秋水仙素诱导月季品种‘月月粉’2n花粉的研究
秋水仙素诱导兰属'素心黄'多倍体的方法研究
秋水仙素诱导兰属'素心黄'多倍体的方法研究邓樱;周晔;陈继敏【摘要】采用继代培养法和侧芽萌动培养法比较秋水仙素诱导'素心黄'多倍体的效果.结果表明,继代培养法加倍效果较好,其诱导率为16.7%;细胞学鉴定表明,该方法诱导培育的植株具有多倍体表型特征,其体细胞染色体数2n=80,未见嵌合现象,而对照2n=40.【期刊名称】《亚热带植物科学》【年(卷),期】2008(037)002【总页数】3页(P38-40)【关键词】兰属'素心黄';原球茎;根尖;秋水仙素;多倍体诱导【作者】邓樱;周晔;陈继敏【作者单位】珠海市农业科学研究中心,广东,珠海,519070;珠海市农业科学研究中心,广东,珠海,519070;珠海市农业科学研究中心,广东,珠海,519070【正文语种】中文【中图分类】Q943;S682.31‘素心黄’是兰属的一个栽培品种，起源于天然变异植株，在兰花中小有名气，唯一令人遗憾的是花朵较小。
前人利用秋水仙碱已在许多园艺作物上诱导出有价值的多倍体[1]，如百合(Liliumd avidii)[2]、芦荟[3,4]；在兰科倍性育种方面也有不少报道，如齿斑石斛兰[5]、沉香虎头兰[6]等。
本文以秋水仙素为诱导剂，探讨继代培养法和侧芽萌动培养法对‘素心黄’多倍体的诱导效果，以期为改进该品种花较小之缺陷提供新的途径。
1.1 材料旺盛分化或增殖的无菌原球茎(PLB)、无菌小植株。
1.2 培养条件光照强度1 500～2 000 lx，光照12～14h/d。
1.3 多倍体诱导方法1.3.1 秋水仙素浓度梯度 0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、CK。
1.3.2 处理时间 1d、3d、5d。
以上每处理重复4次。
1.3.3 处理方法采用两种方法。
(1) 继代培养法：将旺盛分化的原球茎去顶后，接种于含有秋水仙素液体的继代培养基(花宝一号 + 6-BA 1.5mg/L)振荡培养1～5d，处理后用无菌水清洗，接种于不含秋水仙素的继代培养基中继续培养30d，然后进行分化培养，形成再生植株。
杜鹃红山茶2n花粉自然发生及其诱导初步研究
１２ １ ２ ．． ｎ花粉 标 准 有关 ２ ｎ花粉研 究 的众 多报道认 为 ， 物 花粉粒 直径 大小 与 染色 体倍 性 之 间具 有 明显 植 的相关 性 ，ｎ花粉 的 Ｄ Ａ含 量 和体 积 大 约是 正 常花 粉 的 ２倍 ，Ｊ ２ Ｎ 。通 常 ２ ｎ花粉 直 径 是正 常 花粉 直 径 的 １２—１３倍 ， ． ． 在李 、 杷 ｊ葡萄 、 枇 、 柿子 等果树 研究 方面 已有报 道 。 由此 可见 ， 用 花粉 大 小来 鉴 利 别２ ｎ花粉是 可行 的 ， 在育种 工作 上操作 简单 。本 实验 中把 大于正 常花 粉 １３倍 及 １３倍 以上 的花粉 界定 为 ． ． ２ ｎ花粉 。
Ｗ ａ ｇ Ｙｏ ｂ ｎ ｎ ｕ ｉｇ ・
Ｐａ Ｗ ｅ ｎ ｎ
Ｘｕ Ｂｉ ｎ
Ｚｈ ｎ ａ ｇ ｉ ａ ｇ Ｆ ｎ ｑｕ
Ｄｕ ｎ Ａｎ ａ ａ ｎ
Ｚｈ ｎ ｅ ｇ ｉｎ ａ ｇ Ｆ ｎ ｌａ ｇ ・
Ｚｈ ｏ ｈ ｕ Ｂａ ｚ ｕ
（ ．Ｓｕｈ ｅｔ ｏｅｔ Ｕ ｉ ｒ ｔ，Ｋ ｎ ｎ ， ５ ２４ ２ ｕ ｎｄｎ ｃｄｍ ｆ ｏｅｔ ） １ ｏ ｔ ｓ Ｆ ｒｓ ｎｖ ｓｙ ｕ ｍｉｇ ６０ ２ ； ．Ｇ ａｇｏｇＡ ａ ｅ ｙｏ Ｆ ｒｓｙ ｗ ｙ ｅｉ ｒ
ｔ ｏ ｒ ａ ｔ ｉｅ ｉ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｌｗｅ ｓｉｓｓｚ ｎ ｒ ａ ｅ ． ｎｇ
Ｋ ｅ ｒ ｓ Ｃ ｍｅｌ ｚ ｌａ Ｗ ｅ ．２ ｏｌｎ．ｉｄ ｃ ｍｅ ｔ ｙ ｗｏ ｄ ａ ｌａ ａ ａｅ ｉ ｎｐ ｌ ｉ ｅ ｎ ｕ ｅ ｎ
２ 配子发生是一种普遍现象。有研究表 明，ｎ ｎ ２ 配子在传递杂合性和上位性方面具有特殊价值 ， 因而 ２ ｎ 配子在植物有性多倍化育种 中逐渐受到重视 。目前 ，ｎ配子在马铃薯 、 白菜、 ２ 大 百合 、 、 李 桃子、 枇杷 、 苹
秋水仙素诱导油桃_丽春_2n花粉的研究
试验采用了注射法和棉浸法两种处理方法。注射法主要考察秋水仙素浓度、注射次数、注射间 隔时间 3 个因子。试验采用正交试验设计 L9（43），3 次重复。设计如表 1。
萌动后定时采集花芽，用卡诺固定液固定，醋酸洋红压片观察花粉母细胞减数分裂进程（康向 阳，2002），当减数分裂进入粗线期时开始用医用 1 mL 注射器逐一对花芽进行缓慢注射，药液从鳞 片渗出时停止注射。
1.4 数据统计与分析
试验记录处理的花芽数，能够膨大开花的花芽数，计算得花率。得花率（%）= n/N × 100（n 为开花数；N 为处理花芽数）。在大蕾期采回花蕾，在室内剥取花药，在室温条件下晾干散粉，用奥 林巴斯 BX51 显微镜观察，DP-70 摄像系统测量花粉粒大小，计数直径约 50 µm（48 ~ 52 µm）的花 粉的比例为 2n 花粉比率（Dermen，1938；Hesse，1971）。每个处理观察至少 10 个视野，累计花 粉数超过 100 粒。数据分析采用 DPS 软件，得花率、2n 花粉比率经开方反正弦转化后进行方差 分析。
85.0%的 2n 花粉，但得花率低；棉浸法诱导 2n 花粉的效果比注射法低，但得花率较高。处理时间和保湿
剂浓度是棉浸法诱导 2n 花粉的关键因子，处理时间为 32 h 和添加 1%甘油为保湿剂时 2n 花粉比率可达
44.1%。综合考虑得花率和 2n 花粉比率，适宜的秋水仙素棉浸法诱导油桃 2n 花粉的条件为：0.1% ~ 0.2%
园 艺 学 报 2010，37（7）：1155–1160 Acta Horticulturae Sinica
秋水仙素诱导油桃‘丽春’2n 花粉的研究
王尚德 1，刘佳棽 1,*，吉王鹏 2，兰彦平 1，姚砚武 1，周家华 1，常 虹 1
2021近十年秋水仙素离体诱导植物多倍体的研究进展范文2
2021近十年秋水仙素离体诱导植物多倍体的研究进展范文 多倍体植物在自然界中普遍存在，目前在农业生产中，主要农作物都是多倍体，如小麦为异源六倍体、棉花和油菜为异源四倍体、甘薯为同源六倍体，而水稻和玉米为二倍体化的古多倍体。
多倍化研究已经成为当前进化生物学、遗传学和基因组学领域的研究热点[1]. 多倍体通过自然加倍获得，但数量稀少，频率低，甚至在自然条件下不能正常生长而死亡，难以应用于生产实践中[2],因此，20世纪初育种家们开始对人工诱导多倍体进行探索。
起初，人工加倍的方法是通过物理的手段获得多倍体，如高温、辐射，但诱变率低下，常发生嵌合体[3].1937 年，Blakeslee 等[4]用秋水仙碱加倍曼陀罗等植物的染色体数获得了成功。
秋水仙素被广泛应用于培育植物新品种。
秋水仙素，即秋水仙碱，纯秋水仙碱呈黄色针状结晶，熔点157℃，易溶于水、乙醇和氯仿，味苦，有毒。
秋水仙素通过作用于有丝分裂中期使染色体加倍。
其原理是秋水仙素可以与α - 微管蛋白和β - 微管蛋白形成的二聚体特异性结合，减少了微管二聚体装配在微管上的数量，结果使微管拆卸的速度大于装配的速度，最终使形成的微管解聚，染色体加倍但细胞质不分裂，因此染色体数目加倍。
最初秋水仙素诱导多倍体是活体进行。
通过适当的操作，如点滴、注射、涂抹等诱导植株的顶芽、腋芽等位置，但活体操作时细胞的分裂不能同步，活体诱导较难得到纯合四倍体植株，大多为嵌合体，诱导率低。
随着生物技术的发展，离体诱导多倍体的条件已经十分成熟。
离体诱变育种有诸多优势：诱导率高；试验易于重复进行；嵌合体发生率低，方便纯化；时效快、操作方便；节省空间、人力物力；便于控制室温、光照等条件等。
张蜀宁等[5]利用秋水仙素离体诱导青花菜，得到变异植株 20 株，其中纯合植株有 19 株。
秋水仙素离体诱导同源多倍体在种质创新和新品种选育上发挥了重要作用，诱导产生的同源多倍体常伴随植物形态、解剖、生理、栽培特性等方面而改变，如叶片变厚变大、叶色加深、叶绿素含量增加；花器官、果实变大；维管束变大、抗逆性增强、生物量或生物有效成分增加等[6]. 同源多倍化引起的表型变化及其机理研究亦成为研究热点[7-8]. 本文总结了近十年秋水仙素离体诱导植物多倍体的研究进展，对影响诱导效率的因素如外植体类型、处理方法及其他因素进行了综述，并探讨了倍性嵌合体的分离方法、同源多倍化效应及其分子机理研究，旨在为从事植物多倍体研究的育种工作者提供参考。
月季的花药培养zhou
小孢子 母细胞
减数 分裂
四个小 孢子(N)
有丝 分裂
单核居 单核靠 中期(N) 边期(N)
双核花 粉粒
有丝 花粉管细胞(N) 分裂 生殖细胞(N) 有丝 分裂
小孢子四 分体时期
单核时期
双核时期
两个精子 成熟的花粉
4.花粉的发育过程
小孢子母细胞(2n) ( 减数 )分裂 (小孢子四分体 )时期(n) （ 2 )个精子(n)
课题成果评价
选材是否恰当
选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会
通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。 无菌技术是否过关
如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如
培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。
课题成果评价
接种是否成功
如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状
体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养 基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株 。
7～10
个花药。
4．培养 (1)花药培养利用的培养基是 MS 培养基，pH 为 5.8 ， 温度为 25 ℃,幼苗形成之前 不需要 (需要、 不需要)光照。 (2)在花药培养基中，用量最高的激素是 IAA ；在诱导丛 芽或胚状体培养基中，用量最高的激素是 BA ；在诱导生 根的培养基中，用量最高的激素是 IAA 。 (3)图中①过程是脱分化，②过程是再分化；B 试管内是
（三） ．影响花药培养的因素 (1)影响花粉植株的主要因素：
材料的选择 和 培养
基的组成
等。
(2)材料的选择 ①从花药来看，应当选择 初花期 (初花期、盛花期、晚
花期)的花药； ②从花粉来看， 应当选择 单核期 (四分体期、 单核期、 花药质地幼嫩，容易破碎 ； 双核期、萌发期)的花粉单核期之前， 花瓣开始松动，消毒困难。 单核期之后， ③从花蕾来看，应当选择
秋水仙素在园林花卉育种中的运用
秋水仙素在园林花卉育种中的运用刘继海【摘要】随着城市对园林绿化重视度的不断加强,我国的园林花卉产业有了较大的发展.花卉产业在进行新品种选育时普遍使用的方法则是多倍体育种方式,其中秋水仙素人工化学诱变被认为是多倍体育种中效果最好、成果最优的方式.本文针对当前我国花卉多倍体育种中秋水仙素的应用进行了分析,从化学诱变作用机理、诱变方法及研究进展等方面进行了论述.【期刊名称】《农业科技与信息》【年(卷),期】2016(000)013【总页数】2页(P132-133)【关键词】秋水仙素;多倍体诱导;应用进展【作者】刘继海【作者单位】乌鲁木齐市植物园,新疆乌鲁木齐830011【正文语种】中文【中图分类】S68一般情况下多倍体植株的叶片都比较大且很厚，而且颜色相对偏深一点，花朵生长的很大而且质地较好，花期能够生长很长一段时间，这些优势都比较适合培育种植，有效推动了花卉产业的发展速度，同时也提升了花卉自身的观赏和商品价值，这是由于这些优势使得多倍体育种收到了广大花卉商的喜爱和认可。
现有的技术手段中,通过秋水仙素人工化学诱变的方式仍然被认为是最有效、成绩最为显著的一条途径,其具有经济方便、诱变作用专一和诱变突变广泛等特点[1],一直沿用至今。
本文对近年来秋水仙素在国内花卉多倍体育种中应用进展综述如下。
所谓秋水仙素实际上就是在秋水仙花的鳞茎和种子中所提炼出来的一种淡黄色的粉末，属于针状结晶，遇到水比较容易融化，但是热水不适合用于它的溶解。
秋水仙素可以特异性的和细胞中微管蛋白质元件进行融合，阻碍分裂的细胞纺锤丝，抵制纺锤丝体的运转，迫使有丝分裂中断,从而阻止染色体向两级移动,抑制细胞分裂时纺锤体的形成,染色单体分裂,但是细胞和细胞质不分离而导致同源染色体数目加倍,形成同源多倍体。
秋水仙素只有处理细胞分裂活跃状态的组织才可以产生有效的刺激作用,使分生组织的染色体加倍,因此其加倍的材料一般为萌动状态或刚发芽的种子、幼苗或嫩枝的生长点、芽、花蕾或愈伤组织等。
秋水仙素在园艺植物多倍体育种中的应用研究进展
秋水仙素在园艺植物多倍体育种中的应用研究进展赵阳;黄韬【摘要】@@ 采用染色体加倍的方法选育作物新品种的途径称为多倍体育种.园艺植物的多倍体育种可以高效率改变园艺植物的某些性状,如利用无性繁殖避免因基因重组分离改变品质、通过多倍体的巨大性提高产量、对非种子食用器官的瓜果进行三倍体无籽植株的获得来增加商业价值等,说明多倍体育种在园艺植物育种中具有重要作用.【期刊名称】《上海蔬菜》【年(卷),期】2010(000)002【总页数】3页(P29-31)【作者】赵阳;黄韬【作者单位】辽宁省大连市农业科学研究院,116036;辽宁省大连市农业科学研究院,116036【正文语种】中文采用染色体加倍的方法选育作物新品种的途径称为多倍体育种。
园艺植物的多倍体育种可以高效率改变园艺植物的某些性状，如利用无性繁殖避免因基因重组分离改变品质、通过多倍体的巨大性提高产量、对非种子食用器官的瓜果进行三倍体无籽植株的获得来增加商业价值等，说明多倍体育种在园艺植物育种中具有重要作用。
本文就近年来有关秋水仙素对植物进行多倍体诱导的文献报道进行了综合概述。
1 多倍体育种在园艺植物中的应用多倍体是高等植物染色体进化的显著特征。
据统计，高等植物中的多倍体占65%以上，如小麦、烟草、棉花、马铃薯、甘蔗等都是自然形成的多倍体。
在被子植物中约50%是多倍体、豆类植物18%是多倍体。
自1937年Blackeslee和Avery 利用秋水仙素诱导蔓陀萝四倍体获得成功后，已在1000多个植物种中获得了人工多倍体。
常见的多倍体果树有三倍体苹果、多倍体柑橘、三倍体梨、多倍体葡萄、四倍体金丝小枣、多倍体猕猴桃等。
三倍体和四倍体的蔬菜有西瓜、白菜、甜瓜、马铃薯、茼蒿、黄花菜、辣椒、甘蓝型油菜、黄瓜、番茄、不结球白菜、花椰菜、芹菜、萝卜、莴苣、菠菜、丝瓜、石刁柏、生姜、茄子、芦笋等；花卉中常见的有四倍体金鱼草、四倍体麝香百合及多倍体的库拉索芦荟、药用百合、菊花脑、君子兰、花叶绿萝等。
园艺植物多倍体的诱导和鉴定 李腾飞
园艺植物多倍体的诱导和鉴定中荷1001 李腾飞一、多倍体的诱导：物理方法温度骤变、机械创伤、辐射处理等都有可能诱发多倍体的产生。
化学方法主要是利用秋水仙素诱导多倍体。
生物方法：有性杂交获得多倍体组织培养获得多倍体1、秋水仙素诱导多倍体：秋水仙素是从百合科植物秋水仙的器官和种子中提取出来的一种剧毒的植物碱。
纯品为无色或淡黄色针状结晶，熔点155℃，有苦味，易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛。
通常用水或酒精作溶媒。
秋水仙素诱导多倍体的原理：秋水仙素与正在分裂的细胞接触后，可抑制微管的聚合过程，不能形成纺锤丝，使染色体无法分向两极，从而产生染色体加倍的核。
适宜浓度的秋水仙素溶液，能阻碍纺锤丝的形成，但对染色体结构无明显影响。
处理的细胞在一定时间内可恢复正常，重新进行分裂。
诱导方法：①浸渍法：可用溶液浸渍幼苗、新梢、插条、接穗、种子及球根类蔬菜、花卉等材料。
为避免蒸发，宜加盖，避光。
一般发芽种子处理数小时至3d或多至10d左右。
秋水仙碱能阻碍根系的发育，处理后要用清水洗净后再播种。
发芽种子的胚根，处理后往往受到抑制，发根较慢，为利于根的生长，可在药液中添加适当生长素。
处理插条、接穗一般1-2d。
处理幼苗时，为避免根系受害，可将盆钵架起来倒置，使茎端生长点浸入秋水仙碱溶液中。
②涂抹法把秋水仙碱按一定浓度配成乳剂，涂抹在幼苗或枝条的顶端，处理部位要适当遮盖，以减少蒸发和避免雨水冲洗。
③滴液法对较大植株的顶芽、腋芽处理时可采用此法。
常用的水溶液浓度为0.1%~0.4%，每日滴一至数次，反复处理数日，使溶液透过表皮渗入组织内部。
如溶液在上面停不住时，可将小片脱脂棉包裹幼芽，再滴加溶液，浸湿棉花。
④套罩法保留新梢的顶芽，除去顶芽下面的几片叶，套上一个防水的胶囊，内盛有含1%秋水仙碱的0.65%的琼脂，经24h即可去掉胶囊。
这种方法的优点是不需加甘油，可避免甘油引起药害。
⑤毛细管法将植株的顶芽、腋芽用脱脂棉或纱布包裹后，将脱脂棉与纱布的另一端浸在盛有秋水仙碱溶液的小瓶中，小瓶置于植株旁，利用毛细管吸水作用逐渐把芽浸透，此法一般多用于大植株上芽的处理。
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秋水仙素诱导月季品种‘月月粉’2n花粉的研究张凡;杨慕菡;巩俊清;冯慧;高述民;周燕【摘要】为获得二倍体古老月季品种‘月月粉’人工诱导2n花粉用于现代月季杂交育种,该研究在了解‘月月粉’花粉母细胞发育过程的基础上,使用秋水仙素注射结合包裹法处理幼嫩花蕾,成功获得了可正常萌发的2n花粉,并通过观察诱导获得的花粉离体及其在雌蕊上的萌发特征,初步评估2n花粉用于杂交育种的性能.结果表明:(1)秋水仙素药棉包裹造成部分花蕾在采粉前死亡,花蕾存活率随秋水仙素浓度提高和处理时间延长均极显著降低.(2)2n花粉诱导率在秋水仙素浓度为2.5、5.0、7.5和10.0 g/L间存在显著差异,但在处理时间为24、48和72 h间无显著差异;最佳诱导处理为5.0 g/L秋水仙素处理24 h,诱导率可达15.83％,该处理获得的2n花粉经亚历山大染色检验活力为27.2％.(3)‘月月粉’花粉母细胞在减数分裂时存在异常落后染色体和平行纺锤体,在四分体时期形成染色体数目加倍的二分体和三分体,最终产生2n花粉.(4)所诱导的2n花粉的体外萌发率和花粉管长度与天然花粉无显著差异,且都可以在母本柱头上萌发并长出花粉管进入子房,表明可用于进一步的杂交育种.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2019(039)004【总页数】10页(P620-629)【关键词】月季;2n花粉;秋水仙素;‘月月粉’;花粉母细胞;花粉萌发【作者】张凡;杨慕菡;巩俊清;冯慧;高述民;周燕【作者单位】北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程试验室,北京100083;北京市园林科学研究院,绿化植物育种北京市重点试验室,北京100102;北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程试验室,北京100083;北京市园林科学研究院,绿化植物育种北京市重点试验室,北京100102;北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程试验室,北京100083;北京市园林科学研究院,绿化植物育种北京市重点试验室,北京100102;北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程试验室,北京100083;北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程试验室,北京100083;北京市园林科学研究院,绿化植物育种北京市重点试验室,北京100102【正文语种】中文【中图分类】Q813.5月季(Rosa chinensis)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)植物，原产中国，是中国十大名花之一，栽培广泛，在观赏、食用、药用等方面具有重要意义[1]，至今已有3万多个品种。
月季的祖先原始蔷薇属植物倍性不稳定，从二倍体到八倍体均有分布。
现代月季经历了漫长的育种过程，具有高度杂合的遗传特点[2]，育种者以花色、花香、无刺、抗病、抗逆等目标，通过杂交、芽变、诱变、分子等育种手段，培养了大量新品种。
杂交育种经过漫长的发展历史，创造了非常庞大的月季种群，并且至今仍在月季育种中占据主要地位[3]。
月季杂交育种的主要困难是，传统品种间的杂交遗传背景较窄，经过长期的育种历程对遗传资源的利用趋于饱和；远缘杂交可使不同物种或亲缘较远的品种间的遗传信息流动起来，但远缘杂交常常存在亲和性低、可育性差等问题[4-5]。
中国在月季栽培上虽然具有悠久的历史，但现代月季育种与国际领先水平仍有较大差距，到2016年，国际上月季登录品种中，中国月季新品种数量仅占4%[1]。
‘月月粉’(‘Old Blush’，2n=2x=14)是二倍体中国古老月季品种，具有连续开花等优良性状，于1793年引进英国，改变了欧洲月季只有夏季开花的局面。
然而，由于现代观赏月季大多为四倍体，二倍体月季与其杂交亲和性较差，或产生的三倍体后代经常不育，阻碍了育种工作[6-7]。
2n花粉是月季多倍体形成的主要途径，可使二倍体月季品种作为父本与四倍体月季母本的杂交中产生可育后代，是解决不育问题的可行之策[8-9]。
天然2n花粉产生多与环境因素尤其是温度有关，温度异常升高或降低均会提高2n花粉的发生率，这种产生途径依赖环境的偶然性，具有不稳定的年际变化[10-11]，故有必要通过人工诱导来稳定高效地获得2n花粉。
月季多倍体育种多报道温室栽培30 ℃以上的高温导致月季2n花粉产生率提高，32.7 ℃可导致‘Hw336’2n花粉产生率从0.1%提高到4.7%，并可获得四倍体后代[12]，而36 ℃导致二倍体月季2n花粉产生率从0.2%提高到24.5%，但2n花粉萌发孔和表面纹饰均观察到明显的畸形[11]。
除此之外，化学诱变可成功诱导月季体细胞加倍获得同源多倍体，如使用黄草消诱变二倍体月季茎段获得了44.4%的同源四倍体[13]，以及使用黄草消、氟乐灵、APM诱导3个月季品种最高达到了66.7%的诱导率[14]，但同源多倍体由于未经历重复基因组的整合，在杂交中经常出现不育，并且同源四倍体仅仅是二倍体的简单加倍，而发生在第一次减数分裂时加倍的2n花粉(FDR型，First division restitution)则可继承其父母本80%左右的杂合度[8]，因此具有更高的利用价值。
月季2n花粉的化学诱导尚未见报道，但许多园艺植物在近些年逐渐开展了2n花粉在杂交中的相关研究，以及秋水仙素等微管抑制剂人工诱导2n花粉的工作，在秋海棠(Begonia sp.)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、猕猴桃(Actinidia chinensis)、郁金香(Tulipa sp.)、百合(Lilium sp.)等众多物种上获得进展[15-19]，可以作为本研究的参考。
本研究以中国古老月季‘月月粉’为材料，在了解其花粉发育和2n花粉产生的基础上，使用秋水仙素诱导提高2n花粉的产生率，并通过观察诱导获得花粉离体和在雌蕊上的萌发从而初步评估2n花粉用于杂交育种的性能，进而促进‘月月粉’遗传资源利用效率的提高。
1 材料和方法1.1 植物材料试验所用所有月季均来自北京市园林科学研究院，试验于2015年12月到2018年4月进行。
花粉母细胞(pollen mother cell, PMC)发育观察与秋水仙素诱导所用花粉材料均来自多年生‘月月粉’，采集于每年4～5月间，杂交授粉的母本是四倍体现代月季‘桔红色火焰’(‘Orange Fire’)。
1.2 诱导时期的确定在不同植株上采集不同大小的花蕾共30个，测量长宽并从小到大编号，采用普通压片法醋酸洋红染色观察花粉发育时期，每个花蕾观察3个花药，共观察至少200个PMC并选形态清晰典型者拍照，确定PMC减数分裂的过程以及与花蕾大小的关系。
1.3 2n花粉的人工诱导诱导试验于2017年4月中旬至5月底进行，日温22 ℃～29 ℃，夜温7 ℃～14 ℃。
诱导‘月月粉’秋水仙素浓度设计为2.5、5.0、7.5和10.0 g/L 4个梯度；对照为蒸馏水即0 g/L和无处理，处理时间为24、48和72 h，每个组合处理20个花蕾。
使用一次性注射器刺穿花瓣伸入到花蕾中心位置，注射相应浓度的秋水仙素溶液至萼片缝隙有液滴渗出，立即用浸满相同浓度秋水仙素的脱脂棉包裹花蕾，使用封口膜在外层扎紧。
待处理完成后，去掉脱脂棉并挂牌，正常栽培管理，1周后统计不同处理花蕾的存活率。
约2周后，剩余存活的花蕾生长到适宜采粉的时期，收集花粉，统计不同处理的2n花粉诱导率与花粉活力(亚历山大染色法)，综合评价筛选出效果最好的浓度和处理时间。
1.4 减数分裂异常现象的观察与2n花粉产生比例预测观察前期Ⅰ-末期Ⅱ的PMC，寻找可能造成减数分裂异常的染色体现象，如染色体桥、平行纺锤体、落后染色体。
使用诱导效率最高的组合处理花蕾，处理后直接采下花蕾进行压片观察，统计四分体时期二分体(Dy)、三分体(Tri)、四分体(Te)的数量，由此预测2n花粉的产生比例=(2Dy+Tri)/(4Te+3T ri+2Dy)×100%。
1.5 诱导花粉的萌发参考丁一鸣[20]的方法，以蔗糖、硼酸、氯化钙配制花粉体外萌发培养基，蔗糖浓度经筛选定为10%。
室温(20 ℃)下避光培养6 h后，显微镜下观察统计萌发的花粉，统计萌发率并测量花粉管平均长度。
将天然花粉和诱导花粉分别在去雄的母本‘桔红色火焰’雌蕊上授粉并套袋保护，采集授粉后4 h、24 h和72 h的母本花蕾，参考周旭红等的方法[21]，用苯胺蓝染色法在荧光显微镜(Leica DM 6000B)下观察不同倍性的花粉在柱头上的萌发。
2 结果与分析2.1 减数分裂进程与花蕾形态的关系‘月月粉’在现蕾的同时开始花粉母细胞(PMC)的发育，按照减数分裂进程可分为5个时期，花蕾长、宽在时期1～4均呈显著差异(表1，图版Ⅰ，A)。
在蕾期1幼嫩的花蕾被嫩叶和萼片紧密包裹，此时PMC还未开始减数分裂，呈现多边形且有核仁(图版Ⅰ，B)。
蕾期2花蕾呈笔尖形， PMC处于减数分裂前期Ⅰ，此时核仁消失出现染色体和纺锤体，并有7对染色体两两配对的联会现象(图版Ⅰ，C, G)。
蕾期3子房明显可见，花柄开始长出腺毛，PMC处于中期Ⅰ～末期Ⅰ(图版Ⅰ，D, H～J)。
蕾期4大部分细胞处于前期Ⅱ～末期Ⅱ，另有少量细胞仍未完成减数分裂Ⅰ(图版Ⅰ，E, K～M)；蕾期5 PMC完成减数分裂，大部分细胞均为四分体(图版Ⅰ，F, N)，子房和花被饱满，花蕾开始泛红。
‘月月粉’同一花药内的PMC的发育存在不同步性，参考前人研究将诱导处理时期定为蕾期2，此时大部分细胞处于前期Ⅰ。
2.2 秋水仙素人工诱导2n花粉2.2.1 秋水仙素处理‘月月粉’花蕾的存活率去掉药棉之后约2周，花蕾生长至可采粉的时期，注射溶剂(蒸馏水)的对照组大部分均可正常生长发育，表明该处理对花蕾造成的损伤不会引起花蕾的大量死亡(图Ⅱ，B)，注射秋水仙素的花蕾多呈现萼片萎缩末端干枯，花瓣畸形的状态，采粉量也极大降低，表明了秋水仙素对花蕾的毒害作用(图Ⅱ，C)，而受秋水仙素毒害严重的花蕾在生长过程中即会脱落，不同处理具有不同的存活率(表2)。
注射蒸馏水在包裹24 h和48 h存活率均为100.0%，在72 h存活率下降到85.0%，说明注射操作不会影响花蕾存活，但湿棉包裹时间过长则会导致花蕾死亡。
随着秋水仙素浓度提高和处理时间延长，花蕾的存活率均呈现降低的趋势，双因素方差分析表明，花蕾存活率在不同浓度和不同处理时间均存在极显著差异(表3)。
表1 ‘月月粉’PMC减数分裂时期与花蕾形态特征的关系Tabel 1 The relation between the interprocess of meiosis and the morphological characteristics of flower buds in ‘Old Blush’编号No.减数分裂时期Meiosis phase花蕾长Bud length/mm花蕾宽 Bud width/mm长/宽Length/Width1分裂间期Interphase 5.84±0.41d3.24±0.11e0.55±0.02a2前期Ⅰ Prophase Ⅰ7.76±0.74c4.24±0.04d0.54±0.05a3中期Ⅰ-末期Ⅰ Metaphase Ⅰ- TelophaseⅠ10.12±0.64b5.28±0.09c0.52±0.02b4前期Ⅱ-末期Ⅱ Prophase Ⅱ-Telophase Ⅱ13.26±0.56a6.28±0.08b0.47±0.01b5四分体Tetrad13.45±0.68a7.13±0.17a0.53±0.01a注：同列内不同字母表示经邓肯氏多重极差检验在0.05水平上差异显著Note: Different normal letters within column are significant by Duncan’s multiple range test at 0.05 level2.2.2 秋水仙素处理‘月月粉’花蕾的诱导率使用亚历山大法对诱导后的花粉染色，可观察到直径是1n花粉1.3倍以上的大花粉即2n花粉，其中红色近圆形的有活力，无色空瘪的无活力(图Ⅱ,D～F)。