第七章核酸分子杂交技术与核酸序列测定
合集下载
分子诊断学之核酸分子杂交技术-医学检验
» 核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）
是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未 知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合 ，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置 或大小显示出来。
» 探针( probe )
带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。 Institute of Genetic Engineering
分子克隆基本过程：
切 转
分 切 接
筛
Institute of Genetic Engineering
Institute of Genetic Engineering
分子诊断学
核酸分子杂交技术
Nucleic Acid Hybridization Technology
Institute of Genetic Engineering
Institute of Genetic Engineering
影响复性速度的因素：
DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度
Institute of Genetic Engin1e7ering
二、核酸分子杂交的技术原理
在DNA复性过程中，如果把不同 DNA单链分子放在同一溶液中， 或把DNA与RNA放在一起，只要 在DNA或RNA的单链分子之间有 一定的碱基配对关系，就可以在 不同的分子之间形成杂化双链 (heteroduplex) 。
检测对象: 克隆化的基因组DNA，细胞总DNA、总RNA
。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细 胞内杂交, 即细胞原位杂交。
核酸分子杂交特点：高度的灵敏性、特异性
应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特
第七章 分子杂交
•第一节 核酸分子杂交的基本原理 第一节 •第二节 核酸探针 第二节 •第三节 •第三节 核酸分子杂交技术
第一节 核酸分子杂交的基本原理
DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条 和 链或两条RNA链之间， 链之间， 链 与 链或两条 链之间 只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂 常用已知的DNA或 RNA的片段作为探针 ， 包括 的片段作为探针， 交 。 常用已知的 或 的片段作为探针 特异的DNA序列，或转录的 序列， 序列或cDNA序列， 序列， 特异的 序列 或转录的RNA序列或 序列或 序列 或人工合成的寡核苷酸片段。 或人工合成的寡核苷酸片段。 根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。 根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。 固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。 固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。 膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后， 膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后，在体外 与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交。 与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交。
Байду номын сангаас
㈢ RNA探针 探针 RNA探针有下述优点： 探针有下述优点： 探针有下述优点 杂交体的稳定性高，杂交反应条件严格， ①杂交体的稳定性高，杂交反应条件严格，特异性更 高。 单链不存在双链DNA探针的互补双链的复性 ， 探针的互补双链的复性， ② RNA单链不存在双链 单链不存在双链 探针的互补双链的复性 杂交效率较高。 杂交效率较高。 无高度重复序列， ③RNA无高度重复序列，非特异杂交少。 无高度重复序列 非特异杂交少。 杂交后用RNase消化未杂交的 消化未杂交的RNA探针，可降低杂 探针， ④杂交后用 消化未杂交的 探针 交本底。 交本底。
第七章 真菌的分子生物学鉴定方法
RAPD是一种比较精细的分子标记技术，单个碱基的改 变有可能对扩增片断的多态性产生明显的影响。
国内有人利用RAPD对白色念珠菌、淋球菌、水稻白叶 枯病菌进行分型取得了很好的结果。 黄勃等人利用 RAPD 技术对拟青霉属菌株进行分类鉴定时，发现
RAPD 指纹图谱在拟青霉属不同种间具有明显的种的
特异性，可以区别所有形态近似的种类，但对比RAPD
（二）真菌线粒体DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析 限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP），将目标DNA序列经一定数目和种类的限 制性内切酶(RE)进行酶切,由于不同生物体的基因组DNA在限制性 内切酶的酶切位点的遗传信息有差异, 限制性内切酶在其上的识别
例——捕食线虫真菌的分类发展
粘球和 非收缩环
节丛孢
收缩环
单顶孢
菌网
隔指孢
粘性分枝
分子生物学鉴定方法包括DNA碱基组成 (G+C)mol%、限制性片段长度多态性（RFLP）、 随机扩增多态性 (RAPD) 、Southerm印迹分析 脉冲电场凝胶电泳（PFGE）以及小亚基rDNA(或 rRNA)序列测定等。 过去依赖形态和生理生化等表型特征描述逐 渐引入分子生物学鉴定方法，按其亲缘关系和 客观的反映系统发育的规律对真菌进行自然分 类，达到人们追求已久的自然分类目的，无疑 是分类学发展过鉴定等的很好的分子 标记，已经被成功地用于动物、植物、人和微生物的遗 传多样性检测、基因定位、品系鉴定、医学诊断、遗传 图谱构建和系统学研究等。 在分析生物间系统发育关系、分析突变以及亲缘关系鉴 定等方面显示出卓越的功能,一些表型上不能反映的遗传 物质的细微变化都可以通过RAPD技术显示出来。
核酸分子杂交技术 ppt课件
ppt课件
15
一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
ppt课件
26
(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
ppt课件
27
(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
ppt课件 11
二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
医学分子生物学 7 分子生物学常用技术
5′
3′
*********G —OH
*********C T T A A — P
3′
5′
5′
3′
P A A T T C*********
OH— G*********
3′ 5′
EcoR I: dATP+ [α-32P]-dTTP
19
根据反应原理确定同位素反应底物名称
• DNA的切口平移标记法 • 随机引物标记法 • DNA的3′末端标记
• 极高的特异性
缺点 半寿期短, 故要随用随标 放射性污染
9
1. DNA探针放射性标记方法
(1) 切口平移标记法 (2) 随机引物标记法 (3) PCR标记法 (4) 5′-末端标记 (5) 3′-末端标记
10
(1) DNA的切口平移标记法
5′
3 ′ 双链DNA
3′
5′
DNase I，Mg2+
② 反应产物的长度与加入的寡核苷酸引物的量呈反比。
当需要较长片段探针，可适当减少随机引物的加入量。
③ 所得到的标记产物为新合成的DNA单链。当采用单链
DNA片段或RNA作为模板时，必须注意得到的标记探针并 不是其本身.
④ 反应条件要控制在pH值6.6，抑制Klenow DNA聚合酶
的3′－5′外切酶的活性。
第七章 分子生物学常用技术
1
第一节 核酸分子杂交
2
*核酸分子杂交：
具有一定互补序列的不同来源的核苷酸单 链在一定条件下按照碱基配对的原则形成
杂交双链的过程。
实质: 核酸分子的变性与复性过程
变性：将双链DNA分子解聚成为单链的过程 复性：使单链聚合成双链的过程，又称为退火. 特点：高度特异性和灵敏性 杂交的双方: （靶,target） --待测序列
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操 作中形成的喷雾、 试剂及任何与扩增产物接触的东 西。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术 高俊燕
博 奥 生 物 集 团 有 限 公 司 生物芯片北京国家工程研究中心 北京博奥晶典生物技术有限公司
目录 核酸分子杂交的基本理论 核酸探针及其标记 核酸探针的标记方法 核酸分子杂交方法
DNA芯片技术
2
目 录
part 1
3
核酸分子杂交的基本理论
核酸分子杂交
具有互补序列的两条单链核酸 (DNA或RNA)分子在适宜的温度及离 子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则退火形成双链杂合体的过程称 为核酸分子杂交。 核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的 技术之一，也是临床分子检验的重要技术。 核酸分子杂交技术是 20 世纪 70 年代发展起来的一种崭新的分子生物 学技术。它是基于 DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针 与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。分子杂交实验依据其形 式的不同可以分为液相杂交和固相杂交，各类型杂交的基本原理和步骤 是基本相同的，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。
3、影响复性的因素 1） DNA浓度 DNA浓度越大复性速度越快 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1-0.5μ g，浓度过高影响杂交效率 2）DNA的分子质量 大分子质量的DNA扩散速度慢，复性速度慢
10
核酸分子杂交的基本理论
3）温度 温度过高，有利于DNA变性而不利于复性
4
核酸分子杂交的基本理论
关键步骤：
变性—杂交（复性）—检测信号—结论
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
信号的采集与处理
结论
5
核酸分子杂交的基本理论
DNA变性
1、定义：在某些理化因素作用下，两条DNA链间的氢键断裂，变为单 链的过程称DNA变性。 2、变性的方法： 1 ）热变性：温度升高到 90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全 断裂。 2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。 3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢 键断裂
博 奥 生 物 集 团 有 限 公 司 生物芯片北京国家工程研究中心 北京博奥晶典生物技术有限公司
目录 核酸分子杂交的基本理论 核酸探针及其标记 核酸探针的标记方法 核酸分子杂交方法
DNA芯片技术
2
目 录
part 1
3
核酸分子杂交的基本理论
核酸分子杂交
具有互补序列的两条单链核酸 (DNA或RNA)分子在适宜的温度及离 子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则退火形成双链杂合体的过程称 为核酸分子杂交。 核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的 技术之一，也是临床分子检验的重要技术。 核酸分子杂交技术是 20 世纪 70 年代发展起来的一种崭新的分子生物 学技术。它是基于 DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针 与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。分子杂交实验依据其形 式的不同可以分为液相杂交和固相杂交，各类型杂交的基本原理和步骤 是基本相同的，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。
3、影响复性的因素 1） DNA浓度 DNA浓度越大复性速度越快 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1-0.5μ g，浓度过高影响杂交效率 2）DNA的分子质量 大分子质量的DNA扩散速度慢，复性速度慢
10
核酸分子杂交的基本理论
3）温度 温度过高，有利于DNA变性而不利于复性
4
核酸分子杂交的基本理论
关键步骤：
变性—杂交（复性）—检测信号—结论
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
信号的采集与处理
结论
5
核酸分子杂交的基本理论
DNA变性
1、定义：在某些理化因素作用下，两条DNA链间的氢键断裂，变为单 链的过程称DNA变性。 2、变性的方法： 1 ）热变性：温度升高到 90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全 断裂。 2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。 3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢 键断裂
核酸的分子杂交
Home
3 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。
3.1 标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。
有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。
Home
应 用：
检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。
2 核酸探针的制备
2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
202X
CIICK HERE TO ADD A TITLE
单击添加副标题
第五节 核酸的分子杂交 Nucleic Acid Hybridization
Content of Table
CONTENTS
前 言
添加标题
单击添加文本具体内容
01
Part
添加标题
单击添加文本具体内容
02
前 言
Home
核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
2.2 探针的制备方法
01
02
03
PCR扩增
DNA重组技术
化学合成
长度一般以50~300bp为宜。制备方法：
2.3 探针的分类 据来源及性质不同可分为： 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
2.4 合成寡核苷酸探针注意原则
3 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。
3.1 标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。
有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。
Home
应 用：
检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。
2 核酸探针的制备
2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
202X
CIICK HERE TO ADD A TITLE
单击添加副标题
第五节 核酸的分子杂交 Nucleic Acid Hybridization
Content of Table
CONTENTS
前 言
添加标题
单击添加文本具体内容
01
Part
添加标题
单击添加文本具体内容
02
前 言
Home
核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
2.2 探针的制备方法
01
02
03
PCR扩增
DNA重组技术
化学合成
长度一般以50~300bp为宜。制备方法：
2.3 探针的分类 据来源及性质不同可分为： 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
2.4 合成寡核苷酸探针注意原则
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
最基本的原则是核酸探针与要检测的核酸之 间在核酸序列上要有高度的特异性
基因组DNA探针
• 真核生物基因组中存在大量的重复序列和 非编码序列，因此选择基因组DNA做探针 时，一定要充分考虑实验目的性
• 利用分子克隆或PCR方法可以获得某一段 特定的DNA序列
cDNA探针
• cDNA是能与mRNA互补的DNA分子，它是 利用RNA分子作模板在逆转录酶作用下产 生的。
复性
RNA
DNA
1. 原理 DNA的变性与复性
2. 常见条件：加热 S形曲线 解链温度（Tm） A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在
亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
Home
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
• 化学法P48：利用标记物分子上的活性基团与探 针分子上的基团发生的化学反应直接将标记物结 合到探针分子上。特点是简单、快速、均匀。
• 酶法P48：将标记物预先标记在核苷酸分子上， 然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子渗入到探 针分子上去，或将核苷酸分子上的标记基团交换 到探针分子上。
一个理想的标记物应满足：
(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。
常用探针的标记方法
3.2.1 缺口平移法 3.2.2 随机引物标记法 3.2.3 末端标记法 3.2.4 生物素光照标记法
缺口平移法的原理
• 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相结合。
第二节 核酸探针技术及其标记
探针 (probe) P46 经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，
能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检 测核酸样品中的特定基因。
一、核酸探针的种类和应用
根据核酸性质和检测目的不同可以分为： （一）基因组DNA探针 （二）cDNA探针 （三）RNA探针 （四）人工合成的寡核苷酸探针
第七章 核酸分子杂交技术与核酸
序列测定
Molecular Hybridization and Blotting Technology
Content of Table
前言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术
前言
核酸分子杂交
把亲源关系较近的，不同生物个体来源的 变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA 或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
在适当条件下，变性DNA的两条互补链 可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(ann酸分子杂交的应用
研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础
• 首先用E.coli的DNAse I 在探针DNA双链上造成缺口， 然后再借助于DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物 素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。
• 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链 上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的 DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。
随机引物标记法原理
用一些六核苷酸作为随机引物，将这些 引物和探针DNA片段一起热变性，退火后， 引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的 作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新 的标记的探针片段。
• 利用DNA合成仪，采用化学方法人工合成 寡核苷酸探针
设计寡核苷酸探针的原则
• 1）序列及长度 根据靶分子的序列而定， 长度一般为18-50个核苷酸合适。
• 2）碱基成分 一般G+C含量为40%-60% • 3）探针分子内不存在互补，避免出现“发
夹”结构 • 4）避免单一碱基的重复出现，不超过4个 • 5）与非靶标区域的同源性不超过70%
二、探针的标记
• 探针标记方法: 放射性和非放射性两种
放射性核素： 32P、35S和3H 非放射性标记物： 1）半抗原：生物素、地高辛素 抗原-抗体反应 2）配体：生物素-亲和素反应 3）荧光素 (FITC、罗丹明) 4）化学发光探针
探针标记方法
• 核酸分子杂交所用的探针几乎都用体外标记法标 记，分为化学法和酶法
第一节 核酸分子杂交的
基本原理
一、分子杂交与印迹技术的原理P44
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单
链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放 在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间 有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分 子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
• 利用基因克隆的方法可获得cDNA • 优点：cDNA探针不含有内含子序列，尤其
适用于基因表达的检测。
RNA探针
• RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交 反应效率极高
• 早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和 病毒RNA探针。利用mRNA与基因的 DNA 杂交，可以反映出基因的转录状态。
人工合成的寡核苷酸探针
➢ Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成， 在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的 50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解 温 度 (melting temperature, Tm) 。 其 大 小 与 G+C含量成正比。
DNA的复性与分子杂交
DNA复性(renaturation)的定义
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱 ➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
热变性
➢解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以
温 度 对 A260 （ absorbance ， A ， A260 代 表 溶 液 在 260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解 链曲线。
基因组DNA探针
• 真核生物基因组中存在大量的重复序列和 非编码序列，因此选择基因组DNA做探针 时，一定要充分考虑实验目的性
• 利用分子克隆或PCR方法可以获得某一段 特定的DNA序列
cDNA探针
• cDNA是能与mRNA互补的DNA分子，它是 利用RNA分子作模板在逆转录酶作用下产 生的。
复性
RNA
DNA
1. 原理 DNA的变性与复性
2. 常见条件：加热 S形曲线 解链温度（Tm） A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在
亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
Home
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
• 化学法P48：利用标记物分子上的活性基团与探 针分子上的基团发生的化学反应直接将标记物结 合到探针分子上。特点是简单、快速、均匀。
• 酶法P48：将标记物预先标记在核苷酸分子上， 然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子渗入到探 针分子上去，或将核苷酸分子上的标记基团交换 到探针分子上。
一个理想的标记物应满足：
(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。
常用探针的标记方法
3.2.1 缺口平移法 3.2.2 随机引物标记法 3.2.3 末端标记法 3.2.4 生物素光照标记法
缺口平移法的原理
• 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相结合。
第二节 核酸探针技术及其标记
探针 (probe) P46 经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，
能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检 测核酸样品中的特定基因。
一、核酸探针的种类和应用
根据核酸性质和检测目的不同可以分为： （一）基因组DNA探针 （二）cDNA探针 （三）RNA探针 （四）人工合成的寡核苷酸探针
第七章 核酸分子杂交技术与核酸
序列测定
Molecular Hybridization and Blotting Technology
Content of Table
前言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术
前言
核酸分子杂交
把亲源关系较近的，不同生物个体来源的 变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA 或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
在适当条件下，变性DNA的两条互补链 可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(ann酸分子杂交的应用
研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础
• 首先用E.coli的DNAse I 在探针DNA双链上造成缺口， 然后再借助于DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物 素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。
• 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链 上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的 DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。
随机引物标记法原理
用一些六核苷酸作为随机引物，将这些 引物和探针DNA片段一起热变性，退火后， 引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的 作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新 的标记的探针片段。
• 利用DNA合成仪，采用化学方法人工合成 寡核苷酸探针
设计寡核苷酸探针的原则
• 1）序列及长度 根据靶分子的序列而定， 长度一般为18-50个核苷酸合适。
• 2）碱基成分 一般G+C含量为40%-60% • 3）探针分子内不存在互补，避免出现“发
夹”结构 • 4）避免单一碱基的重复出现，不超过4个 • 5）与非靶标区域的同源性不超过70%
二、探针的标记
• 探针标记方法: 放射性和非放射性两种
放射性核素： 32P、35S和3H 非放射性标记物： 1）半抗原：生物素、地高辛素 抗原-抗体反应 2）配体：生物素-亲和素反应 3）荧光素 (FITC、罗丹明) 4）化学发光探针
探针标记方法
• 核酸分子杂交所用的探针几乎都用体外标记法标 记，分为化学法和酶法
第一节 核酸分子杂交的
基本原理
一、分子杂交与印迹技术的原理P44
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单
链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放 在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间 有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分 子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
• 利用基因克隆的方法可获得cDNA • 优点：cDNA探针不含有内含子序列，尤其
适用于基因表达的检测。
RNA探针
• RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交 反应效率极高
• 早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和 病毒RNA探针。利用mRNA与基因的 DNA 杂交，可以反映出基因的转录状态。
人工合成的寡核苷酸探针
➢ Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成， 在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的 50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解 温 度 (melting temperature, Tm) 。 其 大 小 与 G+C含量成正比。
DNA的复性与分子杂交
DNA复性(renaturation)的定义
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱 ➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
热变性
➢解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以
温 度 对 A260 （ absorbance ， A ， A260 代 表 溶 液 在 260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解 链曲线。