犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定
畜牧兽医学报,1998,29(2),1512154
A cta V eterina ria et Z ootechn ica S in ica
犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定
田克恭 遇秀玲 吴 娜 隋丽华
任晓明 李俊梅 刘永梅 渠川玫
(军事医学科学院实验动物中心,北京100071)
摘 要 从病死犬肺、肝和淋巴结分离到2株CDV,CDV93039和CDV93041。消除小牛血清中的干扰因素和33℃培养是分离成功的主要因素。两株病毒均在V ero细胞生长良好,传2～4代毒力稳定,CPE产生明显,TC I D50为10-6.50～10-6.77,明显高于国内外野毒株和弱毒株的毒力效价。人工感染犬死亡率较高,表明该分离株致病力较强,作者推测我国犬群可能存在CDV强毒变异株。
关键词 犬瘟热病毒,分离,鉴定
犬瘟热是由犬瘟热病毒(Can ine D istem per V iru s,CDV)引起的犬的一种高度接触传染性疾病。六十年代我国部分省市的毛皮动物和犬群中时有发生,并逐渐在全国范围内流行[1]。七十年代末,先后从国外进口的CDV弱毒疫苗中分离到多株疫苗株,并应用于犬及毛皮动物,对该病的预防起到了积极作用[2]。近年来,不仅病犬数量有所增加,而且临床表现也有所不同。分析原因,除母源抗体干扰,疫苗效价低及使用不当外,犬群中是否出现了CDV强毒变异株急待于研究证实。1993年我们采用BA法证实病犬多脏器组织中存在CDV[3]。本实验取这些病犬脏器组织接种V ero细胞,分离到2株CDV强毒。
Ξ
1 材料与方法
111 材料
11111 V ero细胞及培养:卫生部药品生物制品所提供。营养液为10%小牛血清DM E M, pH7.2。维持液为2%小牛血清DM E M。
11112 CDV阳性血清:日本北海道大学惠赠。
11113 动物:3日龄健康幼犬7只,体重215～410kg 只,均未注射任何疫苗。
11114 病料:临床疑似犬瘟热的病死犬,经BA法确诊为CDV阳性者,取其肺、肝和淋巴结分离病毒。病犬编号分别为93039、93041和93043。
112 方法
11211 病毒分离
1121111 病料处理:分别取上述病料,1 5加入无血清DM E M研磨,离心取上清,抗生素除菌。菌检阴性者,-20℃保存,以备病毒分离用。
1121112 小牛血清处理:无血清DM E M洗涤V ero细胞2次,加入培养液1 2量的小牛血清,Ξ19961024
37℃吸附1h,吸附后的血清分装,-20℃保存备用。
1121113 病毒分离:将病料按培养量的1 10接种V ero细胞,33℃吸附1h,加入维持液继续培养,逐日观察细胞病变(CPE),待CPE达80%时收毒,-20℃ 20℃冻融3次,继续传代。11212 电镜观察:刮取接种CDV的V ero细胞,离心弃上清,固定、切片、染色,电镜观察。
11213 病毒理化特性试验:按殷震等(1985)的方法检测93039株对乙醚、pH310和60℃30m in 的耐受性[4]。
11214 病毒血凝特性试验:检测分离株在4℃、22℃和37℃条件下,对1%人“O”型及小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猴、鸡、猪、绵羊、黑线仓鼠、白化黑线仓鼠等动物红细胞的凝集性。
11215 毒力测定:将分离株用维持液1 10倍比稀释,从10-1至10-9,每一稀释度接种4瓶细胞,观察10d,以CPE为指标,按R eed2M uench法计算其TC I D50。
11216 HR P-SPA染色法:按吴小闲等(1992)的方法进行[5]。
11217 回归动物试验:5只犬每只腹腔接种CDV第2代毒5m l,滴鼻2滴,另2只留做对照。逐日观察。取病死犬脏器组织同上检查CDV抗原。
2 结 果
211 病毒分离结果 2d可见细胞变圆,胞质内颗粒增多,融合成小集落。4d胞浆空泡化,可见小的嗜酸性包涵体。6d CPE加重,部分细胞坏死脱落,细胞单层呈拉网状。8d拉网明显,可见多量胞浆及胞核包涵体。10d融合细胞坏死脱落,贴壁细胞约剩20%,收毒。经上述方法从3份病料中分离到2株CDV:93039株和93041株。两个分离株在V ero细胞上生长稳定,CPE出现规律,两株病毒所致CPE一致。
212 电镜观察 病毒主要在胞浆内增殖,在细胞膜表面装配,以出芽方式由细胞膜向外释放。在胞浆内和细胞外可见大量不同形态的病毒颗粒。成熟的病毒粒子可见囊膜,囊膜上可见纤突样结构。
213 理化特性试验结果 见表1。93039株经乙醚、酸和热处理后,其TC I D50与对照组的差值均大于4100,说明该病毒有囊膜,对乙醚敏感,对酸和热的抵抗力较弱。
表1 CD V93039株对乙醚、酸和热的耐受性
Table1 The tolerance of CD V93039stra i n for ether,ac id and heat
试验条件
T est conditi ons
试验组TC I D50
TC I D50of test grup
对照组TC I D50
TC I D50of contro l group
20%ether,4℃,24h pH3.0,37℃,2h
60℃30m in 2.00
2.33
2.33
6.00
6.50
7.00
214 血凝试验结果 在4℃、22℃和37℃条件下,两株CDV均不凝集人“O”型及上述动物的红细胞。
215 毒力测定结果 见表2。两株CDV TC I D50相近,传至第4代毒力稳定。介于10-6.50～10-6.77之间。
251畜 牧 兽 医 学 报29卷
表2 分离株不同代次毒力测定结果
Table 2 TC I D 50of differen t al generation s of isolates
毒株及代次
Strains and
generati ons
不同接毒量及CPE 数V irus diluti ons and num ber of CPE 10-510-610-710-8Contro ls TC I D 50 0.5m l 93039 F 2
4 43 41 40 40 410-6.5093039 F 3
4 43 42 40 40 410-6.7793039 F 4
4 43 42 40 40 410-6.7793041 F 2
4 43 42 40 40 410-6.7793041 F 3
4 43 42 40 40 410-6.7793041 F 44 43 41 40 4
0 410-6.50216 免疫组化染色结果 接毒后第6天,病变细胞呈拉网状,胞浆空泡样变。半数细胞胞浆中可见棕褐色或黄褐色阳性反应物质。
217 回归动物试验结果 感染后9～14d 死亡4只,另一只濒死,第14天剖杀。病犬表现咳嗽、结膜炎、排血样稀便等症状,死后呈角弓反张。剖检可见肺出血水肿,胸腺萎缩,肠系膜淋巴结肿大出血,小肠段出血,脑腔积液,脑实质充血、出血等。经免疫组化染色证实,在死亡犬多脏器组织中广泛存在CDV ,证实死于CDV 感染。
3 讨 论
311 病毒分离:文献报道,CDV 能适应多种细胞培养物[6～16]。但在犬肾细胞上生长缓慢,利用
鸡胚成纤维细胞初代分离更为困难,需经鸡胚绒毛尿囊膜多次传代才能适应[4、11]。本试验选用
V ero 细胞,所用小牛血清经吸附处理,33℃初代培养即获成功。
分析原因可能与以下因素有关:(1)所用病料经BA 染色证实其中存在大量的CDV 抗原[3],减少了分离培养的盲目性。
(2)白泉阳等(1991)[3]报道,小牛血清中含有影响CDV 初代分离的干扰因素。本试验使用吸附处
理的小牛血清,清除了这种干扰因素。
(3)37℃培养V ero 细胞,自然老化和脱落较快,我们在接种病料后,移至33℃培养,有助于延长V ero 细胞的存活时间,易于观察CPE 。另外,自然条件下,CDV 主要经略低于正常体温的上呼吸道粘膜上皮细胞感染,在扁桃体、咽后和支气管淋巴结中增殖后,才扩散至全身各脏器组织。由此分析,33℃培养符合CDV 在动物体内的感染规范,可能是分离成功的原因之一。
312 病毒的毒力:CDV 93039和CDV 93041株在V ero 细胞上传2～4代毒力稳定,TC I D 50高达10-6.50～10-6.77,明显高于国内从水貂分离的CDV 毒力效价(10-2.5～10-2.7)[13]和国外弱毒在我国早期复制时的毒力效价(10-4.5)[2]以及国外分离的CDV SH 株(10-4)、CDV R 252株(10-5)和CDV O nd 株(10-6)的毒力效价[14]。证实本试验分离的两株CDV 毒力较强,人工感染幼犬死亡率较高。由此推测在我国犬群中可能存在CDV 强毒变异株,有待进一步分析该毒株与国外标准毒株之间的抗原关系,最终回答我国流行的犬瘟热是否出现了变异株的问题。
3
512期田克恭等:犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定
451畜 牧 兽 医 学 报29卷
313 根据两株病毒在V ero细胞上的培养特性、理化特性、毒力测定、电镜观察以及免疫组化染色和回归动物试验结果,证实CDV93039和CDV93041均为CDV强毒株。该毒株的分离成功,将为我国CDV的毒株鉴定、疫苗研制、诊断方法的研究提供依据,同时为驯化培育适合我国犬群的弱毒疫苗提供了来源清晰的强毒种源。
参 考 文 献
1 田克恭主编1实验动物病毒性疾病1北京:农业出版社,1992,321～324
2 华国荫等1水貂犬瘟热免疫的研究 1复制鸡胚组织培养弱毒疫苗的研究1畜禽传染病,1980,4:30～35 3 遇秀玲等1犬瘟热病犬脏器组织中的抗原定位及病理形态学观察1中国兽医杂志,1994,20(6):7～9
4 殷 震等主编1动物病毒学1北京:科学出版社,1985,281～285
5 吴小闲主编1医学实验动物微生物学、寄生虫学监测手册1北京:卫生部医学动管会编辑,1992,83～85
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7 M etzler A E et al.V irulence of tissue culture2p ropagated canine distemper virus.Infect.I mm uno,1980, 29:940～944
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11 W righ t N G et al.Canine distemper:current concep ts in labo rato ry and clinical diagno sis.V et.R ec,1974, 94:86～92
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13 白泉阳等1犬瘟热病毒的分离及部分特性研究1兽医大学学报,1991,11(4):347～351
14 Confer AW et al.B i o logical p roperties of a canine distemper virus iso late associated w ith dem yelinating encephalom yelitis.Infect.I mm uno,1975,11:835～844
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16 L esko J et al.Canine distemper virus rep licati on in cells on m icrocarriers.A cta.V iro l,1993,37:412～416
IS OLAT I ON AND I D ENT IF I CAT I ON OF V IRUL ENT
CAN INE D ISTE M PER V IRUS
T ian Kegong , Yu X iu ling et al
.(L abora tory A n i m a l Cen tre ,A cad e m y
of M ilita ry M ed ica l S ciences )
Abstract
Tw o strain s of can ine distem per viru s (CDV )w ere directly iso lated from the lung ,liver and lym ph node of infected dogs w ith vero cell cu ltu res .E li m inati on of certain in terfering fac 2to rs that calf serum con tain s ,and incubati on at 33℃w ere the m ain facto rs fo r a successfu l iso lati on .T he tw o strain s of CDV cou ld grow very w ell in vero cell cu ltu res .T he grow th p roperties w ere cytopathogen ic ,inducing cellu lar necro sis ,syncytium fo r m ati on ,and inclu si on bodies w ith in infected cu ltu res .T hey did no t give hem agglu tinati on w ith hum an ,m ou se ,rat ,gu inea p ig ,rabb it ,dog ,m onkey ,ch icken ,p ig ,sheep and Ch inese ham ster red b lood cells .U n 2der electron m icro scope ,the cap sid w as enclo sed by envelope w h ich carries an ou ter fringe of fine sp ikes o r p ro jecti on s .Tw o strain s readily p ro liferated in vero cell cu ltu res ,the m ean tis 2
sue cu ltu re infective do ses (TC I D 50)w ere 10
-6.50～106.77from 2to 4generati on s .T hat w as h igher than that of viru len t field strain s and vaccine strain s .T he pupp ies individually infected w ith tw o strain s by in traperitoneal inocu lati on and in tranasal inocu lati on show ed distinctive clin ical sign s ,and the m o rtality w as h igh .T he au tho rs su sp ect that viru len t varian t strain s of CDV m ay ex ist in Ch ina .
Key words Can ine distem per viru s ,Iso lati on ,Iden tificati on 5
512期田克恭等:犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定
病毒的分离鉴定讲课教案
病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用
4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
犬瘟热病毒对犬主要脏器的病理学变化
本科生毕业论文 题目犬瘟热病毒对犬主要脏器的病理学变化系别动物医学学院 班级动物医学081班 姓名祖阿力娅·艾山 学号083631102 答辩时间2013年 5月23日 新疆农业大学动物医学学院
目录 研究背景 (1) 1流行病学 (2) 2材料与方法 (2) 2.1材料 (2) 2.1.1实验用肺脏、脾脏 (2) 2.1.2试剂 (2) 2.1.3实验仪器 (3) 2.2实验方法 (3) 2.2.1组织切片制作 (3) 2.2.2显微镜观察 (3) 3 病变 (3) 3.1眼观变化 (3) 3.2组织学变化 (3) 4结果 (4) 5讨论 (5) 6结论 (6) 参考文献 (7) 附图1-4 (8) 附图5-8 (9) 附图9-10 (10) 谢辞 (11)
犬瘟热病毒对犬主要脏器的病理学变化 祖阿力娅·艾山指导老师：阿合买提·买买提 摘要：犬瘟热(canine distemper，CD)是由犬瘟热(CDV)是指由副粘病毒科麻疹病毒属RNA病毒引起的犬科和鼬科等动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，死亡率可高达80%以上，是目前对家庭养犬最具威胁的疫病之一。2012年10月20日在新疆农业大学动物医院收诊一个病例，经临床检查表现为体温39.6 ℃，呼吸30次/min，脉搏为 172次/min，精神沉郁，呼吸困难，肺部听诊呼吸音粗历干呕，湿咳，有湿罗音，流清亮鼻液。下眼睑，睫毛以及内外眼角均粘附着脓性分泌物。为了确诊疾病并更好了解犬瘟热对犬主要脏器的病理学变化，我们把自然感染的犬瘟热病犬麻醉后剖杀,取患犬的肺、脾等组织，制作石蜡切片，HE染色，光学显微镜检查。病理组织学观察结果为肺脏广泛淤血、水肿、肺泡壁增厚、细胞增多，且肺泡壁上有多量的圆型细胞增生；脾肿胀；脾窦扩张淤血、出血，白髓和红髓淋巴细胞明显减少。 关键词：犬、犬瘟热、肺脏、脾脏、病理变化。
犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定
畜牧兽医学报,1998,29(2),1512154 A cta V eterina ria et Z ootechn ica S in ica 犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定 田克恭 遇秀玲 吴 娜 隋丽华 任晓明 李俊梅 刘永梅 渠川玫 (军事医学科学院实验动物中心,北京100071) 摘 要 从病死犬肺、肝和淋巴结分离到2株CDV,CDV93039和CDV93041。消除小牛血清中的干扰因素和33℃培养是分离成功的主要因素。两株病毒均在V ero细胞生长良好,传2～4代毒力稳定,CPE产生明显,TC I D50为10-6.50～10-6.77,明显高于国内外野毒株和弱毒株的毒力效价。人工感染犬死亡率较高,表明该分离株致病力较强,作者推测我国犬群可能存在CDV强毒变异株。 关键词 犬瘟热病毒,分离,鉴定 犬瘟热是由犬瘟热病毒(Can ine D istem per V iru s,CDV)引起的犬的一种高度接触传染性疾病。六十年代我国部分省市的毛皮动物和犬群中时有发生,并逐渐在全国范围内流行[1]。七十年代末,先后从国外进口的CDV弱毒疫苗中分离到多株疫苗株,并应用于犬及毛皮动物,对该病的预防起到了积极作用[2]。近年来,不仅病犬数量有所增加,而且临床表现也有所不同。分析原因,除母源抗体干扰,疫苗效价低及使用不当外,犬群中是否出现了CDV强毒变异株急待于研究证实。1993年我们采用BA法证实病犬多脏器组织中存在CDV[3]。本实验取这些病犬脏器组织接种V ero细胞,分离到2株CDV强毒。 Ξ 1 材料与方法 111 材料 11111 V ero细胞及培养:卫生部药品生物制品所提供。营养液为10%小牛血清DM E M, pH7.2。维持液为2%小牛血清DM E M。 11112 CDV阳性血清:日本北海道大学惠赠。 11113 动物:3日龄健康幼犬7只,体重215～410kg 只,均未注射任何疫苗。 11114 病料:临床疑似犬瘟热的病死犬,经BA法确诊为CDV阳性者,取其肺、肝和淋巴结分离病毒。病犬编号分别为93039、93041和93043。 112 方法 11211 病毒分离 1121111 病料处理:分别取上述病料,1 5加入无血清DM E M研磨,离心取上清,抗生素除菌。菌检阴性者,-20℃保存,以备病毒分离用。 1121112 小牛血清处理:无血清DM E M洗涤V ero细胞2次,加入培养液1 2量的小牛血清,Ξ19961024
病毒的分离鉴定
病毒的分离鉴定 Prepared on 22 November 2020
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。
b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用 4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定 （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细
犬细小病毒的分离与鉴定
犬细小病毒的分离与鉴定 摘要：采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定，并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。结果共分离到3株CPV，分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变，血凝效价达1∶27～1∶210，细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制，接种幼犬后，分离株3可以引起试验犬发病死亡。 关键词：犬细小病毒；分离；鉴定 犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科细小病毒属，为单股、负义、线形无囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在粪便中可存活数月至数年[3]；该病毒对乙醚，氯仿和醇类有抵抗力[4]。CPV一年四季均可发病，以冬、春多发[5]，饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。病犬是主要传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。根据临床症状和血清学反应，可做出准确诊断[8-13]。本研究通过对山东毒株分离，并对其部分生物学特性进行研究，为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。 1.1.2 病料病料为2009～2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV病料，包括20份粪便样品和10份脏器。 1.1.3 试验动物和细胞8只40～50日龄的山东细犬幼犬（抗CPV HI抗体效价小于1∶4），健康状况良好；猫肾传代细胞系（F81）和犬肾传代细胞系（MDCK）等由聊城大学农学院实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 试剂的配制 1）1%猪红细胞悬液的制备。用20 mL注射器内吸入阿氏液3～5 mL，于健康猪前腔静脉采血10～15 mL，立即混匀，4 ℃保存备用。使用时用PBS洗涤保存的猪红细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取红细胞泥1 mL加稀释液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即为1%猪红细胞悬液。 2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取25 μL经福尔马林灭活的CPV细胞培养物，在血凝板上倍比稀释，最后1孔不稀释，作为阴性对照；接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL，于振荡器上振荡1 min混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h，待红细胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%红细胞凝集为终点，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点
二联是犬瘟热病毒和细小病毒的二联苗
二联是犬瘟热病毒和细小病毒的二联苗。 四联是犬瘟热病毒，细小病毒，副流感病毒和腺病毒四种病毒的疫苗。也叫五联（因为腺病毒分两个型）。 六联指的是五联的基础上再加一个冠状病毒或者是狂犬病毒疫苗。 二联是在狗四十五天左右第一次注射用的，因为这时候母源抗体在迅速减少，但是仍旧有少量抗体， 此时并不适合打多联苗，但是犬瘟和细小是发病率和致死率很高的疾病，为预防这两种疾病， 所以要注射二联苗。满2月后就可以注射4联了。 现在好像是要求到指定兽医院打狂犬的，所以6联不用也罢。如果不去打的话，那就在打第三针时打六联或四联加狂犬单独苗。 -------------狗妈7问------------ 1.英特威五联？梅里亚六联？辉瑞四联？哪个好啊怎么区别什么意思？答：英特威五联如果是真的最物美价廉，而且效果很好，但是市面上假的多。 梅里亚六联不可能有假，是介于英特威的最好选择。 辉瑞四联，价格太高，没必要 英特威的假苗比较多，它的5联实际就是6联的（成分中有两种合并算为一种了）。如果打英特威的， 建议打他家的4联苗（实际为5联），一个红色盖子，一个蓝色盖子。因为4联农业部唯一批准的， 其他多联苗走私的成分比较大。 2.辉瑞的到底是四联还是五联的疫苗啊? 答：四联,但可以防5种病，所以一般都说5联。 3.打完美国辉瑞卫佳四联还用打脑炎疫苗吗？脑炎和狗瘟是一种病吗？ 答：是两种病..脑炎疫苗?貌似没有必要啊。 4.美国辉瑞卫佳5犬用疫苗是狂犬疫苗吗? 答：狂犬苗是单独的，5联苗里面不包含狂犬！ 5.英特威的选择和使用程序 答：建议用英特威的。疫苗的差异可以从免疫程序看出来。 英特威的程序： （4周龄）二联——（6周龄）二联——（9周龄）四联——（12周龄）四联+ 狂犬 辉瑞的程序： （6周龄）四联——（9周龄）四联——（12周龄）四联——（13周龄）狂犬差异：英特威首次免疫是4周龄，辉瑞首次免疫是6周龄。 英特威二联疫苗能在4周龄免疫，是因为其二联苗的抗原含量相当高，能突破母源抗体，产生高水平的疫苗抗体。 由于细小病毒等病原引起的疾病都是在小狗出生后早期感染的，所以早期的免疫保护对狗狗很重要。 另外，英特威的四联苗和狂犬苗可以混合在一起注射，两针变作一针，狗狗可以少痛一次。 6.宠物疫苗证有什么用?
犬瘟热的病因与防治措施
犬瘟热的病因与防治措施 摘要：犬瘟热（Canine distempervirus．CDV）是一类具有极高传染性和致死性的传染病。目前对此病还没有特效疗法,主要采用定期注射疫苗方法来加强防制。然而,在现实应用中由于种种因素所致,免疫效果并不太理想,犬瘟热(CDV)仍然非常流行,本文通过对犬瘟热流行病因及防治措施进行了比较系统的综述,希望为该病的预防和控制提供一定的理论依据。 关键词：犬瘟热病毒；病因；防治；传染病 随着人民生活水平的提高，家庭养犬的数量越来越多，犬已变成了很多家庭的成员，这引起犬的饲养数量和密度不断增加，犬的流通变得更为频繁。犬主对犬的各类传染病的认识不够，犬的免疫情况参差不齐，尤其是犬在流通时隔离和检疫措施不够彻底，造成部分犬传染病的发生与流行，引起大批犬死亡，致使养犬场及养犬人士蒙受巨大的经济损失和情感伤害。因此，做好犬传染病的预防和控制工作在养犬业中已经显得日趋重要。犬瘟热是常发行的高度接触性，致死性传染病。本论文主要针对犬瘟热的诊治和预防进行初步探讨。 1 病原 犬瘟热病毒呈圆形或不整形，有时呈长丝状，有囊膜。病毒在干燥、低温的状态下抵抗力强，在－70℃下存活1年以上，在－10℃下存活半年以上，室温下7~8周。对紫外线和热敏感，常用消毒剂如3%氢氧化钠、2%~3%福尔马林、3%~5%来苏儿等均能在10~15min将其杀死。
2 流行病学 犬瘟热的自然宿主为犬科动物（犬、狼、丛林狼、豺、狐等）和鼬科动物（貂、雪貂、白鼬、臭鼬、伶鼬、南美鼬鼠、黄鼠狼、獾、水獭等），在浣熊科中曾在浣熊、密熊、白鼻熊和小熊猫中发现。近年来，发现海豹、海狮等也可感染犬瘟热。 病犬是本病最重要的传染源，病毒大量存在于鼻汁、唾液中，也见于泪液、血液、脑脊髓液、淋巴结、肝、脾、心包液、胸、腹水中，并能通过尿液长期排毒，污染周围环境。主要传播途径是病犬与健康犬直接接触，通过空气飞沫经呼吸道感染或通过污染的食物经消化道感染。有人提出犬瘟热在犬可通过胎盘垂直传播，造成流产和死胎。尚未发现有节肢动物传播犬瘟热的报道。 本病一年四季均可发生，以冬春季多发，有一定的周期性。大约每隔3年有一次大的流行。不同年龄、性别和品种的犬均可感染，以不满1岁的幼犬最为易感。本病在养犬集中的地方发病较多，4～12月龄的幼犬多发，人工感染的发病率为70%以上，死亡率50%以上。2岁以上发病率降低。犬群中自发性犬瘟热发生的年龄与幼犬断乳后母源抗体的消失有关。纯种犬和警犬比土种犬的易感性高，且病情严重，死亡率高。 3 临诊症状 3.1呼吸型 犬瘟热的鼻端变化：病初是鼻流清涕，继发细菌感染之后即出现脓性鼻液。在发病早期和中期，病犬的脓性鼻液减少，仅表现为鼻孔有少许黏稠鼻液或鼻孔周围黏附一薄层干涸的鼻痂；因发热、饮食欲减退和轻度脱水而导致鼻端干燥。此时就控制病情，防止上呼吸道炎症进一步发展，否则黏稠的脓性鼻液会增多，严重时堵塞鼻孔，呼吸困难，精神极度沉郁，鼻端因机体脱水而干燥和角化。 咳嗽：整个病程中咳嗽不显突出，大多数病犬从病初发展到严重的支气管肺炎，甚至出现神经症状时都很少表现出咳嗽。 3.2 消化型 犬瘟热病犬的呕吐则较为多见，病初病犬眼的脓性分泌物一般不会引起重视。在诊疗过程中也容易观察到病犬呕吐，尤其是输液中某些抗生素剂量偏大或输液速度过快时呕吐更易出现。
病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4 小时。
c) 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、 痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2 病毒的分离培养 病毒是严格的细胞寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a) 鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以的受精卵以保证规格质量上 的一致 。 b) 孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱进行,气室向上，孵育的最适温度 为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c) 检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二 天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d) 接种：
(狗)犬瘟热知识大全
（狗）犬瘟热知识大全 犬瘟热是由犬瘟热病毒感染引起的一种高度接触性病毒病。据统计，狗狗因病死亡疑似犬瘟热原因，占84.7%。犬瘟热一直是近几年对狗狗发病率最高、死亡最多、危害最为严重的犬传染病。为此采用多种方法进行试治，有效提高了犬瘟热的防治能力，现将犬瘟热防治的几点体会总结如下： 一、流行特点 1、季节与发病关系：据93—98年门诊病例统计：。本病一年四季均可发生，以冬春季病发率最高。 2、年龄与发病关系：依数据统计，3—12月龄发病幼犬发病率最高，占65%；2岁以上犬较少感染，占17.2%；注射犬瘟热疫苗者，在免疫期内发病5只，占0.2%。孕犬患犬瘟热幸能分娩，产下乳犬一般在10—20日先后出现明显犬瘟热症状并相继发生死亡，母狗大多能在较长时间恢复到痊愈。 3、病程长。除少数最急性外，多数病犬病程2个月以上； 4、死亡率差异很大。一般波动在30—80%之间，大多情况下是由于细菌病毒继发性感染引起死亡。若并发肺炎和脑炎症状，死亡率可达90%以上。若和其它病毒混合感染，死亡率也很高。 二、临床症状 1、前期：患犬表现眼鼻水样分泌物，体温高达40摄氏度以上，持续2天左右，病犬似有好转，稍进食，接近常温。接着又第二次体温升高，持续数周，这时呼吸道、消化道表现卡化性炎症更明显。这种情形一般维持1—2周之间； 2、中期：随着第二次体温的升高不降，病情进一步恶化，各类细菌继发感染更为严重，畏寒颤抖，精神时好时坏，鼻眼分泌物增多转为脓性，口角糜烂。咳、气管炎、肺炎症状多有发生，吐、泻等时有发生，食欲减退或根本不进食，机体逐渐消瘦。这种情形一般持续1月以上。 3、晚期：以神经性症状出现征照。患犬除中期所表现症状外，偶尔还出现神经性症状，表现萎顿、肌疼无力，肌肉阵发性痉挛，平衡失调，圆圈运动，癫痫状惊劂和昏迷等，一般出现此症状维持1—2周犬之便会死亡。 有的病犬中后期在腹下或股内侧等处皮肤出现丘疹、泡疹等，有的形成什蟅肉趾(脚蹄硬化)。 三、预防 1、预防接种：犬瘟热的预防关键是接种犬瘟热疫苗。目前常用疫苗较多，有灭活苗、弱毒苗；有单苗和联苗等，免疫接种后一般在1—2周产生中和抗体，4周后达到高峰，免疫期可达1年。免疫持续期的长短主要受免疫方法、疫苗性状和个体因素等影响，一般在6个月内免疫保护能力较强，但是也有因犬只6个月后因犬瘟死亡原因为犬只自身免疫系统制造滞怠所造成! 2、如已有犬发病，应采取下列措施： （1）隔离病犬，对有典型临床症状的病犬，应立即将犬隔离。对犬舍可用3%甲醛溶液、0.5%过氧乙酸溶液或3%苛性钠溶液进行彻底消毒。
病毒分离鉴定技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。其特征为发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎，幼龄仔猪发生呼吸道症状[1]。1987年在美国中西部首先发现该病，并分离到病毒，其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。目前该病已在全球范围内传播、蔓延。我国郭宝清等[4]于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。国内诸多血清学检测结果表明，该病在我国许多地方已有流行[5]。河南某猪场"猪场发生临床症状疑似PRRS的传染病，用间接ELISA法检测，呈PRRS 抗体阳性。从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV，并对其进行了一系列的鉴定。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1病料采自河南某猪场疑似PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。 1.1.2细胞及血清细胞系Marc145、Vero、PK15均购自中国兽药监察所；阳性血清购自中国兽药监察所；阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清，经中和试验证明为阴性。 1.1.3主要试剂及试剂盒RNasin、dNTP、反转录 Buffer、MMLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖为 Sigma公司产品；其他常规试剂均为分析纯；UNIQ10柱式Trizol 总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.1.4RTPCR引物设计根据GenBank公布的PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列，参照文献[6]自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物，引物扩增片段长度为720bp；上游引物P1 5′CTG GAG CCG TGC TAT CAT3′；下游引物P2 5′TCC ATT TCA TGA CAC CTG3′。 1.2方法 1.2.1细胞培养生长液为含100 mL/L新生牛血清(NCS)的RPMIl640培养液；维持液为含20 mL/L NCS的RPMIl640培养液。Marc145、Vero和PK15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37 ℃培养至单层后传代培养。 1.2.2病料的处理无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用Hanks液研磨并制成5倍～10倍的乳悬液，反复冻融3次后，经5 000 r/min离心30 min，上清悬液用0.22μm微孔滤膜过滤后，－20 ℃保存备用。 1.2.3病毒的分离将上述处理的病料悬液1 mL分别接种于长成单层的 Marc145细胞、Vero细胞和PK15细胞，37 ℃吸附1 h，补加维持液至8 mL，继续培养3 d～5 d，反复冻融3次，收获培养上清液，同时设参考毒株、正常细胞作为对照。出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代，供进一步检测备用，连传5代未出现CPE者判为阴性。
犬瘟热
犬瘟热 犬癌热（caninedistemper，CD)，俗称“犬瘟”，是由犬瘟热病毒引起的 一种犬科（犬、狐、貉）、融科（水貂、雪貂、黄貂）和浣熊科动物的急性、 热性和高度接触性传染病。该病传染性强、发病率高、传播广，遍布全世界。 临床症状极为多样，以双相热型、鼻炎、严重消化道障碍和呼吸道炎症等为特 征。少数病例可发生脑炎。继发细菌感染和二次感染时，病情加重，死亡率高 达80%以上；康复犬还易遗留抽搐、癫痫、麻痹等后遗症。 【病原及流行病学】 （1）犬瘟热是由犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV)引起的一种 传染病。 （2）犬瘟热病毒为单股负链不分阶段的RNA病毒，属于副黏病毒科、麻 疹病毒属，与该属的麻疹病毒和牛瘟病毒有密切的抗原关系。 （3）犬瘟热病毒的抵抗力不强。 ，常规消毒剂可杀灭环境中的病毒。☆乙醚 改三氯甲烷 *xx 石炭酸 食季铵盐消毒剂
*氢氧化钠溶液 ★紫外线 ·室温（20℃）下，病毒可在组织和分泌物中存活3小时。 ·2~4℃可存活数周，50~60℃1小时可灭活该病毒。 ·气温越低，大癌热病毒的存福时间越长，在一70℃或冻干条件下可长期保存。 ◆最适pH为7.0~8.0.第1 （4）该病的流行特征。 ·宿主范围较广。 ☆犬科（犬、狐狸、材、狼等） *随科（貂、xx、黄融、白购、猪等） 浣熊科（海豹、xx、浇熊、xx熊等） *猫科（虎、豹、狮） ·在世界各地均有犬瘟热发生。 ·断奶至1岁龄犬发病率最高，老龄犬和哺乳仔犬极少发病。 ·仔犬可通过胎盘和初乳获得抗体而获得保护。（5）本病一年四季都可发生。 ·但以冬季和早春多发。 ·有每隔2~3年流行一次的周期性。 ·发病动物和带毒动物是该病的传染源。 （6）传播途径主要是呼吸道，其次是消化道。
犬瘟热病的病因及防治措施.doc
犬瘟热病的病因及防治措施 概述：犬瘟热，又名犬麻疹、狗瘟等，为一广布全世界的犬科动物之严重高传染病毒性疾病，本病对幼犬乃为高死亡率之传染病。一、病因 犬瘟热俗称狗瘟，是由犬瘟热病毒引起的感染肉食兽中的犬科(尤其是幼犬)鼬科及一部分浣熊科动物的高度接触传染性致死性传染病。此病的特征：呈现双相热型(即病初体温升高达40℃左右,持续1～2d后降至常温,经2～3d后,体温再次升高),鼻炎、支气管炎及呼吸和消化严重障碍，少数病例可出现脑炎,鼻部和脚垫的高度角化症状。病犬的各种分泌物、排泄物(鼻汁、唾液、泪液、心包液、胸水、腹水及尿液)以及血液、脑脊髓液、淋巴结、肝、脾、脊髓等脏器都含有大量病毒，并可随呼吸道分泌物及尿液向外界排毒。健康犬与病犬直接接触或通过污染的空气或食物而经呼吸道或消化道感染。除幼犬最易感染外，毛皮动物中的狐、水貂对犬瘟热也十分易感。犬瘟热病毒对热和干燥敏感，50～60℃，30min即可灭活，在炎热季节犬瘟热病毒在犬群中不能长期存活，这可能是犬瘟热多流行于冬春寒冷季节的原因，在较冷的温度下，犬瘟热病毒可存活较长时间，在2～4℃可存活数周，在-60℃可存活7年以上，冻干是保存犬瘟热病毒的最好方法。犬瘟热病毒对紫外线和有机溶剂敏感，最适pH7.0,pH4.5～9.0条件下均可存活,0.75%碳酸和0.3%季胺类消毒剂4℃,10min不能灭活病毒,临床上常用3%的NAOH作为消毒剂效果很好。 二、诊断要点
临床特征：体温呈双相热型(即病初体温升高达42℃左右，持续1～2d后降至正常，经2～3d后，体温再次升高);第二次体温升高时(少数病例此时死亡)出现呼吸道症状，病犬咳嗽、喷嚏、流浆液性至脓性鼻汁，鼻镜干燥，眼睑肿胀，化脓性结膜炎，后期常可发生角膜溃疡;下腹部和股内侧皮肤上有米粒大红点、水肿和化脓性丘疹;常发呕吐;初便秘，不久下痢，粪便恶臭，有时混有血液和气泡。少数病例可见足掌和鼻翼皮肤角化过渡性病变。约有10～30%的病犬出现神经症状(痉挛、癫痫、抽搐等)。本病的致死率可高达30～80%。如与犬传染性肝炎等病混合感染时，致死率更高。由于本病常与犬传染性肝炎等病混合感染及继发感染细菌，使症状复杂化。因此，单凭上述症状只可作出初步诊断，最后确诊还须采取病料(眼结膜、膀胱、胃、肺、气管及大脑、血清)送往检验单位，做病毒分离、中和试验等特异性检查。 三、治疗方法 感染犬瘟热病毒早期应用特异性犬瘟热病毒单克隆抗体或大剂量高免血清，具有较好的治疗作用。当出现神经症状时，应用特异性犬瘟热病毒唑(利巴韦林)、双黄连等抗病毒药物进行治疗，犬感染犬瘟热病毒后常继发细菌感染，可根据病情应用抗菌素，如青霉素、头孢菌素、喹诺酮类、普康素等进行治疗，以减少死亡，缓解病情，王畔新等(2000年)报道，用速高捷疗治疗有神经症状的犬瘟热病总有效率达86%。对于犬瘟热临床症状明显，出现神经症状的中后期病，即使注射犬瘟热高免血清也大多很难治愈。治疗本病的有效方法是在患
病毒的分离与测定
第二十九讲病毒的分离与测定 教学目的：掌握病毒效价的测定方法 教学重点：噬斑法、终点法 教学难点：病毒的分离与鉴定 课时分布：1学时 教学过程： 一、病毒的分离与纯化 1、病毒的分离 病毒的分离是将疑有病毒的样品经处理后，接种于敏感的宿主，经培育后，通过检查其特异性病理表现或其它方法以肯定病毒的存在。 （1）标本的采集与处理标本应含有足够量的活病毒；加入抗菌素除细菌；研磨或超声波处理破碎细胞，让病毒充分释放出来；标本处理后立即接种，否则冷冻保藏。 （2）标本接种与感染表现接种实验宿主（动植物、细菌）、鸡胚或细胞（要求：操作简单、易于培养、产生的感染结果易判定）。噬菌体以噬菌斑为标记；动物病毒产生致细胞病变效应；植物病毒致敏感质感植物出现坏死斑或枯斑。 2、病毒纯化 通过分离得到的是病毒感染的宿主机体、组织或破细胞后的抽提物，或感染的宿主的体液、血液和分泌物，或培养液，须将杂质成分除去。 （1）病毒纯化的标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性。 （2）病毒纯化的方法毒粒的主要成分是蛋白质，故可利用蛋白质提纯方法纯化；毒粒具一定的大小、形状和密度，可离心提取。 二、病毒的测定 在谷氨酸、抗菌素、酶制剂等生产中，经常出现不正常的发酵现象。发酵缓慢、发酵液含菌数下降、菌体畸形、耗糖缓慢或停止，镜检时发现有云雾状碎片，严重时以致倒罐。
1、病毒的物理颗粒计数 （1）电镜下直接计数 （2）血细胞凝集试验许多有包膜的动物病毒能在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球，凝集量与病毒浓度成正比。 此外，可根据病毒的抗原性质，与抗体发生特异性结合，利用分光光度计对病毒进行定量。但灵敏度较低，多在特殊情况下使用。总之，该方法测得的是有活力与无活力病毒数量的总和。 2、病毒的感染性测定 测定的是因感染所引起宿主或细胞发生某一特异性病理反应的病毒数量。 病毒感染单位：能引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量。 病毒效价：指单位体积病毒悬液的感染单位数目。 （1）噬菌斑的测定 噬菌斑：噬菌体感染敏感细胞后，通过复制使宿主细胞裂解，释放大量噬菌体，扩散到周围的细胞中，继续侵染，从而在有噬菌体的地方形成一个透亮无菌近似圆形的空斑。它是phage存在的一种指示性指标。 在液体培养基中培养物变清。一个phage产生一个噬菌斑，故可根据在固培上形成的噬菌斑数测得phage的效价。通常是将噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌以及半固体琼脂均匀混合后涂布在较高浓度的营养琼脂上，培养后计算噬菌斑数便可算出噬菌体效价。 ①双层平板法 底层培养基10ml 上层培养基4ml、凝固 指示菌0.2 ml、检样0.1 ml →32℃16-24h 测定前，事先配制含2%和1%的琼脂底层培养基和上层培养基，将铺成平板，用无菌吸管吸取一定量的指示菌和被测样品与上层培养基混合，冷到45℃迅速倒在底层平板上铺平，凝固后恒温培养16—20小时，如有phage存在，则在双层琼
一例犬瘟病毒病例报告
一例犬瘟病毒病例报告 1.实例治疗 1.1病例基本情况 就诊日期：2016.04.17 动物种类：阿拉斯加雪橇犬性别：雄性体重：7.2kg 年龄：2个月 就诊叙述：该犬2016年4月16日发病，精神沉郁、食欲下降、喝水，呼吸急促，流鼻涕，眼眶周围有红色疱疹。发病二天后就诊时，食欲、饮欲完全废绝，体温39.9℃，心跳、呼吸正常。未注射疫苗，未到室外，但主人有到犬聚集的场所活动。 1.2临床症状 患病犬表现为打喷嚏，咳嗽，眼结膜苍白，有时轻度下痢。精神沉郁、食欲下降、喝水，呼吸急促，流鼻涕，眼眶周围有红色疱疹。如图1所示 图1病犬眼眶周围有红色疱疹 1.3诊断 根据初步怀疑的结果，采取CDV快速诊断试剂盒进行进一步确诊。测试步骤为： 1)用棉签采集疑似病例的鼻液，结膜上皮细胞； 2）将棉签插入试管中并搅拌5次； 3）静置试管1min； 4）取出试剂盒，平放于干燥的表面； 5）吸管吸取上层清夜； 6）用滴管向样品孔中垂直加入4滴混合液；
7）如1min仍未发生反应，应往样品孔中加1滴混合液； 8）10min判断结果，将T对应的位子印记与C对应的位子印记进行对照， 对照结果不同诊断结果也不同，具体结果如下： a)在T对应的位子印记不明显，则说明犬瘟热病毒成假阳性； b)颜色逐步逼近与C对应的印记，则说明结果呈阳性； c)颜色比C对应的印记深色并且反应速度快，则说明结果呈强阳性，通常 病情越严重，受感染的病犬的治愈率就越低； d)在T对应的位子上没有印记，则说明没有感染犬瘟热病毒,结果的阳性阴性结果如图2.所示： 图2 CDV快速诊断试剂盒结果 结果为cdv+,呈明显阳性。依据上述症状及检测结果，初步诊断为犬瘟热病 毒感染。 1.3治疗 治疗原则为：增强抗体、中和病毒、防止继发感染、防止脱水、止吐、止血、止痢、补液、强心、调节电解质平衡，防止酸中毒等，提高患犬综合抵抗能力，帮助度过重症期。 此次治疗采取特异疗法与对症疗法相结合： 1）抗病毒： 犬二联王血清 5ml/次 sc 2）防止继发感染： 氨苄西林1.0g 0.9%氯化钠 100mL iv 3）清热解毒： 清开灵 5mL 0.9%氯化钠 100mL iv 4）提高免疫力，提供能量： 维生素C 2mL 0.9%氯化钠 100mL iv
关于编制犬瘟热病毒单克隆抗体项目可行性研究报告编制说明
犬瘟热病毒单克隆抗体项目可行性研究报告 编制单位：北京中投信德国际信息咨询有限公司编制时间：https://www.360docs.net/doc/58265540.html, 高级工程师：高建
关于编制犬瘟热病毒单克隆抗体项目可行 性研究报告编制说明 （模版型） 【立项 批地 融资 招商】 核心提示： 1、本报告为模板形式，客户下载后，可根据报告内容说明，自行修改，补充上自己项目的数据内容，即可完成属于自己，高水准的一份可研报告，从此写报告不在求人。 2、客户可联系我公司，协助编写完成可研报告，可行性研究报告大纲（具体可跟据客户要求进行调整） 编制单位：北京中投信德国际信息咨询有限公司 专 业 撰写节能评估报告资金申请报告项目建议书 商业计划书可行性研究报告
目录 第一章总论 (1) 1.1项目概要 (1) 1.1.1项目名称 (1) 1.1.2项目建设单位 (1) 1.1.3项目建设性质 (1) 1.1.4项目建设地点 (1) 1.1.5项目主管部门 (1) 1.1.6项目投资规模 (2) 1.1.7项目建设规模 (2) 1.1.8项目资金来源 (3) 1.1.9项目建设期限 (3) 1.2项目建设单位介绍 (3) 1.3编制依据 (3) 1.4编制原则 (4) 1.5研究范围 (5) 1.6主要经济技术指标 (5) 1.7综合评价 (6) 第二章项目背景及必要性可行性分析 (7) 2.1项目提出背景 (7) 2.2本次建设项目发起缘由 (7) 2.3项目建设必要性分析 (7) 2.3.1促进我国犬瘟热病毒单克隆抗体产业快速发展的需要 (8) 2.3.2加快当地高新技术产业发展的重要举措 (8) 2.3.3满足我国的工业发展需求的需要 (8) 2.3.4符合现行产业政策及清洁生产要求 (8) 2.3.5提升企业竞争力水平，有助于企业长远战略发展的需要 (9) 2.3.6增加就业带动相关产业链发展的需要 (9) 2.3.7促进项目建设地经济发展进程的的需要 (10) 2.4项目可行性分析 (10) 2.4.1政策可行性 (10) 2.4.2市场可行性 (10) 2.4.3技术可行性 (11) 2.4.4管理可行性 (11) 2.4.5财务可行性 (12) 2.5犬瘟热病毒单克隆抗体项目发展概况 (12)
犬瘟病毒引起的肺炎
犬瘟病毒引起的肺炎 症状:进行性呼吸困难,体温40度以上,精神沉郁、嗜睡、厌食或废食，出现低幅度的深咳嗽，呼吸增数，节律改变 发病原因 1、病毒性肺炎。见与犬瘟热病毒、犬腺病毒I和II、犬副流感病毒、疱疹病毒、呼肠病毒。 2、细菌性肺炎。见于衣原体、支原体、链球菌、葡萄球菌、支气管败血博氏杆菌、克雷白氏杆菌等感染。 3、真菌性肺炎。见于球孢子菌、芽生菌、组织胞浆菌、隐球菌和曲霉菌等感染。 4、寄生虫性肺炎。见于毛细线生、类丝虫、蛔虫和钩虫的幼虫、弓形虫等感染。 5、异物、外伤、呕吐物、药物、刺激性物质吸入或某些过敏反应等，引起的外伤性和异物性肺炎或过敏反应性肺炎。 6、一些化脓性疾病。如子宫炎、乳房炎等，其病原菌经血液进入肺，引发起的肺炎。 治疗: 细菌性肺炎:抗生素或磺胺类药物治疗 真菌性肺炎:两性霉素B,1.8mg/kg，加入5%葡萄糖溶液中，静脉注射，7天为一个疗程，间7天后再进行下一个疗程 寄生虫性肺炎选用驱虫药物治疗。 呼吸困难和心脏衰弱时，选用麻黄碱口服。每次5-15毫克。氨茶碱，每公斤体重10毫克，克服或静脉注射，每8小时一次。对于呼吸困难引起缺氧的，应给予氧气吸入。厌食者，给予静脉注射补充体液和营养。 预防可打疫苗，如犬瘟热、犬腺病毒II型、犬副流感，以及支原体和支气管败血博氏杆菌疫苗等。 1)消除炎症：消炎常用抗生素，如青霉素、链霉素、四环素、土霉素、红霉素、卡那霉素及庆大霉素等。若与磺胺类药物并用，可提高疗效． (2)祛痰止咳；对频发咳嗽，分泌物粘稠、咳出困难时，可选用溶解性祛痰剂，如氯化铵0．2～1克／次。以10～20％痰易净(易咳净)溶液行咽喉部及上呼吸道喷雾，一般用量为2～5毫升／次，1日2—3次。溴苄环己铵(必消痰)，其用量为6～15毫克／次，1日3次，一般病例可用药4～6日，重病和慢性病例应持续用药。此外，也可应用远志酊(10～15毫升／次)，远志流浸膏(2～5毫升／次)，桔梗酊(10～15毫升／次)、桔梗流浸膏(5～15毫升／次)等。 (3)制止渗出和促进炎性渗出物吸收：可静脉注射10％葡萄糖酸钙，或以10％安钠咖2～3毫升、10%水杨酸钠10～20毫升、40％乌洛托品3～5毫升，混合后静脉注射。 (4)对症治疗：主要是强心和缓解呼吸困难。为了防止自体中毒，可应用5％碳酸氢钠注射液等。 (5)提高机体枕御力，加强日常的锻炼，提高机体的抗病能力：避免机械因素和化学因素的刺激，保护呼吸道的自然防御机能，及时治疗原发病。 [疗治] 1、抗菌消炎。可根据药敏试验结果使用抗生素，也可根据经验选择氨苄青霉素(40毫克/千克体重)、头孢唑啉或头孢拉啶(30毫克/千克体重)，每天2次。也可并用严迪、罗红霉素(75~150毫克/次，每天2次)、利君沙(0.2~0.3克/次，每天3~4次，口服)。 2、解痉。应用盐酸麻黄碱5~15毫克，口服，每天2次;醋酸泼尼松，0.5~1毫克/千克体重，口服，隔日1次。 胸腔内存在渗出液和气胸时，可通过穿刺排除。对湿性咳嗽的病犬应给予氯化铵100毫克/千克体重，口服，每天2次。重症犬要注意体液的酸碱平衡、电解质平衡
犬瘟热感染的原因,犬瘟热病毒测试
犬瘟热感染的原因,犬瘟热病毒测试 犬瘟热的预防 该病是由犬瘟热病毒引起的一种高度接触性传染病。该病的潜伏期为3~6天（最长17~21天），病程长达一个月左右。本病死亡率为30%~80%，当发生继发感染时（常与狗狗传染性肝炎混合感染）则死亡率更高。 治疗犬瘟热的办法是定期进行免疫接种犬瘟热的疫苗。 一旦狗狗发生犬瘟热，为防止疫情蔓延，必须迅速将生病的狗狗严格隔离，患病狗狗的窝和环境用火碱、次氯酸钠、来苏水等彻底消毒。禁止患病的狗狗和健康的狗狗接触。 爱狗助理提醒您： 犬瘟热感染途径有一下： 飞沫传染：患病狗狗的喷嚏等飞沫随空气一同被吸入感染。 间接传染：通过患病狗狗的牙刷、食盘、玩具等感染。 直接传染：接触患病狗狗的鼻口，被患病狗狗咬、舔儿治病。 犬瘟热病毒测试 现在科学技术越来越发达了，很多要临床确诊的疾病，不要在去医院用大型的仪器，只需要一些简简单单的试纸就可以测试了，犬瘟热是狗狗的第一类急性传染疾病,发病率高，治疗费用昂贵，那我是不是也可以给狗狗做一个犬瘟热测试呢?该如何进行测
试? 墨西哥无毛犬 对于刚买回来的狗狗，几天之后出现类似感冒的症状：发烧、流鼻涕、打喷嚏等，一定要注意了这也许就是犬瘟热的症状，由于与感冒的症状很相近，常常被狗狗主人所忽略。这时主人最好选购犬瘟热试纸，测试一下狗狗是否感染上犬瘟热，一旦感染就要抓住最佳治疗时间进行治疗。只有了解犬瘟热试纸用法才能得出正确的测试结果。 根据说明说上犬瘟热试纸用法，来一一完成测试程序。首先用棉签取狗狗的眼屎、鼻涕、唾液、等分泌物，当做被测物。然而把取出的样品放到装有稀释液的瓶子中，然而搅拌让其充分稀释。之后再用吸管吸取被稀释的被测物，滴4滴在测试纸板上。还需要等到5到10分钟观察测试结果，但是要切忌不能超过10分钟，否则结果就不准确了。 接下来就是判断测试结果了，把测试结果与对照线作比较，就会得出显阳性还是阴性了。当只有对照线C显示红色或者紫色时表示阴性，阴性代表狗狗没有感染犬瘟热病毒;当测试线T与对照线C一起显示红色或者紫色时表示阳性，阳性代表狗狗已经感染上犬瘟热病毒了。 若你家狗狗每年都有接种疫苗的话一般是不会得犬瘟热的，犬瘟热病毒一般是威胁体抗力较差的狗狗，比如：未接种过疫苗的幼犬，年迈的老狗自身体抗力差，再加上未注射疫苗，经常和患了犬瘟热的狗狗生活在一起等等。这些情况下感染犬瘟病毒的