组成不同决定的。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂 结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用 乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红 )复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂 蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞 中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染 剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌 。
2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂
面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的
水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 7、镜检：油镜观察并绘图。
二、实验原理---简单染色
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增 加其对染料的亲和力。常用的有加热和化 学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原 有的形。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染 色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
实验二、细菌革蓝氏染色、放线菌形态观察
印片法：取一洁净载玻片置于火焰上微热后，盖在菌苔
上，轻轻按压，使培养物（气丝、孢子丝或孢固定。
上：孢子丝
右上、右下：基内菌丝 和气生菌丝
2. 结果 革蓝氏染色阳性：深紫色 革蓝氏染色阴性：浅红色
3. 放线菌的观察
基内菌丝（substrate mycelium）：也称营养菌丝，生长于培养基内，主
要功能是吸收营养物质和排泄代谢废物，营养菌丝一般无隔膜，内含有许多核质体， 直径约为0.2-0.8μm，但长度差别很大。色浅、较细。
气生菌丝（aerial mycelium）：营养菌丝发育到一定时期，长出培养基外伸
实验二、细菌革蓝氏染色、放线菌形态观察
基本概念： 革蓝氏染色（Gram staining） 革蓝氏染色阳性（Gram Positive） 革蓝氏染色阴性（Gram Negative） 基内菌丝（substrate mycelium） 气生菌丝（aerial mycelium） 孢子丝（sporophore）
放线菌的基本特点
¾分枝丝状体，原核微生物 ¾革蓝氏染色阳性反应 ¾不运动 ¾大部分腐生菌，少数寄生菌，也有致病菌 ¾ 抗生素的主要产生菌 ¾ 许多酶和维生素的产生菌 ¾甾体转化、石油脱蜡、污水处理 ¾某些与植物共生固氮
放线菌的菌丝
1、营养菌丝 匍匐生长于培养基内，吸收营养，也称基内菌丝。一般无
隔膜，直径0.2-0.8 μm，长度差别很大，有的可产生色素。
[实验目的]
1. 学习细菌革兰氏染色原理和方法 2. 学习放线菌培养观察方法 3. 观察细菌形态及运动（活体观察）
[实验材料] 1. 菌种
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微生物学实验二
细菌的染色和形态观察
（验证性实验）
微生物学教研室 郭棵棵
实验内容
上节课实验结果观察
显微镜油镜头的使用与保护
示教：细菌的基本形态与特殊结构的观察
操作：单染色、革兰染色 材料：葡萄球菌、大肠杆菌肉汤培养物 载玻片 2张 /人 1支/6人
教学目标
了解：
1.显微镜油镜镜头的使用与保护
革兰染色的原理：
等电点学说
化学学说 通透性学说
等电点学说：
革兰阳性菌的等电点（PI 2-3)比革 兰阴性菌的等电点(PI 4-5)低，在pH=7 的染液中，革兰阳性菌所带的负电荷比 阴性菌多，因而摄取碱性染料比较多且 牢固，不易被酒精脱色。
化学学说 ：
革兰阳性菌的细胞内含有某些特殊化 学物质，一般认为是核糖核酸镁盐，能与 染料和碘液结合成为稳定的化学物，不易 被酒精溶解脱色。
思考题
1. 革兰染色的过程如何？
2. 有时候革兰阳性菌被染成革兰阴性菌的色调，
这是为什么？
革兰染色的步骤
1：制片 3：固定 2：干燥 4：染色： 初染：结晶紫 1分钟
媒染：碘液
脱色：95%酒精
1分钟
半分钟
复染：稀释复红
半分钟
革兰染色结果判断
紫
球
碘
阳
酒
杆
红,
阴,
一
阳
一
紫
半
阴半Leabharlann 红脑 淋 卡，白 抗 胞 除外
革兰氏染色的意义：
将细菌分为革兰阳性、阴性两大类。
分析细菌的致病性。 指导临床用药。
革兰染色法过程
1、涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后刮取菌 苔在盐水中乳化，涂成直径约为0.5cm 的膜。 2、干燥：在远离火焰上方微微烘干。 3、固定：火焰固定。 4、革兰染色过程： 初染：结晶紫 1分钟 媒染： 碘液 1分钟 脱色： 95%酒精 半分钟 复染： 稀释复红 半分钟 5、镜检：阳紫阴红 球阳杆阴
2. 低倍镜查找标本视野，加香柏油一滴于标本的待检部位， 换用油镜观察。 3. 从侧面注视油镜头，小心将镜头浸入镜油中，轻柔调节细 调节器进行观察。 4. 观察标本时，双眼同时睁开。 5. 油镜用毕，转动粗调将镜筒提起，取下标本，用擦镜纸沾 少许二甲苯将镜头擦净，然后再用擦镜纸擦去二甲苯。
示教：细菌的基本形态与特殊结构观察
α -溶血
β -溶血
γ -溶血
2）半固体琼脂培养基上细菌生长状态的观察：
清晰（无动力） 注意在穿刺线上细菌生长的状态 向四周扩散（有动力）
3）观察细菌在肉汤培养基上的生长状态： 有无菌膜、菌膜厚度，混浊度， 有无沉淀、沉淀的性质是絮状、粘液状或颗粒状。
空气中细菌的检查——菌落计数的方法
每100cm² 培养基在空气中暴露5分钟，其表面接受自然 沉降的细菌数约相当于10升空气中所含的细菌量。 每块平板的菌落数=4块平板的菌落总数/4 100cm² 面积培养基上的菌落数=（每块平板的菌落数 /πr² ）x100 每 m³ 空气中活菌数=（100cm² 培养基上菌落平均数/30） x1000
1、细菌基本形态的观察
2、细菌特殊结构的观察
芽胞、荚膜、鞭毛、菌毛
3、特殊染色结果观察
抗酸染色
细菌的染色
细菌是无色半透明的微小生物，肉眼看不到， 必须借助于显微镜才能够观察。然而，未经染色的
细菌标本，在普通光学显微镜下只能粗略地看见其
形态和大小，只有经过染色后才能观察清楚。染色
后镜检，不但可以识别细菌的各种不同结构，还可
正常人体皮肤及随身物品的细菌检查
结果：通常除用碘液消毒的手指外，其余手指或
杂物接触的培养基表面都有数量不等的菌落长出。
观察菌落直径大小，形状，透明度，硬度，表面， 边缘，颜色，菌落与培养基关系等。
呼吸道细菌的检查 — 咳碟试验
观察培养基上的菌落形态并进行计数分析。
显微镜油镜的使用与保护
1. 显微镜直立放稳，打开显微镜光源
2.细菌的基本形态与特殊结构的观察
3.常用的细菌染色方法
掌握：
1. 细菌单染色和革兰染色的方法和意义
2. 细菌染色标本的制备技术
上次结果观察
细菌的分离接种
1）固体琼脂平板培养基上细菌生长状态的观察：
观察平板上可有不同的菌落长出。
菌落大小； 形状（圆形或不规则）； 硬度（粘稠或易碎）； 透明度（半透明、不透明或透明）； 边缘（整齐、不整齐）； 颜色（色素）； 表面（光泽、粗糙、平滑、凸起、凹下、干燥、湿润等）； 菌落与培养基的关系（粘连、溶血与否）。
单染色法过程
1、涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后 刮取菌苔在盐水中乳化，涂成直径约为0.5cm的 膜。 2、干燥：在远离火焰上方微微烘干。 3、固定：火焰固定。 4、染色：滴加结晶紫、稀释复红或碱性美兰 液染色1～2分钟后，用细小流水洗去多余的染液。 5、镜检
（二）复染
革兰染色法
丹麦的细菌学家C.Gram 1884年发明革兰染色法
COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY COLLEGE OF BASIC MEDICAL SCIENCES THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY THIRD MILITARY MEDICAL UNIVERSITY
通透性学说：
脱色剂较易通过G-菌的细胞壁，将染料和碘 的复合物溶解洗出，故易脱色。G+菌的细胞壁通 透性低，酒精不易通过，故不易脱色。
近年来认为，95%酒精可使G+菌的细胞壁脱 水形成屏障，染料和碘的复合物不能透出；而G菌不仅无此屏障，且其细胞壁的脂类含量较G+菌 多，酒精对其表面脂类的溶解也可能是G-菌容易 脱色的一个因素。
使细菌蛋白凝固后保持其固有的外形；改变对染料的通透性。
4 染色： 滴加结晶紫、稀释复红或碱性美兰液1～2滴，使染 液盖满菌膜, 1～2分钟后，用细小流水洗去多余的 染液，在空气中自然干燥或用吸水纸轻轻吸干。 （切忌拖、拉）
5 镜检观察结果： 用结晶紫染色的葡萄球菌、大肠杆菌或变形杆菌成紫色； 复红染色者均为红色；碱性美兰染色者均为蓝色。
复染：两种或两种以上染料进行染色。 革兰染色、抗酸染色、荚膜染色等
（一）简单染色
单染染色步骤
1 涂片：
在玻片上滴一滴生理盐水，然后刮取少许菌苔在盐水中乳磨 使之乳化，涂成直径约为0.5cm - 1cm的菌膜。
2 干燥：
最好在室温中自然干燥，也可在远离火焰上方微微烘干。但 切勿靠火焰以免烤焦标本。
3 固定：火焰固定。 固定的作用：杀死细菌；使细菌与玻片粘附牢固；
以辅助鉴别细菌。
细菌染色多采用碱性染料如美蓝、碱性复红、 结晶紫等，原因在于：
1、细菌蛋白质是两性电解质，等电点较低， 在pI2-5之间。故在近于中性的环境中，细菌多带
负电荷，易与带正电荷的碱性染料结合。
2、细菌胞质中含有大量呈酸性的RNA，也与碱
性染料有亲和性。
细菌的染色方法 单染和复染
单染：用一种染料进行染色