核酸分子杂交技术课件PPT
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生物化学课件 第四章 核酸杂交
单链DNA的紫外吸收比双链DNA高40%，所以 变性导致DNA的紫外吸收增加，称为增色效 应（hyperchromic effect）。 在热变性过程中，增色效应达一半时即双螺 旋被解开一半时的温度称为解链温度(Tm)。
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途
印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
44
(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:
掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应
掌握核酸杂交的基本原理
熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印
核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针
探针的概念 探针的种类和选择
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途
印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
44
(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:
掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应
掌握核酸杂交的基本原理
熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印
核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针
探针的概念 探针的种类和选择
第五章核酸分子杂交技术
5’ 3’
3’ 5’
随机6-12bp单核苷酸引物
5’
3’
3’
5’
变性
一般探针长度在400-600bp之间
③末端标记法(terminal labeling) 3’末端 5’末端
④PCR标记法 ⑤光敏标记法
生物素、地高辛等
光敏基团与生物素结合
⑥化学衍生结合标记法 转氨标记法等
(4)探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用， 将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法 相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针， 而此法则是利用离心的方式来纯化探针
（a）
基因组DNA
DNA限制片段
（b）
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜源自（e）同探针同源杂交的基因 DNA片段
X光底片
DNA凝胶电泳
Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片
水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、 BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有 EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米 psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻 的psbA基因序列
• 蛋白质样品的制备 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 • 蛋白质的电转移：NC膜 • 靶蛋白的免疫学检测
靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应
第十章 核酸分子的杂交技术
RNA提取
1.样品细胞的有效破碎； 2.使核蛋白复合体变性； 3.对内源RNA酶的有效抑制； 4.有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分
离；
• Northern blotting
三、斑点印迹杂交(dot bloting)
• 将RNA或DNA变性后直接点样于NC 膜或尼龙膜上
• 优点：简单、快速、可同时检测多 个样品
• 应用：确定DNA样品之间的同源性
四、核酸原位杂交(in situ hybridization)
1.定义：将标记的探针与细胞或组织切片 中的核酸进行杂交检测的方法。
2.特点： – 能在成分复杂的组织中进行单一细胞 的研究 – 不需从组织或细胞中提取核酸 – 能准确反映组织细胞的相互关系及功 能状态
2.多色荧光染色体原位杂交(multicolor FISH; mFISH )
3.比较基因组原位杂交(Comparative Genomic
Hybridization；CGH )
3.比较基因组原位杂交(Comparative Genomic
Hybridization；CGH )
利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的 Genomic DNA ，再同时与正常的染色体进行 hybridization，染色体上不同荧光间的强弱 比值，由此比较而观察基因组中特定基因的 拷贝数变化。
毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测
• 步骤
1.待测DNA样品的制备、酶切
• DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释 放，用TE液溶解，交替使用酚、氯仿两 种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质
• 标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。
核酸分子杂交技术 ppt课件
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一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
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(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
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(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
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二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理PPT课件
第43页/共46页
（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变 性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
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（5）杂交结果检测 • 所用探针为核素标记,放射自显影检测 • 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测
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2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
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（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
第42页/共46页
（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
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四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针
（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变 性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
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（5）杂交结果检测 • 所用探针为核素标记,放射自显影检测 • 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测
第40页/共46页
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
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（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
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（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
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四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针
[课件]核酸分子杂交与应用PPT
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2018/12/6 16
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
2018/12/6
2
2018/12/6
3
核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
2018/12/6 4
2018/12/6
5
变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
2018/12/6
6
2018/12/6பைடு நூலகம்
7
影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
2018/12/6
11
3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
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核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
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变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
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2018/12/6பைடு நூலகம்
7
影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
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3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。
第二章 核酸分子杂交 - 副本(共94张PPT)
在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的 元素或分子。标记常用的为同位素标记法和生物素 标记法。
通过检测与膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道 被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上 的位置，也就知道了它的分子大小。
3、 杂交 杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。
应用较多固相杂交：先将待测单链核酸样品〔如为双 链，那么须先变性成为单链〕结合到硝酸纤维素膜 上，然后与溶液中标记探针进行杂交。
cＤＮＡ探针不含内含子及高度重复序列，是一种较为理想的核酸探针。 因此尤其适用于基因表达的检测。
３.ＲＮＡ探针
通常采用含Ｔ７或ＳＰ６启动子的表达载体来制备高度敏感的 ＲＮＡ探针。
目的基因→克隆到含Ｔ７或ＳＰ６启动子的表达载体的多克隆 位点，用适当的限制性内切酶在插入序列下游将质粒线性化， 参加Ｔ７或ＳＰ６ ＲＮＡ聚合酶、ＮＴＰｓ和α－３２Ｐ －ｄＵＴＰ，即可以目的基因的ＤＮＡ为模板，合成高放射 性的ＲＮＡ探针。
ＲＮＡ作为探针较为理想，但极易被环境中大量存在的核酸酶降 解，较ＤＮＡ难于操作，故限制了其使用。
４.寡核苷酸探针 随着ＤＮＡ合成仪的广泛应用，采用人工合成的寡核苷酸片段作
为探针也非常普遍。
研究者可根据的基因序列或根据氨基酸序列推测出的ＤＮＡ序列， 合成一段１５－３０ｎｔ的寡核苷酸片段。
DNA探针〔包括cDNA探针〕的主要优点有下面三点：
第二节、核酸探针及其标记
• 核酸探针是指标记有放射性或其他标记物 的单链多聚核苷酸片段，用于检测核酸样 品中特定核苷酸序列。
一、探针的种类及其选择
核酸探针可以是人工合成的寡核苷酸片段，可以是克隆 的基因组DNA、全长cDNA或局部片段，也可以是 RNA。
应根据实验目的及要求不同，选择不同类型的探针。选择 探针时应充分考虑探针的特异性及其来源是否方便等因 素。
通过检测与膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道 被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上 的位置，也就知道了它的分子大小。
3、 杂交 杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。
应用较多固相杂交：先将待测单链核酸样品〔如为双 链，那么须先变性成为单链〕结合到硝酸纤维素膜 上，然后与溶液中标记探针进行杂交。
cＤＮＡ探针不含内含子及高度重复序列，是一种较为理想的核酸探针。 因此尤其适用于基因表达的检测。
３.ＲＮＡ探针
通常采用含Ｔ７或ＳＰ６启动子的表达载体来制备高度敏感的 ＲＮＡ探针。
目的基因→克隆到含Ｔ７或ＳＰ６启动子的表达载体的多克隆 位点，用适当的限制性内切酶在插入序列下游将质粒线性化， 参加Ｔ７或ＳＰ６ ＲＮＡ聚合酶、ＮＴＰｓ和α－３２Ｐ －ｄＵＴＰ，即可以目的基因的ＤＮＡ为模板，合成高放射 性的ＲＮＡ探针。
ＲＮＡ作为探针较为理想，但极易被环境中大量存在的核酸酶降 解，较ＤＮＡ难于操作，故限制了其使用。
４.寡核苷酸探针 随着ＤＮＡ合成仪的广泛应用，采用人工合成的寡核苷酸片段作
为探针也非常普遍。
研究者可根据的基因序列或根据氨基酸序列推测出的ＤＮＡ序列， 合成一段１５－３０ｎｔ的寡核苷酸片段。
DNA探针〔包括cDNA探针〕的主要优点有下面三点：
第二节、核酸探针及其标记
• 核酸探针是指标记有放射性或其他标记物 的单链多聚核苷酸片段，用于检测核酸样 品中特定核苷酸序列。
一、探针的种类及其选择
核酸探针可以是人工合成的寡核苷酸片段，可以是克隆 的基因组DNA、全长cDNA或局部片段，也可以是 RNA。
应根据实验目的及要求不同，选择不同类型的探针。选择 探针时应充分考虑探针的特异性及其来源是否方便等因 素。
核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交的基本原理与分类（可编辑）
核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交的基本原理与分类分子杂交技术与应用分子杂交技术与应用? 分子杂交技术的目的是什么?分子杂交的基本方法有哪些?Southern印迹法有哪些步骤,为了达到什么目的呢为什么叫印迹法呢?一、核酸分子杂交的基本原理与分类一、核酸分子杂交的基本原理与分类(一)核酸分子杂交的基本原理(一)核酸分子杂交的基本原理1、变性(denaturation)1、变性(denaturation)(1)定义:(1)定义: 在一定的条件下,双螺旋之间氢键断裂,双在一定的条件下,双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成无规则线团,双链解链成为单链。
螺旋解开,形成无规则线团,双链解链成为单链。
(2).引起核酸变性的因素(2).引起核酸变性的因素变性剂变性剂酸(尿素)(尿素)碱碱有机溶剂热有机溶剂热(乙醇)(乙醇)(3)、变性后核酸的特点:(3)、变性后核酸的特点:粘度下降粘度下降密度增加密度增加紫外吸收增加紫外吸收增加 2、融解温度(Tm):2、融解温度(Tm):定义:在DNA热变性时,其A 的升高达最定义:在DNA热变性时,其A 的升高达最260260 大值一半时的温度。
大值一半时的温度。
3、复性(退火)3、复性(退火) 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。
变性DNA 经过一定处理重新形成双螺旋的过程。
影响复性速度的因素: 影响复性速度的因素:DNA浓度 DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 DNA片段复杂性合适的复性温度合适的复性温度适当的离子强度适当的离子强度4、杂交4、杂交定义两条来源不同,但具有互补序列的核酸,按两条来源不同,但具有互补序列的核酸,按碱基配对原则复性形成一个杂交体,这个过程即碱基配对原则复性形成一个杂交体,这个过程即分子杂交。
分子杂交。
DNA/DNA的杂交作用:DNA/DNA的杂交作用: 检测特定生物有机体之间的亲源关系检测特定生物有机体之间的亲源关系DND/DNA或RNA/DNA:DND/DNA或RNA/DNA: 揭示核酸片断中某种特定基因的位置。
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2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
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Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤
待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜：
• 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 • 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法
探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测
24
Northern印迹与Southern 印迹的不同点
1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性
与Southern印迹杂交不同之处： RNA电泳 避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解
变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)
RNase抑制环境
核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）
1
核酸分子杂交技术：
具一定同源性的两条(DNA或RNA) 单链在适宜的温度及离子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则特异性地复性， 形成双链。
探针(已知核酸片断，单链)
待测核苷酸序列(单链)
2
核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛 顿卡内基学院（Carnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序 列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起 时，其相应的同源区段将会退火形成双链的 结构。
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（a）
基因组DNA
DNA限制片段
（b）
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜
同探针同源杂交的基因
DNA片段
（e）
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X光底片
DNA凝胶电泳
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Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片
水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、 BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有 EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米 psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻 的psbA基因序列
* 因这种方法与Southern blot杂交技术十分类似，与DNA的 杂交（Southern 杂交）相对应，被趣称为Northern杂 交。
23
Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA
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2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理
3、靶核酸为RNA
26
27Βιβλιοθήκη Western 杂交印迹法(Western bloting)
检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋 白质转移到固相载体上，用特异的抗血 清对蛋白质进行鉴定及定量的方法
4
5
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影响杂交的因素
核酸分子的浓度和长度
• 浓度大，复性快；分子量大，复性慢
温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应
• 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA
7
分子杂交的基本方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 Western 印迹法 原位杂交 斑点印迹杂交 液相杂交
将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行 杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和 组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交。
特点 • 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 • 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序 列灵敏度高 • 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态
主要步骤：
• 蛋白质样品的制备 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 • 蛋白质的电转移：NC膜 • 靶蛋白的免疫学检测
靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应
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In Situ Hybridization
原位杂交
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原位杂交(in situ hybridization)
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利用非放射性探针检测核苷酸
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主要应用 • 1.遗传病诊断 • 2.DNA图谱分析 • 3.PCR产物分析
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Northern blot
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Northern杂交
* 1979年，J. C. Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳 凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤 纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。 也称为Northern印迹（Northern Blot），用以检测某 一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量。
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Southern DNA印迹杂交
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Southern DNA印迹杂交
使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结 合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链 DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移 的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂 交技术。由于它是由英国人Edwin Mellor Southern于1975年首先设计出来的，故又叫 Southern blot。
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核酸分子杂交的基本原理
DNA变性
• 方法
热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等
• 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶 解温度(melting temperature,Tm)
DNA复性或杂交(hybridization)
• DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
* 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。
* 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。
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原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组
织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分 细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针 与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、 RNA/RNA 杂交
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