洁净室区沉降菌的测规程
沉降菌检测操作规程
●1、目的规范洁净区和洁净室沉降菌测试条件和测试方法。
●2、适用范围适用于公司洁净区、洁净室或局部空气净化区域（如：洁净工作台）的沉降菌的测试和环境验证。
●3、引用文件⏹化妆品卫生规范-2007⏹GB/T 16294-2010 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法●4、定义⏹ 4.1 沉降菌：用本测试规定的方法收集空气中的活微生物粒子，通过专门的培养基，在适宜的生长条件下繁殖的可见菌落数。
⏹ 4.2 沉降菌菌落数：规定时间内每个平板培养皿收集到空气中沉降菌的数目，以（个/皿）表示●5、仪器和设备⏹ 5.1 灭菌培养皿90mm *15mm⏹ 5.2 培养基。
⏹ 5.3 恒温培养箱。
⏹ 5.4 高压灭菌器。
⏹ 5.5 放大镜●6、培养基和试剂⏹ 6.1 生理盐水：成份﹕氯化钠 8.5g蒸馏水加至 1000ml制法﹕溶解后﹐分装到加玻璃珠的三角瓶内﹐每瓶90ml﹐121℃（15 1b）2 0 mi n，高压灭菌。
⏹ 6.2 卵磷脂、吐温80—营养琼脂培养基6.2.1 成分：蛋白胨20g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15g卵磷脂1g吐温80 7g蒸馏水1000mL6.2.2制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80，将其他成分（除琼脂外）加到其余的蒸馏水中，溶解。
加入已溶解的卵磷脂、• 吐温80，混匀，调pH 值为7.1～7.4，加入琼脂，103.43kPa（121℃15 lb）20min 高压灭菌，储存于冷暗处备用。
●7、操作步骤⏹7.1 取样：7.1.1 取样点的设置：A) 最少取样点数：灌装间、制造间3个，其他洁净区2 个；B) 取样点的位置：取样点应均匀分布在待测试区域内，一般离地高度为0.8m左右，关键设备处可增加取样点；C）每个取样点一般取样一次，每次一般为2个取样皿；D) 布置采样点时，应避免回风口；7.1.2 取样时间：可采用动态取样和静态取样：A) 动态取样：正常生产，且空气净化系统正常运转30分钟后开始取样；B）静态取样：员工己撤离生产区域，且空气净化系统正常运转至少20分钟后；静态取样时人员不得多于2人；7.1.3 取样A）将制备好的培养皿逐个放置到采样点，然后从里到外逐个打开培养皿盖，使培养皿暴露在空气中；B）静态测试时，培养皿的暴露时间为30分钟以上；动态测试时，培养皿的暴露时间不得大于4个小时⏹7.2 置于37±1℃恒温培养箱内培养至少48小时，记录每个平皿的菌落数；●8、菌落计数方法：⏹8.1先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5 倍～10 倍的放大镜检查，以防遗漏；⏹每个测点的沉降菌总数为该测点所有培养皿菌落数的平均数；●9、结果评定：⏹9.1 每个测点的菌落数必需低于该洁净区的标准时判定符合要求；⏹9.2 静态测试时，如某测点的的菌落平均数超过标准，应再重新取样两次，两次都低于标准时才能判定符合；。
洁净室沉降菌测试标准操作规程
洁净室沉降菌测试标准操作规程1、菌落:细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落，简称CFU。
通常用个数表示。
2、测试方法:沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经48小时以上培养，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数，来评定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室的洁净度。
3、所用的仪器和设备1)高压消毒锅:使用时参照文件GZ-ZL-SOP-066-00进行操作。
2)恒温培养箱:必须定期对培养箱的温度计进行检定。
3)培养皿:一般采用中90mm×15mm硼硅酸玻璃培养皿。
使用前将培养皿置于121?湿热灭菌20分钟。
4、培养基:普通营养琼脂培养基。
将培养基加热熔化，冷却至约45?在无菌操作条件下将培养基注入培养皿，每皿约15m1。
待琼脂培养基凝固后，将培养基平皿放入30,35?恒温培养箱中培养数小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用，制备好的培养基平皿应在2,8?的环境中存放。
5、测试步骤1)采样方法:将已制备好的培养皿放置在预先确定的取样点，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖上盖后倒置。
2)培养，时间不少于48小时。
每批培养基应有对照试验，检查培养基本身是否污染，可每批选定3只培养皿作对照培养。
3)菌落计数:用肉眼直接计数，然后用5,10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数。
6、注意事项1)测试用具要做灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
2)采取一切措施防止人为对样本的污染。
3)对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
4)由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。
5)采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。
沉降菌检测操作规程
沉降菌检测操作规程编号：版本：编制：日期：审定：日期：批准：日期：生效日期：管理部门：发放部门：生产部 质管部 工程部 研发部 PMC 采购部 仓库 营销中心 人事行政中心 财务部1 适用范围适用洁净车间及无菌实验室沉降菌的动态及静态检测。
2 参考文件2.2 GB/T 16294-20103 职责3.1 实验员负责对洁净间及无菌实验室细菌进行检测。
4 测试方法4.1 方法概述本测试方法采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。
4.2 所用的仪器和设备4.2.1 高压消毒锅使用时应严格按照仪器说明书操作。
4.2.2 恒温培养箱必须定期对培养箱的温度计进行检定。
4.2.3 培养皿一般采用Æ90mm×15mm的硼硅酸玻璃培养皿。
4.2.4 培养基大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或沙氏培养基（SDA）4.3 测试步骤4.3.1 采样方法将已制备好的培养皿按5.4.4的要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。
4.3.2 培养4.3.2.1 全部采样结束后，将培养倒置于恒温培养箱中培养。
4.3.2.2 采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养基，在30℃～35℃培养箱中培养，时间不少于2d；采用沙氏培养基（SDA）配制的培养基，在20℃～25℃培养箱中培养，时间不少于5d。
4.3.2.3 每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。
可每批选定3只培养皿作对照培养。
4.3.3 菌落计数4.3.3.1 用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，有必要时用5～10倍放大镜检查进行检查。
5 测试规则5.1 测试状态5.1.1 沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。
药企洁净区沉降菌测定操作规程
范围：各生产车间、化验室。
责任人：质控部检验员。
正文：1 标准依据：ISO14644-1,新版《药品生产质量管理规范》。
2 微生物监测的标准：为评估无菌生产的微生物状况，应对微生物进行动态监测，监测方法有沉降菌法、定量空气浮游菌采样法和表面取样法（如：棉签擦拭法和接触碟法）等。
动态取样应避免对洁净区造成不良影响，对表面和操作人员的监测，应在关键操作完成后进行。
在正常的生产操作监测外，可在系统验证、清洁或消毒等操作完成后增加微生物监测。
2.1 微生物监测的动态标准洁净区微生物监测的动态标准如下：（2）单个沉降碟的暴露时间可以少于4小时，同一位置可使用多个沉降碟连续进行监测并累积计数。
3 测试方法3.1 方法概述本测试方法采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。
3.2 所用的仪器和设备3.2.1 高压消毒锅使用时应严格按照仪器标准操作维修保养规程。
3.2.2 恒温培养箱定期对培养箱进行检定。
3.2.3 培养皿一般采用 90mm×15mm的硼硅酸玻璃培养皿。
3.2.4 培养基普通肉汤琼脂培养基或其他药典认可的培养基。
其配制方法见附录A（标准的附录）。
3.3 测试步骤3.3.1 采样方法将已制备好的培养皿按4.4.1的要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。
3.3.2 培养3.3.2.1 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。
3.3.2.2 在30℃～35℃培养箱中培养，时间不少于48h。
3.3.2.3 每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。
可每批选定3只培养皿作对照培养。
3.3.3 菌落计数3.3.3.1 用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，不得遗漏。
洁净区沉降菌测试操作规程
范围：洁净区
职责：质量部、生产车间对本规程的实施负责
正文：
1.试剂及仪器、器皿
1.1试剂
——营养琼脂培养基
1.2仪器及器皿
1.3生化培养箱，Φ90mm培养皿、锥形瓶、胶塞、灭菌锅、烧杯等。
2.测试前准备
2.1培养基的配制
——按SOP-QM-424《培养基配制标准操作规程》进行。
2.2培养基平皿的制备
2.2.1将Φ90mm培养皿置于121℃湿热灭菌20分钟或180℃干热灭菌2小时。
2.2.2将培养基加热溶化，冷至45℃时，于无菌检查操作间将培养基注入平皿，每皿约15ml。
2.2.3待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于30℃-35℃生化培养箱中培养48小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用。
3.采样
3.1采样点的数目及采样点的布置
3.1.2.1采样点的布置力求均匀,避免采样点在某局部区域过于集中或过于稀疏，关键区域可增加采样点。
3.1.2.2采样点位置离地0.8-1.5米左右（略高于工作台面）
3.2采样方法：按3.1的要求放置平皿数，打开培养皿盖，使培养皿暴露30分钟，再将培养皿盖盖上。
4.培养
第1页共2页
所有采样结束后，将平皿倒置在30ºC—35ºC的生化培养箱中培养48小时。
5.操作结果的评价
5.1用肉眼直接计数并记录。
5.2结果计算
式中 M—平均菌落数（CFU）
M i—1，2，3……号平皿菌落数
n—平皿总数
5.3结果评价标准见下表：
测试结果均须合格。
第2页共2页。
洁净室(区)沉降菌的测规程
1 目的确定医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法和标准。
2 范围适用于不同洁净室（区）（包括洁净工作台）的沉降菌的测定和环境验证。
3 责任QC微生物室负责洁净室（区）沉降菌的监测。
4 内容4.1 参考标准中华人民共和国国家标准GB/T16294-2010《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》。
中华人民共和国卫生部发布的《药品生产质量管理规范（2010年修订）》。
4.2 监测程序4.2.1 设备高压消毒锅恒温培养箱培养皿：一般采用Φ90mm×15mm的硼硅酸玻璃培养皿。
4.2.2 培养基及平皿制备4.2.2.1 一般采用普通肉汤琼脂培养基或其他药典认可的培养基4.2.2.2 制备过程如下：◆将培养皿与用三角瓶装好的培养基在高压消毒锅内121℃湿热灭菌20 分钟或180℃干热灭菌2小时；◆将培养基加热溶化，冷至45℃时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。
◆待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于30－35℃恒温培养箱中培养48 小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用。
◆制备好的培养基平皿倒置在2－8℃的环境中存放，注意避免污染。
4.2.3 采样点和监测频次4.2.3.1 采样点的布置力求均匀，避免采样点在某局部区域过于集中，按照洁净区的面积大小，而制定最少采样点数目（附件），在满足最少采样点数的同时，还宜满足最少培养皿数和采样点布置（附件）。
4.2.3.2 工作区采样点的位置离地0.8米－1.5米左右（略高于工作面）。
并在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。
4.2.3.3 监测频次：每月一次，特殊情况及时监测。
4.2.4 测试规则4.2.4.1 沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度必须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。
4.2.4.2 测试前被测试洁净室（区）已经过消毒。
4.2.4.3 测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。
4.2.4.4 测试时间：◆对单向流（如A级净化房间及层流工作台），测试应在净化空调系统正常运行不少于10分钟后开始。
洁净区沉降菌培养检验操作规程
管理文件一、目的：规范洁净区沉降菌培养检验操作标准二、适用范围：洁净区沉降菌培养检验操作操作三、责任者：质量管理部四、内容：1.沉降菌培养1.1由QC人员将复核的培养皿转移至恒温培养箱；1.2培养前，培养箱温度应设为32℃或者22℃，1小时后检测培养箱温度是否恢复正常；1.3采用大豆酪蛋白琼脂培养基配制的培养皿时，在32℃的培养箱中培养，培养时间为2天；采用沙氏培养基配制的培养皿时，在22℃培养箱中培养，时间为5天；1.4培养时每天检测培养箱温度一次，以培养箱中温度计温度为准。
2.检测（菌落计数）2.1用肉眼对培养皿上所有菌落直接计数，专人复核是否计数有遗漏；2.2若平板上有2个或者2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数；2.3计数时一般用透射光对培养皿背面或正面仔细观察，不要漏记培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别。
必要时，用显微镜鉴别；2.4将所计数菌落进行记录，然后进行结果计算。
3.结果计算：3.1用计数方法得出各个培养皿的菌落数，按下式计算：式中：M——平均菌落数M 1——1号培养皿菌落数M——2号培养皿菌落数2Mn——n号培养皿菌落数N——培养皿总数3.2结果评定：3.2.1用平均菌落数判断洁净室（区）空气中微生物；3.2.2洁净室（区）内的平均菌落数必须低于所选定的评定标准；3.2.3若某洁净室（区）内的平均菌落数超过评定标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均须合格。
4.洁净区沉降菌检测标准：4.1洁净区沉降菌检测静态标准：4.2洁净区沉降菌检测动态标准：5.非主要工作区的其他洁净区域，静态测试频次为每半年测试一次，动态测试频次为每一年测试一次。
洁净室（区）沉降菌检测标准操作规程
洁净室（区）沉降菌检测标准操作规程⽬的制定标准的洁净室（区）沉降菌的测试⽅法，指导沉降菌的测试⼯作。
范围适⽤于洁净室（区）沉降菌的测定和验证。
责任QC微⽣物室检验员负责洁净室（区）沉降菌的测试，QC主管和QA部门负责对测试的数据进⾏统计分析。
程序1.定义1.1.菌落：微⽣物培养后，由⼀个或⼏个微⽣物繁殖⽽形成的微⽣物集落，简称CFU。
1.2.沉降菌：通过⾃然沉降原理收集在空⽓中的活微⽣物粒⼦，通过专⽤的培养基，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数。
1.3.动态测试：洁净室（区）已处于正常⽣产状态设备在指定的⽅式下进⾏，并且有指定的⼈员按照规范操作的状态。
2.测试⽅法2.1.测试过程2.1.1.设备和培养基：恒温培养箱、购买预灌装TSA平⽫或者⾃制TSA平⽫。
2.2.测试条件2.2.1.洁净室（区）的温度和相对湿度应与其⽣产及⼯艺要求相适应（⽆特殊要求时，温度在18~26℃，相对湿度在45%~65%为宜）。
2.2.2.风速、压差应在合格范围内。
2.2.3.动态测试。
2.3.测试⽅法2.3.1.将准备好的培养⽫按采样点要求放置或放在沉降架上（约1.0m）。
将采样台⾯取样位置或采样辅助设施表⾯消毒，打开培养⽫，将培养⽫盖置于已消毒位置，将培养⽫置于培养⽫盖上，使培养基表⾯充分暴露后，将培养⽫盖盖上后倒置。
2.3.2.在每⼀只培养⽫上标记好具体的取样位置及取样⽇期，将所有培养⽫在QC微⽣物室进⾏培养观察。
2.4.培养观察计数2.4.1.全部采样结束后，将培养⽫倒置于恒温培养箱中培养，在20~25℃培养箱中培养3天，30~35℃培养箱中培养2天后观察计数。
2.4.2.每批培养基应有阴性对照试验，检验培养基本⾝是否污染。
可每次选定2只培养⽫作对照培养。
2.5.计算2.5.1.平均菌落数M= M1＋M2＋…MNNM1＝1号培养⽫菌落数M2＝2号培养⽫菌落数Mn＝n号培养⽫菌落数n＝培养⽫总数2.5.2.结果判定2.5.2.1.最终结果采⽤平均值。
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1 目的
确定医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法和标准。
2 范围
适用于不同洁净室（区）（包括洁净工作台）的沉降菌的测定和环境验证。
3 责任
QC微生物室负责洁净室（区）沉降菌的监测。
4 内容
4.1 参考标准
中华人民共和国国家标准GB/T16294-2010《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》。
中华人民共和国卫生部发布的《药品生产质量管理规范（2010年修订）》。
4.2 监测程序
4.2.1 设备
高压消毒锅
恒温培养箱
培养皿：一般采用Φ90mm×15mm的硼硅酸玻璃培养皿。
4.2.2 培养基及平皿制备
4.2.2.1 一般采用普通肉汤琼脂培养基或其他药典认可的培养基
4.2.2.2 制备过程如下：
◆将培养皿与用三角瓶装好的培养基在高压消毒锅内121℃湿热灭菌20 分钟或180℃干热灭菌2小时；
◆将培养基加热溶化，冷至45℃时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。
◆待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于30－35℃恒温培养箱中培养48 小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用。
◆制备好的培养基平皿倒置在2－8℃的环境中存放，注意避免污染。
4.2.3 采样点和监测频次
4.2.3.1 采样点的布置力求均匀，避免采样点在某局部区域过于集中，按照洁净区的面积大小，而制定最少采样点数目（附件），在满足最少采样点数的同时，还宜满足最少培养皿数和采样点布置（附件）。
4.2.3.2 工作区采样点的位置离地0.8米－1.5米左右（略高于工作面）。
并在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。
4.2.3.3 监测频次：每月一次，特殊情况及时监测。
4.2.4 测试规则
4.2.4.1 沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度必须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。
4.2.4.2 测试前被测试洁净室（区）已经过消毒。
4.2.4.3 测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。
4.2.4.4 测试时间：
◆对单向流（如A级净化房间及层流工作台），测试应在净化空调系统正常运行不少于10分钟后开始。
◆对非单向流，如B级、C级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30分钟后开始。
4.3 测试步骤
4.3.1 采样
将已制备好的培养皿按要求放置，使培养基表面暴露0.5小时。
4.3.2 培养
全部采样结束后将培养皿倒置于恒温培养箱中，在30～35℃培养，时间不少于48小时。
每批培养基应有对照试验，每批可选定3只培养皿作对照培养。
4.3.3 菌落计数
用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，并用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。
4.3.4 注意事项
测试时应注意如下事项：
◆防止人为对样本的污染。
◆对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
◆般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，应注意培养皿边缘生长的菌落，并注意菌落与培养基沉淀物的区别。
◆采样时应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。
4.3.5 结果计算
用计数方法得出各个培养皿的菌落数，按下式计算：
平均菌落数M＝M1＋M2＋------Mn／n
式中：M1＝1号培养皿菌落数
M2＝2号培养皿菌落数
Mn＝n号培养皿菌落数
n＝培养皿总数
4.3.6 结果评定4.3.6.1
洁净度级别沉降菌最大允许值（菌数/皿）
静态
A级≤1
C级≤3
D级≤10
4.3.6.2 用平均菌落数判断洁净室（区）空气中的微生物。
◆洁净室（区）内的平均菌落数必须低于所选定的评定标准。
◆若某洁净室（区）内的平均菌落数超过评定标准，则必须对此区预先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均须合格。
4.3.7 警戒限度和纠偏限度
洁净度级别沉降菌警戒限度（菌数/皿）
动态
A级＜1 C级≤2 D级≤5
洁净度级别沉降菌纠偏限度（菌数/皿）
动态
A级＜1
C级≤2.5
D级≤8
4.3.8 异常情况的处理
4.3.8.1 当连续三次样品测试结果超过警戒标准或单个样品的结果特别高时调查原因，必要时采取相应纠偏措施。
4.3.8.2 当空调系统维修（如更换高效过滤器）或停用超过30天时，重新启用空调系统后应及时对洁净室（区）进行环境监测。
5 修订记录
版本号主要变更内容描述变更原因生效日期备注——新建文件——2004.03.01
01 增加文件版号文件版本升级2006.01.01
02 变更登记号文件版本升级2009.10.26
03 洁净区更改洁净级别客户审计2010.08.01
04 增加异常情况处理的描述客户审计2012.06.20
05 增加了警戒限度和纠偏限度，升级
洁净区级别，同时调整文件格式
文件版本升级
6 附录
附件1 沉降菌监测的最少采样点数目
附件2 沉降菌监测的最少培养皿数
附件3 沉降菌监测的采样点布置
附件4 房间编号一览表
SOP-ZL-006-FJ1 洁净室（区）沉降菌监测记录
附件1 沉降菌监测的最少采样点数目 面 积m 2
洁 净 度 级 别
A 级 C 级 D 级 ＜10 ≥10～< 20 ≥20～< 40 ≥40～< 100 ≥100～< 200 ≥200～< 400 ≥400～< 1000 ≥1000～< 2000
≥2000
2— 3 4 8 16 40 80 160 400 800
2 2 2 4 10 20 40 100 200
2 2 2 2
3 6 13 32 63
注：对于单向流洁净室，是指送风面积。
对于非单向流洁净室是指房间面积。
附件2 沉降菌监测的最少培养皿数
洁净度级别
所需Φ90mm 培养皿数（以沉降0.5小时计）
A 级 C 级 D 级
14 2 2
附件3 沉降菌监测的采样点布置
“ .”为采样点
. .
. . . . . . . .
. .
. .。