利用转座子标签法构建埃氏巨型球菌乙酸生成关键酶基因

利用转座子标签法构建埃氏巨型球菌乙酸生成关键酶基因缺失工程菌刘国文1，2,崔晓霞1,逄晓阳1,杨文艳1，王哲1*（1、吉林大学农学部畜牧兽医学院，吉林 长春 130062；2、内蒙古民族大学动物科技学院， 内蒙古 通辽 028042；）摘要：应用转座子标签法，通过转座子供体菌E.coli S17-1/pZJ25∷Tn5对受体菌埃氏巨型球菌进行转座子诱变，采用含卡那霉素和氟乙酸纳的选择性培养基筛选接合子，共筛选出稳定的对卡那霉素和氟乙酸具有抗性的转座工程菌9株。

对埃氏巨型球菌的突变株进行 16S rRNA和Tn5的PCR鉴定，及乙酸激酶（AK）和磷酸转乙酰酶（PTA）酶比活力分析，确定突变株属于pta基因缺失型氟乙酸抗性菌株。

关键词：埃氏巨型球菌 转座子 氟乙酸 磷酸转乙酰酶 乙酸激酶埃氏巨型球菌（Megasphaera elsdenii）是奶牛瘤胃内一种常见的革兰氏阴性乳酸发酵菌，它能发酵很多种不同的可溶性碳水化合物，利用丙烯酸途径将乳酸分解为丙酸，或者经乙酰辅酶A途径在乙酸激酶（AK）和磷酸转乙酰酶（PTA）的作用下生成乙酸[1]。

奶牛在妊娠后期和泌乳初期及疾病状态下，瘤胃内发酵菌的数量和比例发生改变，使丙酸生成减少，而乙酸生成增加[2]。

恢复和重建瘤胃微生物区系，不仅可增强围产期奶牛的消化功能，增加采食量，还可提高生糖先质丙酸的生成量，纠正或缓解围产期奶牛能量负平衡。

从细菌的代谢途径分析, AK－PTA途径是菌体产生乙酸的主要途径[3]。

运用转座子标签法，通过切断细胞代谢网络上产生乙酸的途径，来调整代谢过程中碳源的流向，达到增加丙酸产量或比例的目的。

本研究采用转座子标签法，以健康奶牛瘤胃中分离的埃氏巨型球菌为受体菌，以大肠杆菌E.coli S17-1/pZJ25∷Tn5作为供体菌进行转座子Tn5诱变,通过选择性平板，筛选转结合子中ack或pta基因缺失的菌株，构建乙酸生成关键酶基因缺失工程菌。

1材料与方法1.1供试菌株 受体菌埃氏巨型球菌H6本课题组从健康奶牛瘤胃中分离。

供体菌E.coli S17-1/pZJ25∷Tn5由南京农业大学王金生教授惠赠。

1.2 工具酶与生化试剂Ex Taq聚合酶（5U/μL），DNA Marker，dNTPs（2.5mM）均购自TaKaRa 公司；DNA回收纯化试剂盒购于杭州维特洁生物技术公司；SDS、Tris、夹竹桃霉素、氯化血红素、维生素K等购自Sigma公司，蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司。

1.3 各种培养基的配制 ①VS厌氧血琼脂（100mL）：胰蛋白胨0.5g，酵母提取物0.3 g，硫乙醇酸钠0.075g，吐温-80 0.1g，0.1%煌绿0.1mL，50%乳酸钠2.5mL，琼脂2.0g，蒸馏水93mL高压灭菌（121℃ 20min），冷却至40℃时加入1%夹竹桃霉素0.3mL和脱纤维羊血7.5mL，而后铺平板。

②埃氏巨型球菌营养液：酵母提取物 4.0g，乳酸钠（60%）16mL，硫乙醇酸钠0.45g，K2HPO4 1.6g，K2HPO43.2g，NH4Cl 0.5g，CaCl20.2g，MgCl20.2g，琼脂1.0g，加蒸馏水至1000mL，调pH值至7.0，在N2下分装，121℃高压灭菌15min，而后冷却后放入4℃冰箱备用。

1.4 受体菌对卡那霉素、氟乙酸钠不同浓度敏感性的测定 用微量加样器吸取109cell/mL的基金项目：国家自然科学基金重点资助项目（30230260）作者简介：刘国文（1973-），男，副教授，在站博士后，主要从事动物营养代谢病的研究。

*通讯作者受体菌悬液200μL，分别加入到含10,20,30,40,50μg/mL卡那霉素的选择性的VS厌氧血琼脂平板上，并涂布均匀。

每个菌设置3个重复。

于37℃，厌氧环境中培养48h后，测定受体菌对卡那霉素敏感的最低浓度。

用微量加样器吸取109cell/mL的受体菌悬液200μL，分别加入到含10,25,50mmol/L氟乙酸钠的选择性的VS厌氧血琼脂平板上，并涂布均匀。

每个菌设置3个重复。

于37℃，厌氧环境中培养48h后，测定受体菌对氟乙酸敏感的最低浓度。

1.5 选择性筛选平板的制备 胰蛋白胨 5ｇ/Ｌ，酵母提取物3ｇ/Ｌ，硫乙醇酸钠0.75ｇ/Ｌ，蔗糖100ｇ/Ｌ，吐温-80 1ｇ/Ｌ，琼脂20ｇ/Ｌ，0.1%煌绿1mL/L， 50%乳酸钠25mL/L，1%夹竹桃霉素3mL/L，脱纤维羊血75mL/L，蒸馏水910mL。

高压灭菌，冷却至40℃时加入夹竹桃霉素和脱纤维羊血，而后铺平板。

1.6 埃氏巨型球菌的Tn5转座子诱变[4] 供体菌E.coli S17－1/pZJ25∷Tn5用LB培养液37℃培养12h，受体菌用埃氏巨型球菌营养液37℃培养48h。

取对数生长期的供体菌和受体菌分别装入Eppendorf管中。

10000rpm，离心1min，弃上清液后分别用1mL生理盐水悬浮，然后将供体菌和受体菌按1∶1混合于微量离心管中，10000rpm，离心1min，弃上清液后再用200μL生理盐水孵育30min后，取混合液200μL涂布在不含抗生素的VS厌氧血琼脂平板上，37℃培养48h。

挑取一接种环菌体转移到生理盐水中，10倍稀释后按每皿200μL涂布在选择性VS厌氧血琼脂平板（含10%蔗糖、50μg/mL卡那霉素、50mmol/L氟乙酸）上，37℃培养48h，在选择性培养基上长出的菌落即为接合子。

取转接合子在选择性VS厌氧血琼脂平板上连续划线纯培养三次，筛选出稳定的对氟乙酸具有抗性的转座工程菌。

同时在选择性培养基上仅涂布受体菌作对照。

1.7 转座工程菌的分子生物学检测1.7.1转座工程菌基因组的制备 采用杭州维特洁（V-gene）生物技术公司的细菌基因组小量制备试剂盒。

1.7.2 转座工程菌中16S rRNA基因的PCR检测 根据GenBank中埃氏巨型球菌（AY196919）的序列设计引物，正链：5’ACG GGT GAG TAA CGC GTA AGC AAC CT 3’；反链：5’GCC CCG CAC TTT TAA GAC CGA CTT AC 3’。

PCR反应体系为（25µL）：ddH2O 15.5µL；10×Taq-buffer2.5µL；dNTPs Mixture（各2.5mM） 4.0µL；上、下游引物（10pM）各1.0 µL；Ex Taq酶（5U/μL）0.2 µL；temperate DNA 1.0µL。

反应程序为：95℃预变性3min，然后按94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环，最后72℃ 10min。

1.7.3 转座工程菌中转座子Tn5的PCR检测 PCR法可以快速有效地确定外源基因是否整合到了宿主的基因组中[5],由于Tn5带有抗生素基因—卡那霉素，而且其序列已知，因此可以根据这一序列设计寡核苷酸引物，检测转座工程菌的基因组中是否有Tn5插入。

通过GeneBank设计正链引物:5’GGT GCC CTG AAT GAA CTG 3’；Tn5反链引物P2:5’TAG CCA ACG CTA TGT CCT 3’；扩增条件为94℃先变性3min，然后按94℃,15sec，60℃ 15sec，72℃ 1min，30个循环，最后72℃延伸5min。

1.8 酶的活性分析 取50ml指数生长中期的菌液(OD600~1.8)，水洗三次后用15 mL 25 mM Tris/HCl 缓冲液(pH 7.4)混悬，将细胞悬液进行超声处理破碎细胞壁12分钟，10000rpm离心破碎液1小时（4℃），取上清液进行酶活测定。

磷酸转乙酰酶（PTA）按Andersch（1983）法[6]进行测定，乙酸激酶（AK）按Allen（1964）法[7]进行测定。

测定液中蛋白的定量采用南京建成生物试剂公司的蛋白定量试剂盒进行测定。

2 结果2.1埃氏巨型球菌对卡那霉素、氟乙酸浓度敏感性测定结果表1 受体菌对卡那霉素、氟乙酸浓度敏感性测定结果 Table 1 Sensibitity of strains on Kanamycin and sodium fluoroacetate卡那霉素浓度（μg/ mL） 氟乙酸浓度（mmol/L）菌株10 20 30 40 50 10 25 50受体菌 ＋ － － － － ＋ － －供体菌 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － 从结果可看出，受体菌只能在含10μg/ mL卡那霉素的培养基上生长，浓度进一步增大，受体菌则全部死亡，而供体菌受卡那霉素影响较小，它甚至在50μg/ mL的浓度下也能生长良好。

因此，将选择性培养基中卡那霉素的浓度设计为50μg/ mL。

在含10 mmol/L氟乙酸的培养基上，受体菌和供体菌S17均能生长，而在50mmol/L氟乙酸的培养基上，受体菌和供体菌S17均敏感，不能生长。

因此，将选择性培养基中氟乙酸的浓度设计为50mmol/L。

2.2 Tn5转座子诱变结果 通过供体菌E.coli S17－1/pZJ25∷Tn5与受体菌的转座子诱变，采用选择性培养基，共筛选出稳定的对氟乙酸具有抗性的转座工程菌9株。

取其中1株工程菌命名为TnH6。

对TnH6进行分子生物学鉴定。

2.3 转座工程菌中16S rRNA基因的PCR检测结果 根据GenBank中埃氏巨型球菌（AY196919）的序列设计引物，运用16S rRNA PCR法对转座工程菌TnH6进行PCR鉴定，结果见图1。

1 2图1 TnH6的PCR鉴定结果电泳图谱Fig1 Identification of TnH6 strain byPCR.1 DL-2000 DNA Marker511bp2 转座工程菌TnH6 PCR鉴定结果将目的基因片段回收、克隆测序后，与GeneBank中的埃氏巨型球菌（AY196919）16s rRNA 序列作比对，同源性达到96.8%，证实所获得的转座工程菌TnH6是由埃氏巨型球菌H6经转座子诱变形成。

2.4 转座工程菌中转座子Tn5的PCR检测结果 从图2可见，1为原始的H6菌株，基因组中无Tn5序列，所以无目的带。

3为转座子Tn5诱变后的TnH6转座工程菌株，在500bp处出现目的带，表明Tn5确实插入到了TnH6转座工程菌基因组中。

4为大肠杆菌S17-1阳性对照。

5为空白对照，表明此PCR无污染，结果可信。

1 2 3 4 5图2 H6突变工程菌的Tn5鉴定结果电泳图谱Fig2 Identification of H6engineering Bacteria Tn5 by PCR1H6菌株（阴性）；2 DL-2000bp DNA Marker；3 TnH6菌株；4 S17－1/pZJ25∷Tn5（阳性）5 H2O（空白）500bp将目的基因回收、克隆测序后，与供体菌E.coli S17－1/pZJ25∷Tn5 中的Tn5转座子序列作比对，同源性达到99.4%。