转座子标签法克隆分离植物基因的研究进展
4.植物基因克隆技术进展
1 功能克隆
功能克隆（Functional Cloning）就是从蛋白质的功 能着手进行基因克隆，是人类采用的第一个克隆 基因的策略。 其基本步骤为：根据已知的生化缺陷或特征确认 与该功能有关的蛋白质，分离纯化蛋白并测定出 部分氨基酸序列 – 根据遗传密码推测其可能的编码序列，设列 – 或者使用该蛋白质对选中的克隆测序，获得目的基 因的序列
1 功能克隆
关键技术： 用这一策略克隆基因的关键在于必须首先分离出一 个纯的蛋白，测定出其一部分氨基酸序列或选 • 例如与苯丙酮尿症相关的酪氨酸羟化酶基因， 与镰刀型细胞贫血症相关的珠蛋白基因，都是 用这种方法取得成功例子。
dna代表性差异分析dnarepresentatioaldifferenceanalysisdnarda抑制性消减杂交法suppressionsubtractivehybridizationsshcdnaaflp技术rna指纹技术等目前用这些方法已经相继克隆了许多基因6基因芯片技术genechips?基因芯片又称dna芯片dna微阵列dnamicroarray是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针有规律地排列固定于支持物上然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测从而迅速得出所要的信息
3 转座子标签法
• 随着农杆菌介导转座子导入目标植物系统建成后， 目前已在拟南芥、番茄、水稻中有广泛的运用。 • 同时，随着拟南芥、水稻等模式植物的基因组测 序完成，研究的热点转向功能基因组，转座子标 签技术己经成为构建植物突变体库，进行基因功 能研究的核心技术。
4 同源序列法
• 同源序列法是根据与待克隆基因同源的已知序列 进行基因克隆的方法。目前很多植物基因序列已 知，当要克隆类似基因时可先从Genbank 库中找 到有关基因序列，设计出特异引物；以植物基因 组DNA 或者cDNA为模板， 采取PCR 或RT-PCR 的方法来扩增目的基因；扩增的片段经纯化后， 连接到合适的载体上，进行序列分析、比较验证 并确认目的基因的克隆。 • 优点：利用PCR 技术，快速、简便。非常大的成 功 • 局限性：依赖于已知的序列
植物抗病基因作用机理及克隆研究进展
植物抗病基因作用机理及克隆研究进展袁亮1,2,张伟彬1,2(1.商丘职业技术学院农学系,河南商丘476000;2.安徽农业大学研究生学院,安徽合肥230069)摘要 综述了植物抗病基因作用机理及抗病蛋白的类别,介绍了克隆植物抗病基因的不同方法,同时对植物抗病基因克隆提出了展望。
关键词 植物抗病基因;作用机理;同源结构域;克隆中图分类号 S432.2+3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)04-01513-03Functi onalM echanis m a nd Cloni ng of P l ant D isease resi stance Gene YUAN L i ang et al (D epart ment ofA gronomy ,Shangqiu Vocati onal College of Technology ,Shangqiu ,H enan 476000)Abstract The f uncti ona lmechanis m and cl asses of pl ant disease resistance genes were s u m up .The vari ed clone methods of p l ant di sease resistance genes were i ntroduced and the outl ook o f cl one pl ant disease resistance genes was put for ward .K ey words P lant d i sease resi st ance gene ;Functi ona lmechanis m;Conservati ve doma i n ;C l one作者简介 袁亮(1982-),男,安徽涡阳人,在读硕士,助教,从事农业生物技术方面的研究。
收稿日期 2008 11 12随着世界人口的迅速增长,粮食问题已成为人类生存的关键问题。
转座子
报告人：赵红玉 小组成员：戎玲玲 夏丹萍 俞锞
• • • • • • •
一转座子的概述 二转座子的结构和类型 三转座子标签法分离植物基因的原理 四转座子标签法克隆基因的方法 五转座子标签法分离植物基因的优点 六转座子在其他方面上的应用 七转座子研究的前景展望
一转座子的概述
五转座子标签法分离植物基因的优点
• 与T-DNA标签法相比,转座子标签法分离植物基因 存在几大优势: • (1)转座子插入引起的突变由于转座子的切离而回 复; • (2)转座子转座多发生在其邻近的位点,这样就可以 用来标签感兴趣的基因; • (3)转座子导入异源植物不受转化条件的限制; • (4)通过构建不同含Ac和Ds转座子的株系,通过不 同株系之间的自交和杂交,产生较大的含有不同插 入位点的转座子群体,有利于克隆多个植物基因。
（四）生态环境污染的生物修复
• 由于基因的可变性及转座子的遗传调 控,许多微生物能够利用人工合成的化 学物质,与微生物分解代谢相关的基因 往往与插入元件相连。当环境污染时, 转座子转移频率提高,增加了微生物种 群的生物降解潜力。
七前景展望
• 反转录转座子具有存在广泛、拷贝数高、 插入位点专一、产生的突变稳定、不受植 物种类差异的影响、异源转座率高、组织 培养诱导激活等优势,尤其是经实践证明,转 座子标签法是目前分离植物基因的有效手 段之一。 • 但是,植物转座子主要来源于玉米、水稻等 草本植物,相应地,应用转座子分离基因的成 功实例也基本局限于草本植物。
• 随着目前转座子应用中存在的缺陷被逐步 克服,转座子将会在研究植物基因组的组成、 表达调控、进化、系统发育、生物多样性 评价以及林木基因工程等领域内发挥越来 越重要的作用。
三转座子标签法分离植物基因的原理
转座子的研究进展
转座子及其相关技术的研究摘要：转座子是一类在细菌的染色体,质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分,是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列，转录组的活动对生物体基因组的转录以及演变存在着严重影响，本文就转座子的基因机理及特征、转座子沉默、转座子的标签技术以及其在植物中的运用进行阐述。
转座子是存在于DNA上可自主复制和移位的基本单位。
MclCintockl’嗜次在玉米中的发现改变了人们对基因组序列稳定性的认识，打破了遗传物质在染色体上呈线性固定排列的传统理论。
目前认为，多数生物体有自发突变且有重要表型效应出现的原因源于转座子的可动性，并且可以导致宿主基因组发生从点突变到染色体重排的一系列变化，转座子在进化上为建立宿主基因特性起着重要作用。
1.转座子特征与分类基因转座时发生的插入作用中受体分子都有一段3-12bp的靶序列DNA会自我复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。
转座子可以分为两大类：以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子。
第一类转座子可以通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段,重新插入基因组DNA中。
第二类转座子又称为返座元，在结构和复制上与反转录病毒类似，它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座。
2转座子相关技术2.1转座子分离方法有4种方法用来分离转座子:(l)转座子诱捕法，此法适用于分离具有相当高的整合和切割频率的转座子。
(2)Southern杂交法，此种方法需要有适当的探针，用于检测已知的转座子。
(3)重复DNA序列鉴定法，适用于高拷贝数的无论是否有活性的转座子。
(4)PcR扩增法，对己知序列的转座子可以设计引物直接PCR扩增。
2.2转座子标签技术转座子标签技术是根据转座子随机插入引起突变的特性而发展起来的分离未知基因的方法。
转座子整合进入启动子或编码区，使基因突变失活并产生一种新的表型，再根据转座子上设计的已知序列标签克隆失活的基因，分离转座子和突变基因的侧翼区鉴定该基因，是定向研究基因的有效方法。
转座子及其应用研究进展
转座子及其应用研究进展转座子是一种可以移动DNA序列的基因元件，同时也是基因工程中极其重要的技术工具之一。
鉴于它极其灵活的技术性和应用广泛性，自问世以来，一直备受科研人员的青睐和热情追捧。
在转座子的发现和应用进程中，有很多科学研究的成果和技术进展，为了更好地了解转座子及其应用领域的前沿研究情况，本篇文章将对其发展历程和应用研究进展进行概述。
1. 转座子的发现和进化转座子又叫跳跃基因，是指一种具有自我移动能力和自我克隆能力的DNA序列。
它广泛存在于生物界，从单细胞生物到哺乳动物都有它的足迹，对生物进化的角色也十分重要。
转座子最早发现于玉米中，其结构上的一些共性特征比如重复序列、反转录酶等使得它们被归于同一个家族，并被命名为“反转录转座子”。
进一步的研究使得人们发现，不同的转座子家族具有不同的结构特征和生物学功能。
随着技术的不断提高，越来越多的转座子被发现和鉴定，因此研究对象也不限于玉米等模式生物体系，而是包括了更高等级的生物，如细菌、酵母菌、果蝇、线虫、小鼠等，对转座子的探索也因此进入了一个全新的阶段。
2. 转座子在基因工程中的应用转座子具有很多优点，比如具备可重复性、高效率、精确性和广泛的适用性等特点。
这使得它在基因工程中成为了一种得力的利器。
一些应用研究已经表明，转座子系统可用于瞬间转移外源DNA到多种生物体中，并实现可控的、稳定的基因表达。
比如，转座子技术被应用于真菌、哺乳动物等体内外的基因转移和疾病治疗等多个项目中。
另外，转座子还广泛应用于基因编辑、肿瘤治疗、新药研发、农业生产和环境修复等领域。
转座子还可以用于基因靶向和剪接，基于基因编辑的基因测序技术最近引起了极大的关注。
它基本上是一种使用DNA剪切工具在细胞中添加或删除基因的方法，现已得到了广泛的应用。
因此，转座子在基因编辑中已有广泛的应用，尤其是在人体水平的基因编辑中，其发展前景可以说广阔无边。
3. 转座子在亚洲的研究我们现在已经了解转座子的发展历程和应用范围，我们进一步了解一下以亚洲为代表的一些转座子相关研究。
农业生物实用技术试题(参考答案)
农业生物实用技术试题1.请阐述细胞全能性与植物组织培养的关系。
（10分）答：植物细胞全能性（totipotency）：指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。
在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。
植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。
植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。
器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
2.原生质体杂种细胞的筛选方法。
（10分）答：杂种细胞的筛选方法有：①细胞系互补的选择方法，包括叶绿素缺失互补、营养缺陷互补和抗性互补等；②利用物理特异性差异的选择方法：这是利用两个原生质体物理特异性差异的一种选择，包括原生质体的大小、颜色、浮密度等的不同来选择；③利用生长特异性差异的选择方法。
3. 简单说明DNA重组技术中的蓝白斑筛选原理。
（10分）答：蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。
现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA 的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
转座子在基因工程中应用的研究进展
全基因组序列分析
斑马鱼 Danio rerio
全基因组序列分析
血红丛赤壳菌 Nectria haematococca
全基因组序列分析
水稻 Oryza sativa
全基因组序列分析
大豆疫霉菌 Phytophthora sojae
全基因组序列分析
家鼠 Rattus spp
全基因组序列分析
海胆 Strongylocentrotus purpuratus
1
反转录转座子不同于转座子，是以DNA-RNA-DNA的途径来实现转座，在整合酶的作用下，将新 生成的以DNA状态存在的反转录转座子整合到宿主基因组中。这样，反转录转座子在宿主基因组中的 拷贝数得到不断积累，从而使基因组增大。由于反转录转座子带有增强子、启动子等调控元件，所以 会影响宿主基因的表达。在生物进化过程中，反转录转座子起着不可忽视的作用。根据是否具有编码 反转录酶的能力，反转录转座子可分为两个家族: 自主性反转录转座子和非自主性反转录转座子；按 照序列结构中有无长末端重复序列(LTR) 又可分为有LTR反转录转座子和无LTR反转录转座子。自主 性反转录转座子包括内源性反转录病毒(ERV) 、LTR反转录转座子及长散在元件(LINEs)；非自主性反 转录转座子包括短散在元件(SINEs) 及修饰性反转录假基因(刘冬，2008)。
赤拟谷盗 Tribolium castaneum
全基因组序列分析
银锭夜蛾 Macdunnoughia crassisigna
同源克隆
表 1 来源：王建军，等，2009。
与其他转座子相比，piggyBac 转座子在昆虫纲中分布较少，但其却能在亲缘关系较远的物种中发
挥作用。目前，利用 piggyBac 转座子已经成功获得了多种转基因昆虫(表 2)。
转座子标签技术是利用转座子作探针克隆出突变基因
转座子标签技术是利用转座子作探针克隆出突变基因，再用突变基因做探针，从野生型个体中分离并克隆出野生型基因，最终得到完整的基因的技术方法。
转座子标签（transposon tagging）技术是研究功能基因的有效的工具之一。
转座子标签法不但可以通过上述转座突变分离基因，而且当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时，还会由于T-DNA整合到染色体中引起插入突变，并进而分离基因，因此大大提高了分离基因的效率。
转座子标签(transposon tagging)技术是研究功能基因的有效的工具之一。
转座子标签技术克隆基因的基本原理：转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。
当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得一恢复。
遗传分析可确定某基因的突变是否由转座子引起。
由转座子引起的突变便可以转座子DNA为探针，从突变株的基因组文库中钓出含该转座子的DNA片段。
并获得含有部分突变株DNA序列的克隆，进而以该DNA为探针。
筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。
根据转录因子的作用特点可分为二类；第一类为普遍转录因子它们与RNA聚合酶Ⅱ共同组成转录起始复合物，转录才能在正确的位置开始。
TFⅡD以外，还发现TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它们在转录起始复合物组装的不同阶段起作用。
第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子，这此TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。
人类Ⅱ型基因的转录因子因子分子量功能RNAPolⅡ≥10K依赖模板合成RNATFⅡA 12, 19, 35K 稳定TFⅡD和DNA的结合，激活TBP亚基TFⅡB 33K 结合模板链（-10～+10），起始PolⅡ结合，和TFⅡE/F相互作用TFⅡD (TBP, 30K) T BP亚基识别TATA，将聚合酶组入复合体中，TAFs识别特殊启动子TFⅡE 34K(β),57K(α)结合在PolⅡ的前部，使复合体的保护区延伸到下游TFⅡF 38, 74K 大亚基具解旋酶活性（RAP74）,小亚基和PolⅡ结合，介导其加入复合体TFⅡH 具激酶活性，可以磷酸化PolⅡC端的CTD，使PolⅡ逸出，延伸TFⅡI 120K 识别Inr，起始TFⅡF/D结合TFⅡJ 在TFⅡF后加入复合体，不改变DNA的结合方式TFⅡS RNA合成延伸TBP作为第一个和DNA接触的因子十分引人注目，有是它被看成是一种“束缚”因子（commitment factor）其实是和RNA pol Ⅱ结合，使启动子转录，它起到介导的作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
转座子标签法克隆分离植物基因的研究进展胡英考(首都师范大学生物系,北京100037)摘 要: 转座子标签法是克隆与分离植物基因的一项十分有效的方法。
概述了转座子标签技术克隆与分离植物基因的基本原理与方法,介绍了可用于转座子标签技术的转座子,对于转座子标签系统以及在克隆与分离异源植物基因方面的主要成就进行了综述,并对将来的研究方向进行了讨论。
关键词: 转座子 转座子标签 基因克隆Progress of Plant G enes Cloning and Isolationby T ransposon T aggingHu Y ingkao(Biology Depart ment of Capital Normal U niversity,Beiji ng100037)Abstract: Transposon tagging is an effective method for plant gene cloning and isolation.The principle and proce2 dure of transposon tagging are summarized and the trans poson used for plant gene cloning and isolation are introduced in this paper.The progress of transposon tagging system and alloplant gene cloning and isolation were reviewed.The per2 spective of transposon tagging was also discussed.K ey words: Transposon Transposon tagging G ene cloning 分子生物学的迅速发展,为人们提供了许多分离植物基因的有效方法。
传统上,可根据已知基因的产物推测其相应的核苷酸序列,再据此序列合成寡核苷酸探针,从cDNA文库或基因组文库中钓取目的基因,此即所谓的功能克隆(functional cloning)。
近年来,表型克隆(phenotypical cloning)发展十分迅速,它是根据材料间表型的差异,来克隆引起这种差异的基因的方法。
但是,在大多数情况下,我们既不知道基因的表达产物,又没有适宜的相对表型用于表型克隆,此时最常用的基因克隆技术是图位克隆(map2based cloning or positional cloning)[1]和转座子标签(transposon tagging)技术[2]。
以下仅对转座子标签技术在植物基因克隆中的研究进展作一综述。
1 转座子标签法克隆植物基因的原理与方法转座子(transposon)又称转座因子或移动因子,最早在1951年由美国遗传学家McClintock在研究玉米籽粒色斑不稳定现象而提出来的,但该概念直到1967年在大肠杆菌中发现插入序列这类转座因子后才被普遍承认和接受,现在我们知道,转座子在生物界是普遍存在的。
转座子是染色体上一段可以移动的DNA序列,它可以从一个基因座位转移到另一个基因座位,当转座子插入到某个功能基因内部或邻近位点时,就会使插入位置的基因失活并诱导产生突变型,通过遗传分析可以确定某基因的突变是否由转座子引起,由转座子引起的突变可用转座子DNA为探针,从突变株的基因组文库中钓取含该转座子的DNA 片段,获得含有部分突变株DNA序列的克隆,然后以该DNA序列为探针,筛选野生型植株的基因组文库,最终得到完整的目的基因[3]。
在转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时,由于T2DNA整合到基因组所引起的插入突变,也可用上述原理来克隆基因,这样就大大提高了分离基因的效率。
利用转座子标签法分离植物基因的主要步骤如下:(1)构建含转座子的质粒载体;(2)将含转座子的质粒载体通过农杆菌介导或其他适当的转化方法导生物技术通报・综述与专论・ B IO TEC HNOL O G Y BULL ETIN 2003年第2期入目标植物中;(3)转座子插入突变的鉴定与分离;(4)转座子在目标植物体内的活动性能检测;(5)利用转座子序列作探针,与突变体基因组文库杂交,获得部分基因序列;(6)用部分基因序列作探针,与野生型基因组文库杂交,分离出完整的目的基因。
2 用于植物基因克隆的转座子根据DNA的结构和转座的机理,可将转座子分为两大类:转座子和逆转座子(retroposon)。
转座子是基于DNA2DNA的转座过程,是最早发现的一类转座子因子,包括细菌的插入序列(insertion se2 quence)、复合转座子(composite transposon)、TnA转座子家族(Tn A family)、可转移噬菌体(transposable phage)等,还包括真核生物中果蝇的P成分、FB (foldback)成分和玉米的Ac/Ds(Activator/dissocia2 tion)、En/Spm(Enhancer/suppressor mutator)系统等。
目前研究得比较清楚且应用较多的是玉米的Ac/Ds、En/Spm和金鱼草的Tam3转座子。
植物中转座子的结构类似于细菌的复合转座成分,如Ac/ Ds,Ac全长为4.5kb,两端为11bp反向重复序列; Ds大小为0.4～4kb,一般认为Ds是Ac缺失的结果[4],Ac单独存在便可引起突变,但变异不稳定,Ds 在有Ac存在的条件下,才会引起插入突变。
逆转座子的转座过程是基于DNA2RNA2DNA 的转录和逆转录过程,最早是在动物和酵母的基因组中发现的,如酵母的Ty(transposable element in yeast)因子、果蝇的copia因子等。
近年来的研究表明,逆转座子几乎存在于所有植物的基因组中,并且是基因组中一个很大的组成部分,其增殖以RNA 为中介,且拷贝数较多[7]。
在通常情况下,逆转座子受到严格控制,在胁迫情况下,可被激活,但果蝇和酵母的逆转座子在正常的生命周期中就具有活性,烟草的逆转座子也可在拟南芥中转座[5]。
根据转座子分离植物基因的物种范围的不同,可将转座子标签法分为两大类:一类是利用内源转座子来分离同源寄生植物的基因,即同源转座子标签技术(homologous transposon tagging),这就需要从分子水平上研究新的更多的植物内源转座子,以便于同源寄生植物的基因克隆。
目前,玉米的Ac/ Ds、En/Spm和金鱼草的Tam3转座子在分离内源植物基因方面已取得了令人瞩目的成就[6]。
另一类是利用已经在分子水平上研究较清楚的转座子系统,如玉米的Ac/Ds、En/Spm及金鱼草的Tam3等来分离异源植物基因,即异源转座子标签技术(het2 erologous transposon tagging),这一技术已成为植物基因分离技术中的一个热点。
3 转座子标签法分离异源植物基因的主要成就采用异源转座子标签技术来分离植物基因,首先必须研究清楚转座子在异源植物中的转座活性;其次,需要建立一个切实可行的异源转座子标签系统。
3.1 转座子标签系统的发展最初用于植物基因克隆的都是含有完整转座子序列的自主转座子,且分离的大都是同源寄生植物的基因,后来发现自主转座子在异源植物中也表现转座,并且利用他们在异源植物中分离到了有关基因,这一系统称为单转座子标签系统(one2element system)。
Chuck等[7]利用玉米的Ac因子转化矮牵牛,使花朵颜色由完全紫色变为出现白色花斑。
分析表明,这是由于玉米的Ac因子插入到矮牵牛p H6基因内部造成的,而p H6基因的功能是影响花冠细胞的酸碱度。
单转座子标签系统的优点是转座效率较高,但由于使用的是自主转座子,所以转座子很容易从插入位点切离,使突变恢复或产生新的变异,这种变异的不稳定性,使人们无法有效地克隆基因。
为克服这一缺点,人们又设计了双转座子标签系统。
以玉米的Ac/Ds转座子为例,Ac在玉米中是一个完整的转座子,编码转座酶的基因位于中间,两端为反向重复序列,可自行转座;Ds是Ac缺失了转座酶基因序列的剩余部分,其两端仍含有反向重复序列,Ds在有转座酶存在的情况下,可以转座。
根据以上特点,科学家构建了分别含有Ac(可合成转座酶,但缺少末端反向重复序列)和Ds(不能合成转座酶,但含有末端重复序列)的质粒载体,分别用于转化异源植物,通过转化植株的杂交(Ac×Ds),使Ac与Ds存在于一个个体中导致转座,其引起的突变既可以稳定遗传(Ac与Ds分离),又可再次转座引起新的突变(Ac与Ds存在于一个个体),利用Ac/Ds作探针,筛选突变株基因组文库,进而钓出与突变有关的基912003年第2期 胡英考:转座子标签法克隆分离植物基因的研究进展因。
利用Ac/Ds双转座子标签系统成功地分离了番茄的抗叶霉病基因Cf29[8];利用En/Spm系统也成功地分离了拟南芥的雄性不育基因M S2[9]。
双转座子标签系统虽然可提高转座频率,具有突变稳定的优点,但转座频率仍然偏低,突变筛选的工作量仍然较大,因此,一些改进的方法便应运而生。
研究表明,Ac转座频率低的主要原因是转座酶mRNA表达水平太低,而Ac的两个末端重复序列中间可插入任意的DNA序列,因此可以用强启动子代替Ac转座酶自身的启动子,这样既能保证转座的发生,又能提高转座频率。
利用启动子陷阱,可以通过报告基因的表达来直接判断转座子的转座情况。
Nussaume等[10]将转座子与GUS基因紧密连锁地构建在一个载体中,但不含启动子,当转座子插入到编码基因内部时,GUS基因才会表达,这时可用PCR的方法扩增出插入位点的侧翼序列,进而得到完整的基因编码序列,并根据表型判断基因的功能。
利用基因陷阱或增强子搜寻等,将为转座子标签法提供更加简便有效的方法。
Venkatesan等[11]在双转座子标签系统中增加了IAAH基因,以对发生Ds转座的植株进行选择。
当Ds未转座或转座到与IAAH紧密连锁的位点时,自交后的Ds与IAAH 仍表现连锁,由于IAAH催化NAM转化为NAA,所以植株表现为NAM敏感;当Ds转座到距IAAH 较远的位置或其它染色体上时,自交后Ds与IAAH 可发生分离,获得无IAAH基因的插入突变纯合子,此时植株由于无IAAH存在,对NAM不敏感,从而达到选择的目的。
另外,将Ds与特异重组系统Cre/lox结合起来,可大大提高突变率和引起位点特异性突变[12]。
表1 转座子标签法克隆的异源植物基因[13～20]物种基因名称基因功能转座子拟南芥MS2雄性不育En/Spm CA O叶绿素a/b结合蛋白Ac/DsS A P花形态发育En/SpmS S R16胚缺损致死Ac/DsEDS1抗病Ac/DsDRL1花形态发生Ac/DsFA E1脂肪酸链延长Ac/Dsalb3白化苗Ac/DsA NL2花色素合成En/SpmFD H表皮细胞分裂En/SpmS V P控制开花时间Ac/Ds 番茄Cf-4抗叶霉病Ac/Ds Dem胚与分生组织缺损Ac/DsFB花青素积累,玻璃苗,除草剂敏感Ac/DsCf-9抗叶霉病Ac/DsXa-1叶绿体发育Ac矮牵牛PH6影响花冠细胞酸碱度Ac an2花色素合成En/Spmnam无顶端分生组织En/Spm 烟草N抗花叶病毒侵染Ac S u减少叶绿素积累Ac/DsABA2脱落酸合成Ac/Ds 亚麻L6抗锈病Ac/Ds3.2 转座子标签法克隆的异源植物基因迄今为止,利用转座子标签法克隆到的异源植物基因见表1。