犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定

畜牧兽医学报,1998,29(2),1512154A cta V eterina ria et Z ootechn ica S in ica犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定田克恭　遇秀玲　吴　娜　隋丽华任晓明　李俊梅　刘永梅　渠川玫(军事医学科学院实验动物中心,北京100071) 摘　要　从病死犬肺、肝和淋巴结分离到2株CDV,CDV93039和CDV93041。

消除小牛血清中的干扰因素和33℃培养是分离成功的主要因素。

两株病毒均在V ero细胞生长良好,传2～4代毒力稳定,CPE产生明显,TC I D50为10-6.50～10-6.77,明显高于国内外野毒株和弱毒株的毒力效价。

人工感染犬死亡率较高,表明该分离株致病力较强,作者推测我国犬群可能存在CDV强毒变异株。

关键词　犬瘟热病毒,分离,鉴定犬瘟热是由犬瘟热病毒(Can ine D istem per V iru s,CDV)引起的犬的一种高度接触传染性疾病。

六十年代我国部分省市的毛皮动物和犬群中时有发生,并逐渐在全国范围内流行[1]。

七十年代末,先后从国外进口的CDV弱毒疫苗中分离到多株疫苗株,并应用于犬及毛皮动物,对该病的预防起到了积极作用[2]。

近年来,不仅病犬数量有所增加,而且临床表现也有所不同。

分析原因,除母源抗体干扰,疫苗效价低及使用不当外,犬群中是否出现了CDV强毒变异株急待于研究证实。

1993年我们采用BA法证实病犬多脏器组织中存在CDV[3]。

本实验取这些病犬脏器组织接种V ero细胞,分离到2株CDV强毒。

Ξ1　材料与方法111　材料11111　V ero细胞及培养:卫生部药品生物制品所提供。

营养液为10%小牛血清DM E M, pH7.2。

维持液为2%小牛血清DM E M。

11112　CDV阳性血清:日本北海道大学惠赠。

11113　动物:3日龄健康幼犬7只,体重215～410kg 只,均未注射任何疫苗。

11114　病料:临床疑似犬瘟热的病死犬,经BA法确诊为CDV阳性者,取其肺、肝和淋巴结分离病毒。

病犬编号分别为93039、93041和93043。

112　方法11211　病毒分离1121111　病料处理:分别取上述病料,1 5加入无血清DM E M研磨,离心取上清,抗生素除菌。

菌检阴性者,-20℃保存,以备病毒分离用。

1121112　小牛血清处理:无血清DM E M洗涤V ero细胞2次,加入培养液1 2量的小牛血清,Ξ1996102437℃吸附1h,吸附后的血清分装,-20℃保存备用。

1121113　病毒分离:将病料按培养量的1 10接种V ero细胞,33℃吸附1h,加入维持液继续培养,逐日观察细胞病变(CPE),待CPE达80%时收毒,-20℃ 20℃冻融3次,继续传代。

11212　电镜观察:刮取接种CDV的V ero细胞,离心弃上清,固定、切片、染色,电镜观察。

11213　病毒理化特性试验:按殷震等(1985)的方法检测93039株对乙醚、pH310和60℃30m in 的耐受性[4]。

11214　病毒血凝特性试验:检测分离株在4℃、22℃和37℃条件下,对1%人“O”型及小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猴、鸡、猪、绵羊、黑线仓鼠、白化黑线仓鼠等动物红细胞的凝集性。

11215　毒力测定:将分离株用维持液1 10倍比稀释,从10-1至10-9,每一稀释度接种4瓶细胞,观察10d,以CPE为指标,按R eed2M uench法计算其TC I D50。

11216　HR P-SPA染色法:按吴小闲等(1992)的方法进行[5]。

11217　回归动物试验:5只犬每只腹腔接种CDV第2代毒5m l,滴鼻2滴,另2只留做对照。

逐日观察。

取病死犬脏器组织同上检查CDV抗原。

2　结　果211　病毒分离结果　2d可见细胞变圆,胞质内颗粒增多,融合成小集落。

4d胞浆空泡化,可见小的嗜酸性包涵体。

6d CPE加重,部分细胞坏死脱落,细胞单层呈拉网状。

8d拉网明显,可见多量胞浆及胞核包涵体。

10d融合细胞坏死脱落,贴壁细胞约剩20%,收毒。

经上述方法从3份病料中分离到2株CDV:93039株和93041株。

两个分离株在V ero细胞上生长稳定,CPE出现规律,两株病毒所致CPE一致。

212　电镜观察　病毒主要在胞浆内增殖,在细胞膜表面装配,以出芽方式由细胞膜向外释放。

在胞浆内和细胞外可见大量不同形态的病毒颗粒。

成熟的病毒粒子可见囊膜,囊膜上可见纤突样结构。

213　理化特性试验结果　见表1。

93039株经乙醚、酸和热处理后,其TC I D50与对照组的差值均大于4100,说明该病毒有囊膜,对乙醚敏感,对酸和热的抵抗力较弱。

表1　CD V93039株对乙醚、酸和热的耐受性Table1　The tolerance of CD V93039stra i n for ether,ac id and heat试验条件T est conditi ons试验组TC I D50TC I D50of test grup对照组TC I D50TC I D50of contro l group20%ether,4℃,24h pH3.0,37℃,2h60℃30m in 2.002.332.336.006.507.00214　血凝试验结果　在4℃、22℃和37℃条件下,两株CDV均不凝集人“O”型及上述动物的红细胞。

215　毒力测定结果　见表2。

两株CDV TC I D50相近,传至第4代毒力稳定。

介于10-6.50～10-6.77之间。

251畜　牧　兽　医　学　报29卷表2　分离株不同代次毒力测定结果Table 2　TC I D 50of differen t al generation s of isolates毒株及代次Strains andgenerati ons不同接毒量及CPE 数V irus diluti ons and num ber of CPE 10-510-610-710-8Contro ls TC I D 50 0.5m l 93039　F 24 43 41 40 40 410-6.5093039　F 34 43 42 40 40 410-6.7793039　F 44 43 42 40 40 410-6.7793041　F 24 43 42 40 40 410-6.7793041　F 34 43 42 40 40 410-6.7793041　F 44 43 41 40 40 410-6.50216　免疫组化染色结果　接毒后第6天,病变细胞呈拉网状,胞浆空泡样变。

半数细胞胞浆中可见棕褐色或黄褐色阳性反应物质。

217　回归动物试验结果　感染后9～14d 死亡4只,另一只濒死,第14天剖杀。

病犬表现咳嗽、结膜炎、排血样稀便等症状,死后呈角弓反张。

剖检可见肺出血水肿,胸腺萎缩,肠系膜淋巴结肿大出血,小肠段出血,脑腔积液,脑实质充血、出血等。

经免疫组化染色证实,在死亡犬多脏器组织中广泛存在CDV ,证实死于CDV 感染。

3　讨　论311　病毒分离:文献报道,CDV 能适应多种细胞培养物[6～16]。

但在犬肾细胞上生长缓慢,利用鸡胚成纤维细胞初代分离更为困难,需经鸡胚绒毛尿囊膜多次传代才能适应[4、11]。

本试验选用V ero 细胞,所用小牛血清经吸附处理,33℃初代培养即获成功。

分析原因可能与以下因素有关:(1)所用病料经BA 染色证实其中存在大量的CDV 抗原[3],减少了分离培养的盲目性。

(2)白泉阳等(1991)[3]报道,小牛血清中含有影响CDV 初代分离的干扰因素。

本试验使用吸附处理的小牛血清,清除了这种干扰因素。

(3)37℃培养V ero 细胞,自然老化和脱落较快,我们在接种病料后,移至33℃培养,有助于延长V ero 细胞的存活时间,易于观察CPE 。

另外,自然条件下,CDV 主要经略低于正常体温的上呼吸道粘膜上皮细胞感染,在扁桃体、咽后和支气管淋巴结中增殖后,才扩散至全身各脏器组织。

由此分析,33℃培养符合CDV 在动物体内的感染规范,可能是分离成功的原因之一。

312 病毒的毒力:CDV 93039和CDV 93041株在V ero 细胞上传2～4代毒力稳定,TC I D 50高达10-6.50～10-6.77,明显高于国内从水貂分离的CDV 毒力效价(10-2.5～10-2.7)[13]和国外弱毒在我国早期复制时的毒力效价(10-4.5)[2]以及国外分离的CDV SH 株(10-4)、CDV R 252株(10-5)和CDV O nd 株(10-6)的毒力效价[14]。

证实本试验分离的两株CDV 毒力较强,人工感染幼犬死亡率较高。

由此推测在我国犬群中可能存在CDV 强毒变异株,有待进一步分析该毒株与国外标准毒株之间的抗原关系,最终回答我国流行的犬瘟热是否出现了变异株的问题。

3512期田克恭等:犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定451畜　牧　兽　医　学　报29卷313　根据两株病毒在V ero细胞上的培养特性、理化特性、毒力测定、电镜观察以及免疫组化染色和回归动物试验结果,证实CDV93039和CDV93041均为CDV强毒株。

该毒株的分离成功,将为我国CDV的毒株鉴定、疫苗研制、诊断方法的研究提供依据,同时为驯化培育适合我国犬群的弱毒疫苗提供了来源清晰的强毒种源。

参　考　文　献1　田克恭主编1实验动物病毒性疾病1北京:农业出版社,1992,321～3242　华国荫等1水貂犬瘟热免疫的研究 1复制鸡胚组织培养弱毒疫苗的研究1畜禽传染病,1980,4:30～35 3　遇秀玲等1犬瘟热病犬脏器组织中的抗原定位及病理形态学观察1中国兽医杂志,1994,20(6):7～94　殷　震等主编1动物病毒学1北京:科学出版社,1985,281～2855　吴小闲主编1医学实验动物微生物学、寄生虫学监测手册1北京:卫生部医学动管会编辑,1992,83～856　Co rnw ell HJC et al.Studies in experi m ental canine distemper .V iro logy,inclusi on body studies and haem ato p.Patho l,1965,75:19～347　M etzler A E et al.V irulence of tissue culture2p ropagated canine distemper virus.Infect.I mm uno,1980, 29:940～9448　Bui HD et al.Canine bladder ep ithelial cells in culture:suscep tibility to canine distemper and m easles viruses.Am.J.V et.R es,1982,43:1268～12709　M ax JG et al.Dog L ymphocyte cultures facilitate the iso lati on and grow th of virulent canine distemper virus.J.V et.D iagn.Invest,1992,4:258～26310　kai C et al.U se of B95a cells fo r iso lati on canine distemper virus from clinical cases.J.V et.M ed.Sci, 1993,55(6):1067～107011　W righ t N G et al.Canine distemper:current concep ts in labo rato ry and clinical diagno sis.V et.R ec,1974, 94:86～9212　Bussell RH et al.Canine distemper virus in ch ick em bryo cell culture.V iro logy,1962,18:589～60013　白泉阳等1犬瘟热病毒的分离及部分特性研究1兽医大学学报,1991,11(4):347～35114　Confer AW et al.B i o logical p roperties of a canine distemper virus iso late associated w ith dem yelinating encephalom yelitis.Infect.I mm uno,1975,11:835～84415　H irayam a N et parison of bi o logical and mo lecular p roperties among canine distemper virus strains.Jap.J.V et.Sci,1986,48(2):259～26516　L esko J et al.Canine distemper virus rep licati on in cells on m icrocarriers.A cta.V iro l,1993,37:412～416IS OLAT I ON AND I D ENT IF I CAT I ON OF V IRUL ENTCAN INE D ISTE M PER V IRUST ian Kegong ,　Yu X iu ling et al.(L abora tory A n i m a l Cen tre ,A cad e m yof M ilita ry M ed ica l S ciences )AbstractTw o strain s of can ine distem per viru s (CDV )w ere directly iso lated from the lung ,liver and lym ph node of infected dogs w ith vero cell cu ltu res .E li m inati on of certain in terfering fac 2to rs that calf serum con tain s ,and incubati on at 33℃w ere the m ain facto rs fo r a successfu l iso lati on .T he tw o strain s of CDV cou ld grow very w ell in vero cell cu ltu res .T he grow th p roperties w ere cytopathogen ic ,inducing cellu lar necro sis ,syncytium fo r m ati on ,and inclu si on bodies w ith in infected cu ltu res .T hey did no t give hem agglu tinati on w ith hum an ,m ou se ,rat ,gu inea p ig ,rabb it ,dog ,m onkey ,ch icken ,p ig ,sheep and Ch inese ham ster red b lood cells .U n 2der electron m icro scope ,the cap sid w as enclo sed by envelope w h ich carries an ou ter fringe of fine sp ikes o r p ro jecti on s .Tw o strain s readily p ro liferated in vero cell cu ltu res ,the m ean tis 2sue cu ltu re infective do ses (TC I D 50)w ere 10-6.50～106.77from 2to 4generati on s .T hat w as h igher than that of viru len t field strain s and vaccine strain s .T he pupp ies individually infected w ith tw o strain s by in traperitoneal inocu lati on and in tranasal inocu lati on show ed distinctive clin ical sign s ,and the m o rtality w as h igh .T he au tho rs su sp ect that viru len t varian t strain s of CDV m ay ex ist in Ch ina . Key words Can ine distem per viru s ,Iso lati on ,Iden tificati on 5512期田克恭等:犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定。