核酸分子杂交技术概述
核酸分子杂交名词解释
核酸分子杂交名词解释核酸分子杂交是一种重要的分子生物学技术，用于研究核酸的结构、功能和相互作用，并在基因克隆、基因表达调控等领域具有广泛的应用。
以下是与核酸分子杂交相关的重要名词的解释：1. 核酸分子杂交（Nucleic Acid Hybridization）：指将两个不同的核酸分子（DNA或RNA）通过互补的碱基配对形成双链结构的过程。
核酸分子杂交可用于分析DNA或RNA的序列、测定基因表达水平以及检测特定的核酸序列。
2. 探针（Probe）：一条含有特定序列的标记化核酸分子，用于与目标序列进行杂交。
探针通常由放射性核素、荧光染料或酶等标记物标记，以便于在实验中检测其位置和数量。
3. 靶标（Target）：指待被杂交的目标核酸分子，它可以是DNA或RNA，含有待检测或待分析的特定序列。
靶标可以来自于生物样品，如组织、细胞或血清等。
4. 互补序列（Complementary Sequence）：两条核酸分子间相互配对的碱基序列。
在DNA分子中，腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）通过双氢键相互配对，胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）相互配对；在RNA分子中，腺嘌呤（A）与尿嘧啶（U）相互配对，胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）相互配对。
5. 杂交化（Hybridization）：指探针与靶标间通过互补序列形成双链结构的过程。
杂交化通常需要一定的时间和温度条件，以保证探针和靶标的互补碱基序列能够正确配对。
6. 杂交化条件（Hybridization Conditions）：影响探针和靶标杂交的因素，包括温度、盐浓度、引物浓度、溶液pH值等。
不同的杂交化条件可选择性地控制互补序列的结合和分离，从而改变杂交的特异性和灵敏度。
7. 杂交化信号（Hybridization Signal）：当探针与靶标杂交时，由于探针上的标记物，如放射性同位素或荧光染料的发光、发射或放射活性，而产生的信号。
通过检测杂交化信号的强度和位置，可以确定探针与靶标的结合情况，以及目标序列的存在与数量。
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术一、 概述前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA 的二条单链之间进行。
由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。
使单链聚合双链的过程称为退火或复性。
用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。
核酸杂交技术基本上是Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。
该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。
Bolton 等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。
变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互补核酸序列杂交。
典型的反应是用放射性标记的短DAN或RNA 分子与胶中DNA杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针，在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。
该法尤其适用于过量探针的饱和杂交实验。
60年代末，Britten等设计了另一种分析细胞基因组的方法。
该法是研究液相中DNA的复性以比较不同来源核酸的复杂度，典型的方法是：从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内分离DNA，用水压器剪切成长约450核苷酸（nt）的片段。
剪切的DNA液（含0.12mol/L 磷酸盐缓冲液或0.18mol/l Na+），经煮沸使dsDNA热变性成ssDNA。
然后冷至约60℃，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的UV260nm的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。
核酸分子杂交的概念和基本原理
核酸分子杂交的概念和基本原理
核酸分子杂交的基本原理是互补配对。
DNA由四种碱基组成，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。
在DNA的双链结构中，A总是与T互补，G总是与C互补。
RNA的组成与DNA类似，但胸腺嘧啶（T）被尿嘧啶（U）取代。
1.样品制备：将待检测的核酸提取和纯化，通常使用的方法有酚/氯仿法或商用试剂盒。
2.样品标记：将一条核酸链标记上荧光物质或放射性同位素，以便于后续的检测和可视化。
标记通常使用DNA或RNA标记试剂盒来完成。
3.杂交：将待检测的样品核酸与已知碱基序列的探针核酸杂交。
探针核酸是一条已知序列的DNA或RNA，在实验中作为参照物。
杂交条件包括温度、盐浓度和时间等。
4.杂交后处理：将杂交的核酸片段进行洗脱和处理，以去除未杂交的核酸。
这可以通过水洗、盐洗或酶处理等方法来完成。
5.分析和检测：通过荧光显微镜、放射计数器或PCR等方法来检测和分析杂交的核酸。
可以测量荧光强度、放射性计数或扩增产物的数量等，以确定核酸的相互作用或特定序列的存在。
核酸分子杂交技术在生物医学研究和诊断中具有广泛的应用。
例如，它可以用于检测病毒感染、基因突变、基因表达差异以及遗传性疾病的诊断等。
此外，核酸分子杂交还可以用于基因组和转录组的分析，帮助科学家理解基因调控、进化和物种间关系等重要生物学问题。
综上所述，核酸分子杂交技术基于互补配对原理，通过使两条互补的核酸链结合，来研究DNA和RNA的相互作用和序列特征。
它是一种重要的实验技术，在生物医学研究和诊断中得到广泛应用。
核酸分子杂交技术定义
核酸分子杂交技术定义核酸分子杂交技术是一种广泛应用于生物学和医学领域的技术手段。
它利用互补配对的原理，将两个核酸链在一定条件下结合成一个双链分子。
该技术可用于分析、检测、鉴定、筛选和修饰核酸分子等方面，具有重要的实验和临床应用价值。
一、技术原理核酸分子杂交技术的原理是基于核酸互补配对的规律。
核酸是由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞状细胞素）组成的双链分子，两条链通过氢键相互配对形成双螺旋结构。
在核酸分子杂交技术中，将两个互补的核酸链置于一定条件下（如适当的温度、pH值和离子浓度等），使它们形成双链分子。
这个过程中，两个链之间的氢键会断裂，然后重新组合成新的氢键，形成一个更稳定的双链分子。
这个过程被称为“杂交”。
二、应用领域1. 分析基因序列核酸分子杂交技术可用于分析基因序列。
通过与已知序列相比较，可确定未知序列的位置和组成。
这种技术被广泛应用于基因组学和生物技术领域，包括基因定位、基因诊断、基因克隆和基因表达研究等方面。
2. 检测病原体核酸分子杂交技术可用于检测病原体。
该技术可以检测细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物的存在和数量。
与传统的细菌培养方法相比，核酸分子杂交技术具有更高的灵敏度和特异性，可以更快速和准确地诊断疾病。
3. 鉴定基因型核酸分子杂交技术可用于鉴定基因型。
通过检测DNA序列的变异，可以确定不同基因型之间的差异。
这种技术被广泛应用于疾病的遗传咨询、人类学研究和法医学等领域。
4. 筛选基因库核酸分子杂交技术可用于筛选基因库。
该技术可以通过与探针的杂交来筛选目标基因，从而快速地鉴定和克隆感兴趣的基因。
这种技术被广泛应用于基因工程、药物研发和生物产业等领域。
5. 修饰核酸分子核酸分子杂交技术可用于修饰核酸分子。
通过与修饰剂的杂交，可以将不同的化合物引入到核酸分子中，从而实现对分子结构和性质的调控。
这种技术被广泛应用于药物研发、生物材料和生物传感器等领域。
三、实验步骤核酸分子杂交技术的实验步骤包括样品处理、杂交反应、检测和数据分析等环节。
核酸的分子杂交技术及其应用
核酸的分子杂交技术及其应用1概述核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。
它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。
在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。
这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。
在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。
作为检测工具用的已知RNA或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。
它常常用放射性同位素来标记。
虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。
而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。
这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。
2核酸探针的制备核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。
比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。
目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法：2.1DNA的切口平移双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。
这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。
常用于在双链DNA 上打开切口的酶为胰DNA酶Ⅰ。
由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数/(分.μg)的32P标记的DNA探针。
核酸分子杂交
核酸分子杂交概念及特点：核酸分子杂交技术的基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补配对成双链，用特异性的探针与待测样品的DNA或RNA形成杂交分子的过程。
核酸分子杂交技术主要有以下几种：Southern杂交、Northern杂交、原位杂交（ISH）、荧光原位杂交（FISH）、芯片杂交。
核酸杂交技术具有其高度特异性、灵敏性、快速等特点。
在环境监测中的应用：核酸分子杂交技可以快速检测出环境微生物中独特的核酸序列。
如对活性污泥中的特定微生物的生长速率进行测定，根据放射性强度可以定量分析特定细菌的DNA量。
在对被石油污染的土壤分析中，用核酸杂交法得到某种烃降解基因的检出率显著高于不污染样品，结果表明，污染越严重，这种降解基因的含量也越高，可用来评价中石油污染程度。
荧光原位杂交技术（FISH）是核酸原位杂交技术中应用最为广泛的技术之一。
该技术结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性，无需单独分离出DNA或RNA，通过激发杂交探针的荧光来检测信号从而对未知的核酸序列进行检测，结果可直接在荧光显微镜下观察。
GulnurCoskuner认为FISH技术能揭示更多硝化细菌的微生物学方面的信息及它们种群的大小，更有利于改进生物脱氮系统的工艺，避免了传统的、用培养方法计数带来的偏差。
彭永臻等列举了FISH在活性污泥细菌检测，高效生物除磷（EBPR）反应器微生物群落的测定、污水处理微生物检测等方面的应用。
一、核酸分子杂交应用于物种之间亲缘关系的鉴定。
把取自两种不同生物体细胞的DNA 进行RCR扩增，并同时带上不同的放射性标记。
然后将其混合在一起，先高温解链，再低温复性。
来自两种不同生物的DNA分子单链中的互补区域就可以互补配对。
互补配对的区域越大，说明亲缘关系越近。
二、基因诊断：用带有标记的已知缺陷基因的特异性片段做探针，通过和待测样品DNA 中进行分子杂交，检测被测样品中是否含有缺陷基因。
核酸分子杂交技术
K去除核酸表面的蛋白质
• 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用
• 不改变核酸在组织细胞内的定位
• 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
（2）组织细胞杂交前的预处理
• 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
（2）比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针
7、Southern杂交的应用 （1）酶切图谱分析 （ 2）特定基因定性和定量
（3）基因突变分析
（ 4）限制性片段长度多态性的分析
（二）Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA
3、探针可用DNA或RNA片段
或硝酸纤维素膜上。
5、Southern杂交 （ 1）预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位 预杂交液 为不含DNA探针的杂交液 （2）杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA双 链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 （3）洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
6、杂交结果检测
（1）放射自显影：适用于放射性核素标记的探针
mRNA
逆转录酶的 DNA聚合酶
互补DNA
DNA 聚合 酶
逆转录酶的 RNase H
分解mRNA
第二条CDNA链
RNA探针
1、RNA探针是单链分子，与靶序列的杂交反应效率高。 2、早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探 针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中 得到标记的，标记效率不高，且受到多种因素的制 约。 3、体外逆转录可高效合成RNA，加入标记物可成为探 针 4、应用：例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病 毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利 用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地 筛选到多株HIV基因组DNA克隆。
核酸的分子杂交
3 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。
3.1 标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。
有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。
Home
应 用：
检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。
2 核酸探针的制备
2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
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第五节 核酸的分子杂交 Nucleic Acid Hybridization
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核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
2.2 探针的制备方法
01
02
03
PCR扩增
DNA重组技术
化学合成
长度一般以50~300bp为宜。制备方法：
2.3 探针的分类 据来源及性质不同可分为： 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
2.4 合成寡核苷酸探针注意原则
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逆转录酶的 DNA聚合酶
互补DNA
DNA 聚合 酶
逆转录酶的 RNase H
分解mRNA
第二条CDNA链
RNA探针
1、RNA探针是单链分子，与靶序列的杂交反应效率高。 2、早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探 针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中 得到标记的，标记效率不高，且受到多种因素的制 约。 3、体外逆转录可高效合成RNA，加入标记物可成为探 针 4、应用：例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病 毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利 用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地 筛选到多株HIV基因组DNA克隆。
（3）标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成
代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新
合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，
3H-尿苷可掺入到RNA中
体外标记法：
化学标记法：标记物分子上的活性基团与
探针分子上的某些基团反应，
标记物直接结合到探针分子上
酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上
随机引物法
其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，
作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下， 按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与 模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成 一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性
核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中
随机引物法所具有的优点：
4、待测样品为总RNA或mRNA
Northern印迹与Southern 印迹的不同点
1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保
持RNA处于变性膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA
三、 核酸分子杂交的方法 按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
• 固-液相杂交
膜上印迹杂交
原位杂交
• 液相杂交
RNA酶保护分析法
核酸酶S1保护分析法
限制性酶切割
限制片段 琼脂糖电泳
DNA分子
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶 滤膜
转膜 吸附有DNA 片段的膜
寡核苷酸探针
利用寡核苷酸自动合成仪，可很简单地合成制 备寡核苷酸探针(如15～50bp)， 寡核苷酸探针的优点： ①短的探针比长探针杂交速度快，特异性强。 ②可以在短时间内大量制备。 ③在合成中进行标记制成探针。 ④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂 交中自我复性，提高杂交效率。 ⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段 。
3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂 交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进 行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交 液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶 液在68℃杂交
• 对酶促反应活性无影响或影响不大
• 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
（3）标记物种类 • 核素标记物：32p、35s、3H • 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光
同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此
法则是利用离心的方式来纯化探针
二、影响杂交的因素
1、核酸分子的浓度和长度：
浓度越大，复性速度越快
分子越大，复性速度越慢
单链探针，浓度增加，杂交效率增加
双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂
交效率
2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃ （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
（二）探针的标记 1、理想标记物应具备的特性：
• 高度灵敏性
• 不影响碱基配对的特异性
• 不影响探针分子的主要理化性质
• 对酶促反应活性无影响或影响不大
• 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
2、标记物 （ 1） 理想标记物应具备的特性：
• 高度灵敏性
• 不影响碱基配对的特异性
• 不影响探针分子的主要理化性质
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程
（一）Southern印迹杂交 1、待测核酸样品的制备 （1）裂解或破碎细胞 （2）抽取纯化基因组DNA （3）限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
2、待测DNA样品的电泳分离 （1）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶
分离小片段用高浓度胶
（ 2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子
（2）比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针
7、Southern杂交的应用 （1）酶切图谱分析 （ 2）特定基因定性和定量
（3）基因突变分析
（ 4）限制性片段长度多态性的分析
（二）Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA
3、探针可用DNA或RNA片段
Southern印迹的常用方法
（1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中
的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬
酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤
纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，
同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝
DNA探针的主要优点
①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖， 取之不尽，制备方法简便。
②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有 效抑制DNA酶活性。 ③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选 择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等， 能用于同位素和非同位素标记
cDNA探针
cDNA（complementary DNA）是指互补于mRNA 的DNA分子。
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
二、核酸分子杂交的 探针
（一）探针的种类
1、根据组成分类 • 基因组DNA探针
• cDNA探针
• RNA探针
• 寡核苷酸探针
2、标记物
放射性同位素标记法 35S
如32P、3H、
非放射性同位素标记法 如金属、半抗原、 荧光素
3、标记的方式 体内标记法 体外标记法
1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记 2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不 当所带来的一系列问题 3、标记活性高，标记活性可达108cpm/µ gDNA以 上 4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记
PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反
应的底物，以待标记的DNA为模板，经
DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，
大小 相同的分子处于同一条带 （ 3）分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂 所用分子量标准可用核素标记
3、凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液
4、Southern印迹
指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固
相支持物上的过程。
（1）固相支持物的选择 理想的固相支持物应具备的特性： ①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固
④具有良好的机械性能
非特异吸附少
常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分
子中
（三）探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可
去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将
大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷
酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用
• 不改变核酸在组织细胞内的定位
• 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
（2）组织细胞杂交前的预处理
• 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上
。
（2）电转法
利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相 支持物上。
（3）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤
膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真 空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层 容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中， 同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜
5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序 的总长度 （2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比
（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性
6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分 子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉