酶与细胞固定化技术样本
5酶与细胞固定化技术
例：伴刀豆球蛋白Ａ与酿酒酵母细胞壁 ａ-甘露聚糖具有亲和作用，故可将伴 刀豆球蛋白Ａ先连接到载体上，然后把 酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上
二、酶的固定化技术
（一）吸附法
酶材料
酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系
常用吸附剂
各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，
硅藻土，多空陶瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天
二、酶的固定化技术
（一）吸附法
例：
将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50 ml（在10mM PBS pH 7.4 含 0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10 mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜， 便成琼脂糖复合物 用10 mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2） 充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮 于10 ml NaAc PBS中备用
二、酶的固定化技术
（三） 交联法
交联法有5种形式
②酶辅助蛋白交联 为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起失 活，可使用第二个“载体”蛋白质（即辅助蛋白质，如 白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶 与惰性蛋白质共交联。实用中，当酶蛋白、无酶活性蛋 白与戊二醛混合（戊二醛最终浓度0.7%）后，混合液粘 度开始提高时，立即铺膜，或者在酶蛋白戊二醛与辅助 蛋白混合后，经-30℃低温处理，再预热至4℃而得泡沫 状蛋白质共聚物。这种固定化酶为多孔性，活力回收比 酶直接交联高，机械性能也有改进
体的氨基和酶蛋白中的氨基交联形成
Shiff碱（含碳氮双键）将酶固定化。含 氨基的载体，可用胺乙基纤维素（纤维
素-OCH2CH2NH2），二乙氨乙基纤维
酶与细胞的固定化课件.ppt
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。
酶与蛋白质工程固定化酶与固定化细胞演示文稿
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和 的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行 现已有多种偶联反应能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定作用，必须考
虑到酶的偶联效率，固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素
如，用乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以用
DEAE-纤维素载体有效固定。这种固定几乎是不可逆的吸附
此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及
酶和载体的特性相关
➢ pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附
酶与蛋白质工程固定化酶与固 定化细胞演示文稿
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（优选）酶与蛋白质工程固定 化酶与固定化细胞
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固定化酶
固定化酶与水溶性酶比较具有以下优点：
(1) 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化 了提纯工艺
(2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化 (3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化 (4) 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性
(5) 较能适应于多酶反应
(6) 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低
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固定化酶
砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每一葡萄糖产生两个醛基)高聚物，可 与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶
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例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木瓜蛋白酶
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术是一种常见的生物技术，在制药、化工、食品等领域广泛应用。
酶是一种天然催化剂，在一系列生化反应中起到了至关重要的作用。
然而，酶在传统的反应过程中通常难以重复利用，并且容易受到环境因素的影响导致其活性降低。
为了克服这些困难，研究人员发明了酶固定化技术，即将酶固定在固体基质上，从而提高其稳定性和功效。
使用固定化酶，可以在更广泛的工业应用场景中实现更高效、经济的生物转化过程。
固定化技术不仅可以应用于酶，还可以用于固定化细胞。
细胞固定化是将细胞固定在一种固定化基质上，以便在化工过程中重复使用。
固定化细胞繁殖能力更强，可稳定持续的提供所需生产物。
比如，用固定化酵母发酵葡萄汁制成果酒或啤酒。
固定化技术的实现方式有很多种，例如物理吸附、共价键结合、交联等。
其中最常见的方法是交联法，通过交联剂，如谷氨酸或戊二醛，将酶或细胞固定在载体上。
经过固定处理后，酶或细胞的增稳特性明显增强，同时也具有更广泛的适应性。
在化学反应中，固定化酶可用于一系列生产过程，包括生成和破坏多种化学键以及催化合成。
这种方法还可以改善化学反应的选择性和增加产物的纯度。
总之，酶及细胞固定化技术已成为现代生物工程的重要组成部分，它为生产高品质、低成本的化学品、食品、医药品以及可再生能源等提供了新的可能性。
由于固定化技术的成熟和发展，它在未来的研究和应用中将会得到越来越广泛的应用。
酶和细胞固定化方法
酶和细胞固定化方法
作用力载体
物理吸附法物理吸附石英砂，多孔玻璃，淀粉，硅胶，活性碳
载体结合法离子结合法离子键离子交换树脂
共价结合法共价键纤维素，尼龙
交联法：利用双功能试剂，在酶分子间发生交联，凝胶形成网状结构。
包埋法：将酶包埋在凝胶的微细格子里，或被半透性的聚合膜所包埋，使酶分子只能从凝胶的网络中漏出，而小分子的底物和产物可自由通过。
格子型常用凝胶：角叉菜胶，明胶，淀粉凝胶，聚丙烯酰胺凝胶
微胶囊。
酶与细胞固定化的方法
酶与细胞固定化的方法酶呀，就像是细胞世界里的小精灵，它们有着神奇的魔力，可以加速各种化学反应的进行。
那怎么才能把这些小精灵更好地利用起来呢？这就涉及到细胞固定化啦！细胞固定化，简单来说，就是给酶找个安稳的“家”，让它们能老老实实地在那里发挥作用。
那都有哪些方法呢？有一种方法就像是给酶盖房子，这就是吸附法。
就好像磁铁能吸住铁钉一样，一些具有吸附能力的材料可以把酶吸附住。
这些材料就像是酶的小窝，让酶舒舒服服地待在里面。
这种方法简单又方便，不需要太复杂的操作。
还有包埋法，这就好像把酶包在一个小口袋里。
用一些特殊的材料形成一个小网格，把酶困在里面。
酶在这个小口袋里依然可以自由活动，发挥它们的本领。
交联法呢，就像是给酶之间拉起很多“绳子”，让它们彼此连接固定起来。
就像小朋友们手牵手一样，这样酶就不容易乱跑啦。
这些方法各有各的特点和适用情况呢。
比如说吸附法，操作简单，但是可能不太牢固，酶容易跑掉。
包埋法呢，能很好地保护酶，但有时候可能会影响酶的活性。
交联法比较牢固，但操作起来可能稍微麻烦一点。
那我们为什么要费这么大劲去固定化酶呢？这好处可多啦！固定化后的酶可以重复使用呀，就像我们的工具一样，用了一次还能再用，多划算！而且它们的稳定性也提高了，不会轻易被破坏。
这就好比一个娇弱的小公主变成了坚强的女战士。
想象一下，如果没有这些细胞固定化的方法，我们的很多生产过程会变得多么麻烦呀！酶就像一群调皮的小孩子，到处乱跑，不好管理。
但是有了这些方法，它们就变得乖乖的，为我们的生活和生产带来了很多便利。
在实际应用中，我们要根据具体的情况选择合适的方法。
就像我们穿衣服一样，不同的场合要穿不同的衣服。
我们要让酶在最合适的环境中发挥最大的作用。
总之，酶与细胞固定化的方法是非常重要的，它们就像是打开生物技术大门的钥匙。
让我们更好地利用这些神奇的酶，为我们的生活创造更多的美好和可能吧！难道不是吗？。
固定化细胞制备及应用事例
固定化细胞制备及应用事例固定化细胞是将活细胞固定在材料上，以实现其在生物反应或工业生产中的应用。
利用固定化细胞可以提高细胞的稳定性和生物活性，延长其寿命，并简化细胞分离和生产过程。
下面将介绍固定化细胞制备及应用的一些事例。
一、酶固定化1. 葡萄糖异构酶固定化：葡萄糖异构酶（GI）是一种重要的酶，用于将葡萄糖转化为果糖。
将GI固定在聚丙烯酸酯(PVA)凝胶中，可以实现连续和稳定的果糖生产。
此外，还可以将GI固定在金属氧化物纳米粒子上，以提高反应速率和酶稳定性。
2. 乳酸脱氢酶固定化：乳酸脱氢酶（LDH）是一种用于乳酸生产的重要酶。
将LDH固定在Ca2+交换树脂上，可以实现连续乳酸生产。
固定化LDH不仅具有较高的稳定性和重复使用性，还可以避免产物污染。
二、生物传感器1. 葡萄酒品质传感器：利用固定化酵母细胞制备的生物传感器，可以检测葡萄酒中的氨基酸和糖分等物质，以评估葡萄酒的品质。
固定化酵母细胞可以提高传感器的灵敏度和稳定性。
2. 环境污染物传感器：将大肠杆菌等细菌固定在传感器的电极表面上，可以实现对环境中污染物的实时监测。
固定化细菌可以与特定的污染物发生反应，并产生电流信号，从而实现环境污染物的快速检测。
三、药物传递系统1. 肿瘤靶向治疗：将抗癌药物固定在载体上，并加上靶向配体，可以实现对肿瘤细胞的选择性靶向治疗。
固定化药物可以提高药物的稳定性和生物利用率，减少药物对正常组织的毒性。
2. 糖尿病治疗：将胰岛素固定化在高分子材料上，并用于制备胰岛素缓释系统，可以实现糖尿病的长期治疗。
固定化胰岛素可以延长药物的作用时间，减少频繁注射的需要。
四、废水处理1. 有机废水处理：将具有降解有机物能力的细菌固定在废水处理装置中，可以高效降解废水中的有机物。
固定化细菌可以在较宽的温度和pH范围内工作，减少对环境的影响。
2. 污水氨氮去除：将氨氧化细菌固定在生物反应器中，可以实现对污水中氨氮的高效去除。
固定化细菌可以提高氨氮去除速率和稳定性，减少传统处理方法所需的空间和时间。
固定化酶与固定化细胞技术
固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。
作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。
由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。
但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。
由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。
酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。
由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。
如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。
从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。
随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。
对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。
一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。
第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。
固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。
目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。
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第五章酶与细胞固定化技术教学目：使学生理解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）概念及意义，掌握酶惯用固定化技术，理解固定化酶性质。
教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）范畴，各种固定化技术。
固定化酶（细胞、原生质体）范畴,半透膜包埋法。
教学办法：讲授教学手段：多媒体第一节概述一、游离酶使用中局限性:1.提取纯化繁琐,价格昂贵2.难以重复使用3.稳定性差二、固定化酶研究克服游离酶缺陷办法之一50年代开始60年代后期，固定化技术迅速发展1969年，千田一郎初次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA持续生产L-AA实现酶应用史上一大变革三、基本概念1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议）（Immobilized Enzyme)指在一定空间范畴内呈闭锁状态存在酶，能持续地进行反映，反映后酶可以回收重复运用。
涉及酶与不溶性载体结合“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中酶。
2、固定化细胞（原生质体）指被限制自由移动细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范畴内，但细胞仍保存催化活性并具备能被重复或持续使用活力。
四、固定化酶长处增长了酶稳定性能减少酶总体费用酶分离和回收变得容易，并可重复使用使反映过程持续操作成为也许反映产物也易于提取纯化有助于过程设计和优化拓广了酶应用范畴（多酶系统酶反映，非水相酶反映，生物传感器探头等）第二节、酶固定化办法一、酶固定化办法1、酶固定化办法（四大类办法）1）吸附法2）包埋法3）交联法4）化学共价法其他（酶逆胶束包囊法）一、酶固定化办法2、选取办法根据：⑴酶性质⑵载体来源、价格、机械性能、载体功能基团和交联度等⑶制备办法简便易行⒊衡量根据：⑴测定固定化酶活力，以拟定固定化过程活力回收率；⑵研究它最适反映条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）；⑶稳定性和不稳定因素探究；⑷对酶进行人工修饰，使其与载体结合达到较为抱负构型和相容性。
（一）吸附法1、原理：重要是运用细胞与载体之间吸引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，惯用吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。
此外还可运用专一亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白Ａ与ａ一甘露聚糖具备亲和力，而酿酒酵母细胞壁上具有ａ一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白Ａ先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了伴刀豆球蛋白上。
2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上酶或酶系。
3、优缺陷：操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体便宜易得，且可重复运用；缺陷是蛋白质与载体之间结合相称弱,并且诸多状况下,酶非特异性吸附经常会引起某些或所有失活,高浓度盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质脱附.因而当规定酶固定绝对牢固时,采用吸附法是很不可靠.4、惯用吸附剂各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空陶瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最惯用吸附剂是离子互换剂羧甲基纤维素，DEAE----纤维素、DEAE----葡萄糖，合成阴离子和阳离子互换剂离子互换剂重要靠静电吸引，缺陷是当离子强度增长或介质pH、温度变化时，这种结合发生分解。
5、举例：将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS 中备用。
（二）包埋法1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定办法。
可分为凝胶包埋法（网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。
2、优缺陷：普通不需酶AA残基进行结合反映，很少变化酶高档构造，酶活回收率高；缺陷是包埋时发生化学聚合反映，酶易失活，须巧妙设计反映条件。
此外网格构造影响底物和产物扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为变化，因此此法只适合于小分子底物和产物酶。
3、海藻酸盐包埋法海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒缺陷:在高浓度电介质（K+,Na+）溶液中,固定化颗粒变得不稳定.Ca2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀,固定化颗粒溶解长处:海藻酸盐价格便宜包埋条件温和4、角叉菜糖包埋法K-角叉菜是一种具有许多硫酸根基团多糖化合物.在K+离子存在下，它能及时生成凝胶.缺陷:对高浓度Na+离子敏感固定化温度高,需要在37℃~55℃5、聚丙烯酰胺凝胶在含酶(或细胞)水溶液中，加入一定比例单体丙烯酰胺和胶联剂N,N’-甲撑双丙烯酰胺.然后在催化剂(二甲氨基丙腈)和引起剂(过硫酸钾)作用下低温(冰浴)聚合,形成凝胶缺陷:丙烯酰胺对酶具备变性作用6、聚乙烯醇（PVA）包埋法磷酸盐硬化法,循环冷冻法,硼酸硬化法硼酸硬化法:将聚乙烯醇在70℃~ 80℃进行水浴加热至完全溶解,然后冷却至35℃,与酶溶液(细胞悬浮液)混匀,滴加到饱和硼酸溶液中长处:原材料价格便宜条件温和无毒害作用循环冷冻法硼酸硬化法7、半透膜包埋法7.1 界面沉淀法运用某些高聚物在水相和有机相界面上溶解度极低而形成被膜将酶包埋。
操作：酶液在油溶性表面活性剂存在下在水不互溶有机相中乳化形成油包水微滴，再将溶于有机溶剂高聚物加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物有机溶剂，使高聚物在油-水界面上沉淀析出，形成膜将酶包埋，最后在乳化剂协助下由有机相移入水相。
7、半透膜包埋法7.2界面聚合法运用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合原理包埋酶。
例:将含10%血红蛋白酶液与1，6己二胺水溶液混合，及时在含1%司盘-85氯仿-环己烷中分散乳化，再加入溶于有机相葵二酰氯后，便在油-水界面上发生聚合反映，形成尼龙膜，将酶包埋。
（三）交联法基本原理：酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三向交联网架构造，以戊二醛使用最广泛OHC（CH2）3CHO，使载体氨基和酶蛋白中氨基交联形成席夫碱（基）Shiff 碱将酶固定化。
含氨基载体，可用氯乙基纤维素（纤维素-OCH2CH2NH2），二乙氨乙基纤维素（DEAE-纤维素）。
双功能试剂除了戊二醛外，尚有乙撑二异氰酸酯OCN（CH2）6NCO。
交联剂特点：①带有二个以上功能基团。
②反映比较激烈条件比较严格。
③操作方便，活力回收不高。
固定化分两步进行，第一步形成可溶性分子间交联系合物，第二步是迅速反映导致固化。
交联法有5种形式：①酶直接交联法在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。
固定化依赖酶与试剂浓度、溶液pH 和离子强度、温度和反映时间之间平衡。
此法操作简朴，一种多功能试剂可制备许多酶衍生物，但缺少选取性，难于避免分子内交联，活力回收往往不高。
②酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起失活，可使用第二个“载体”蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增长蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
实用中，当酶蛋白、无酶活性蛋白与戊二醛混合（戊二醛最后浓度0.7%）后，混合液粘度开始提高时，及时铺膜，或者在酶蛋白戊二醛与辅助蛋白混合后，经-30℃低温解决，再预热至4℃而得泡沫状蛋白质共聚物。
这种固定化酶为多孔性，活力回收比酶直接交联高，机械性能也有改进。
③吸附交联法：先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其她大孔型离子互换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。
用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。
此法用于胞外酶固定化较好，特别是从发酵液和粗酶制剂中直接固定化时，载体选取性吸附有一定纯化作用，而酶分子之间共价交联又保证酶分子紧紧地结合于载体上，并且酶分子仅存在于载体表面，使固定化酶与底物接触良好。
由于载体自身有较好机械性能，因此产生固定化酶装柱流动性能好，缺陷是必要保证酶吸附在载体上。
④载体交联法：用多功能试剂一某些功能基团化学修饰高聚物载体，而其中另一某些功能基团偶连酶蛋白。
也可运用多功能试剂一某些功能基团与一种聚合物单体反映，反映后再与酶一起共聚。
⑤交联包埋法：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。
这样避免颗粒太细缺陷，同步制得固定化酶稳定性好戊二醛交联法缺陷：双功能基团试剂与酶蛋白交联作用，常引起蛋白质高档构造变化，使酶失活。
为了避免或减少酶在交联过程中失活，可在被交联酶蛋白溶液中添加一定量辅助蛋白。
（四）化学共价法1、概念所谓共价法就是使酶蛋白非必须基团（-NH2,-OH,-COOH,-SH,酚基，咪唑基，吲哚基）通过共价键和不溶性载体形成不可逆联接。
要使载体与酶形成共价键，必须一方面使载体活化，接上一活泼基团，再与酶反映2、用于共价法固定酶蛋白上功能基团:1）氨基-赖氨酸上ε-氨基以及多肽链N末端氨基酸上α- 氨基；2）羧基-双羧基氨基酸:门冬氨基酸和谷氨酸上游离羧基,以及多肽链末端α- 羧基;3）酪氨酸上苯酚环;4）半胱氨酸上巯基;5）羟基-丝氨酸,苏氨酸以及酪氨酸上羟基6）组氨酸上咪唑基;7）色氨酸上吲哚基其中以氨基和羧基为最惯用3、普通以为共价法特点如下：①酶和载体结合比较牢固，酶不易脱落。
故使用半衰期较长。
②制备条件复杂，反映激烈，易引起酶蛋白高档构造发生变化。
③制备得到固定化酶，活力回收普通在50%左右。
④载体不会引起蛋白质变性，经得起一定pH，浓度变化。
4、惯用载体⑴天然高分子。
如纤维素，葡聚糖凝胶（Sephadex），琼脂糖（Agarose Sepharose），卡那胶，淀粉以及它们衍生物。
（运用-OH）⑵人工合成高聚物，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，氨基酸共聚物等。
（运用-NH2）⑶无机载体，如多孔玻璃，硅胶等。
（要加上一种基团）5、技术要点⑴将所选用载体上关于基团活化，然后和酶蛋白上关于基团发生偶联反映。
（直接活化或另接一反映基团）⑵在选用载体上接上一种双功能试剂，然后将酶蛋白和双功能试剂偶联。
（接手臂）6、分类：⑴重氮法；⑵叠氮法；⑶缩合法；⑷烷化反映法；⑸硅烷化反映法；⑹溴化氰法。
⑴重氮法当前在咱们国内用较多载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等，用这些载体制备了不少固定化酶。
办法原理如下：①用双功能试剂β - 硫酸酯乙砜基苯胺（SESA），连接于被活化（-OH）纤维素等载体上制备成ABSE-纤维素，琼脂糖等。
②在盐酸和亚硝酸钠解决下把ABSE-纤维素变成重氮盐。
③把酶偶联于ABSE-纤维素上⑵叠氮法是在酶分子与载体间形成肽键固定化办法。
重要是含羧基载体，转变成酰基叠氮氯化物，异氰酸盐等活化形态衍生物，然后与酶游离氨基反映，从而形成肽键。