第9章1-化学键合相色法
宋敏
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(1)硅胶的预处理
酸处理
酸处理可以用 0.1 mol/L的盐 酸，于90℃下 浸泡24 h，或 以10%的盐酸 在回流状态处 理8 h 。
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中和
中和，水洗至 无Cl- ，经酸处 理后的硅胶表 面的羟基浓度 已达到理论值8 μmol/m2左右 。
干燥
在200℃以下真 空烘干除去物 理吸附水，注 意不得超过 200℃，否则硅 醇基脱水形成 硅氧烷结构。
药物色谱分析
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第九章－1 化学键合相色谱
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主要内容
一 概述：特点 二 固定相的制备和性能评价 三 非极性键合相 四 新型高效化学键合固定相
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一、概 述
1、化学键合相色谱的定义 2、化学键合相的特点 3、化学键合相的稳定性 3、化学键合相的分类
Si OH + R3SiX
R Si O Si R + HX
R
• X 通常为－Cl、－OH、－OCH3、－OC2H5等官能团；
• R 通常为直链或支链烷基、芳香基，如－CH3、－C4H9、 －C8H17、－C18H37、苯基等，也可以是它们被不同的基 团取代后的衍生基团，如－(CH2)2CN、－(CH2)2NH2、 －(CH2)n－O－CH2－OH等。
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硅胶的性质
• 硅胶（SiO2·xH2O）之所以是理想的化学键合 相担体，主要由它的表面性质所决定。硅胶具 有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表 面积、较好的化学稳定性和热稳定性以及专一 的表面化学反应等优点，另外，硅胶表面存在 着足够的可反应硅羟基，因而是各种化学键合 相理想基质材料。
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双官能团有机硅烷
• 双官能团化合物如R2SiX2可单独形成线型或环 状有机硅氧烷。
Si OH + R2SiX2
R Si O Si R + HX
X
Si OH O Si OH
+ R2SiX2
Si O
R
O Si + 2HX
Si O
R
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1、化学键合相色谱的定义
化 借助于化学反应的方法将有机分子以
学 共价键连接在色谱担体上形成化学键
键 合相，以化学键合相为固定相的色谱
合 相
法称为化学键合相色谱（bonded
色 phase chromatography，BPC），简
谱 称键合相色谱。
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2、化学键合相的特点
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3、化学键合相的稳定性
1．在较低pH值条件下（pH<2）
键合相中Si―O―Si键易受Lewis酸等亲电试剂的进攻而
断裂：
Si Si O
Si OH
+
-Y +Si
Y-H+
2．化学键合固定相在较高pH值条件下的稳定性（pH>9）
键合相中Si―O―Si键很容易被KOH和NaOH这一类强碱
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③ Si－O－Si－C键型
• Si－O－Si－C键型是一类目前占绝对优势的键 合相类型，具有良好的热稳定性及化学稳定性， 能在pH 2～8的介质中使用。这类键合固定相 是硅胶上的硅羟基与有机氯硅烷或烷氧基硅烷 试剂反应而得。
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单官能团有机硅烷
性亲核试剂所切断：
Si Si O
Si OH
+
Si O-M+
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M+OH- 中国药科大学药物色谱分析课程
4、化学键合相的分类
• 化学键合相的分类可以有不同的依据。 按键合相的表面结构：单分子键合和聚合键合；
按键合有机硅烷的官能团：极性键合相、非极 性键和相和离子交换键合相三种。
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（2）溶剂与试剂预处理
• 硅烷化试剂对水很敏感，使用前应以蒸馏方式 进行纯化或以玻璃棉将其中的悬浮物滤去。所 使用的有机溶剂，必须进行干燥。
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（3）衍生化反应
（1）Si－O－C键型 （2）Si－N或Si－C键型 （3）Si－O－Si－C键型
1. 与液－液分配色谱相比，使用过程中固定相 不流失，耐溶剂冲洗。
2. 与液－固吸附色谱相比，消除了担体上的表 面活性作用点，清除了某些可能的催化活性。
3. 表面改性灵活，容易获得重复性产品。 4. 化学性能稳定，耐受范围为pH2～8。 5. 热稳定性好，一般在70℃以下稳定。 • 载样量大，比硅胶约高一个数量级。 • 梯度洗脱平衡快。
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② Si－N或Si－C键型
MgBr Si
+ l
Si OH + SOCl2
Si Cl
NH
2
CH
2
CH
2
NH
2
Si NHCH2CH2NH2 + HCl
• 这类固定相比Si－O－C键型固定相的水解稳 定性和热稳定性好，但适用pH值范围窄（pH ＝4～8），因此实用价值亦不大。
二、固定相
1、化学键合相的制备 2、常见的官能团 3、常用的键合相商品牌号 4、化学键合相性能评价 5、使用键合固定相应注意的问题
1、化学键合相的制备
要形成化学键合固定相，有两个必要条件： ① 所用的担体材料应有某种化学反应活性，
如硅胶、氧化铝、硅藻土等表面都具有化 学反应的官能团，一般以硅胶最为理想的 和常用。 ② 有机分子应含有能与担体表面发生反应的 官能团。
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① Si－O－C键型
• 酯化反应是最早用于制备化学键合相的反应。 这类固定相是直接用硅羟基Si－OH与醇类R－ OH通过酯化反应制得。
150℃ Si OH + HOR
3~8h
Si O R + H2O
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• 酯化反应在硅胶表面形成单分子层的硅酸酯。 这类固定相虽然有很高的柱效，但是它显著的 缺点是易水解、醇解，热稳定性差，在色谱发 展早期用于正相色谱模式中，现已不大使用。
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1、化学键合相的制备
硅胶预处理
溶剂与试剂 预处理
衍生化反应
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端基封尾 中国药科大学药物色谱分析课程
(1)硅胶的预处理
• 在制备键合相时，首先作为担体的硅胶需要酸 处理，洗去制备、运输和保存过程中引入的污 染物；除去表面层的金属氧化物杂质，如Na+、 Ca2+、Al3+、Fe3+等；使表面的硅氧烷键打开， 形成尽可能多的自由羟基，有利于反应。
高效液相色谱法 PPT课件
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
【实用】键合相色谱法PPT文档
根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。 化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。
理为主。 为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，
键合相色谱法
2）化学键合固定相 化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载
体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度 淋洗等特点。
键合相色谱法
任务二：高效液相色谱法基本原理 任务二：高效液相色谱法基本原理
化学键合的表面覆这盖度种决定固哪种定机理相起主分要作离用。机理既不是简单的吸附，也不是单一
化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。 情境七：高效液相色谱对微量组分分析
该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相 1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.
1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0. 根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。
预先被固定液饱和。 这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。
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这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。 1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.
任务二：的高效液液相液色谱分法基配本原，理 而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度
色谱基础和HPLC的常用术语
色谱基础和HPLC的常用术语1、气相色谱法（GC）—gas chromatography用气体做为流动相的色法。
2、气液色谱法（GLC）—gas liquid chromatography 将固定液涂在载体上作为固定相的气相色谱法。
3、气固色谱法（GSC）—gas solid chromatography 用固体（一般指吸附剂）作固定相的气相色谱法。
4、程序升温气相色谱法—programmed temperature gas chromatography 色谱柱按照预定的程序连续地或分阶段地进升温的气相色谱法。
5、反应气相色谱法—reaction gas chromatography 试样以过色谱前、后的反应区进行化学反应的气相色谱法。
6、裂解气相色谱法—pyrolysis gas chromatography 试样经过高温、激光、电弧等途径，裂解为较小分子后进入色谱柱的气相色谱法。
7、顶空报相色谱法—haed （应为head -编者注）space gas chromatography d 在密闭的容器中与液体（或）固体）试样处于势力学平衡（应为热力学平衡 -编者注）状态的气相组分，是间接测定试样中挥发性组分的一种方法。
8、毛细管气相色谱法—capillary gas chromatography 使用具有高分离效能的毛细管柱的气相色谱法。
9、多维气相色谱法—multidimensional gas chromatography 将两个或多个色谱柱组合，通过切换，可进行正吹、反吹或切割等的气相色谱法。
10、制备气相色谱法—preparative gas chromatography 用能处理较大量试样的色谱系统，进行分离、切割和收集组分，以提纯化全物的气相色谱法。
11、色谱柱：chromatographic column内有固定相用以分离混合组分的柱管。
12、填充柱：packed cklumn （应为column-编者注）填充了固定相的色谱柱。
第9章4-化学键合相色法-离子交换键合相
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1
如何提高分离度？
可采用不同pH的缓冲液作为梯度淋洗
阴离子交换为例
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2）离子强度对保留值得影响 离子强度（缓冲盐浓度）增加，ｋ＇减
小。 原因归结于离子交换平衡的移动。
3）有机改性剂对保留的影响
如果洗脱液中加入极性有机组分（如乙 醇），则抑制离子交换，并且产生按分 配机理进行的分离。
流动相：含5 %甲酸的10 %甲醇水溶液（A相）－含1 %甲酸 的10 %甲醇水溶液（B相）0min100％B→3min100％A
色谱柱：Alltech Allsep Anion column（100mm×4.6mm, 7μ
m）
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保留规律
阳离子交换剂分离有机碱
• 在用强阳离子交换键合相分离碱性药物 时，pH↑→游离碱↑→ｋ’↓，保留时 间↓。
2）阴离子交换
A：样品离子 N：流动相离子 R：固定相带正电荷的交换基团
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1）pH值对保留时间的影响
先解离并 参加离子 交换而被 分离
弱酸及弱碱的 保留值与洗脱 液的pH值有关
不解离，不参 加离子交换， 而以分子形式 几乎无保留地 通过柱子
Tips
流动相的pH选择应适中，最好选择 在被分离的酸或碱的pka或pkb附 近，使它们解离适中，达到最佳分 离。
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第九章－4 化学键合相色谱
离子交换键合相色谱
ion exchange chromatography，IEC
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1、分离机理
1）阳离子交换
Xm+ + Y+Rs-
第9章2-化学键合相色法-非极性键合相
1、疏溶剂作用理论
1）“分子毛” —— 疏溶剂作用理论认为非极性烷基键合相
是在硅胶表面蒙覆了一层以Si-C键化学 键合的十八烷基（或其它烃基）的“分子 毛”。
强疏水性
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主要内容
一 概述：特点 二 固定相的制备和性能评价 三 非极性键合相 四 新型高效化学键合固定相
17:10
34
1、一般非极性键合相
1）键合反应
R2:两个甲基，则构成高碳ODS键合相 R2:一个甲基，一个氯，则生成中碳ODS键合相 R2:两个氯，生成低碳ODS键合相
高碳ODS键合相载样量大、吸附性能也大。
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四、流动相
宋敏 17:10
• 常用流动相
• 溶质保留值随溶剂极 性变化的一般规律
CH3
CH3
OCH2CHNHCH2CH2
CH3
盐酸非洛普
OCH3 OCH3
CH3
CH3
OCH3
OCH2CHNHCH2CH2
OH
CH3
盐酸非洛普的代谢物M1
CH3
CH3
OCH3
HO
OCH2CHNHCH2CH2
OH
CH3
盐酸非洛普的代谢物M2
O HO S O
O
CH3
CH3
OCH2CHNHCH2CH2
CH3
盐酸非洛普的代谢物M3
OCH3 OH
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lgk
反相HPLC中烷基键合相碳链长度及流动相中有机 相比例对某物质保留值的影响
洗脱液：水：甲醇 （90：10）
色谱术语中英对照
1、气相色谱法（GC）—gas chromatography用气体做为流动相的色法。
2、气液色谱法（GLC）—gas liquid chromatography 将固定液涂在载体上作为固定相的气相色谱法。
3、气固色谱法（GSC）—gas solid chromatography 用固体（一般指吸附剂）作固定相的气相色谱法。
4、程序升温气相色谱法—programmed temperature gas chromatography 色谱柱按照预定的程序连续地或分阶段地进升温的气相色谱法。
5、反应气相色谱法—reaction gas chromatography 试样以过色谱前、后的反应区进行化学反应的气相色谱法。
6、裂解气相色谱法—pyrolysis gas chromatography 试样经过高温、激光、电弧等途径，裂解为较小分子后进入色谱柱的气相色谱法。
7、顶空报相色谱法—haed （应为head -编者注）space gas chromatography d在密闭的容器中与液体（或）固体）试样处于势力学平衡（应为热力学平衡 -编者注）状态的气相组分，是间接测定试样中挥发性组分的一种方法。
8、毛细管气相色谱法—capillary gas chromatography 使用具有高分离效能的毛细管柱的气相色谱法。
9、多维气相色谱法—multidimensional gas chromatography 将两个或多个色谱柱组合，通过切换，可进行正吹、反吹或切割等的气相色谱法。
10、制备气相色谱法—preparative gas chromatography 用能处理较大量试样的色谱系统，进行分离、切割和收集组分，以提纯化全物的气相色谱法。
11、色谱柱：chromatographic column内有固定相用以分离混合组分的柱管。
12、填充柱：packed cklumn （应为column-编者注）填充了固定相的色谱柱。
化学键合相色法
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（2）溶剂与试剂预处理
• 硅烷化试剂对水很敏感，使用前应以蒸馏方式 进行纯化或以玻璃棉将其中的悬浮物滤去。所 使用的有机溶剂，必须进行干燥。
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（3）衍生化反应
（1）Si－O－C键型
（2）Si－N或Si－C键型
（3）Si－O－Si－C键型
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1、化学键合相色谱的定义
化 学 键 合 相 色 谱 借助于化学反应的方法将有机分子以 共价键连接在色谱担体上形成化学键 合相，以化学键合相为固定相的色谱 法称为化学键合相色谱（bonded phase chromatography，BPC），简 称键合相色谱。
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2、化学键合相的特点
衍生化反应
端基封尾
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(1)硅胶的预处理
• 在制备键合相时，首先作为担体的硅胶需要酸 处理，洗去制备、运输和保存过程中引入的污 染物；除去表面层的金属氧化物杂质，如Na+、 Ca2+、Al3+、Fe3+等；使表面的硅氧烷键打开， 形成尽可能多的自由羟基，有利于反应。
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1. 与液－液分配色谱相比，使用过程中固定相 不流失，耐溶剂冲洗。 2. 与液－固吸附色谱相比，消除了担体上的表 面活性作用点，清除了某些可能的催化活性。 3. 表面改性灵活，容易获得重复性产品。 4. 化学性能稳定，耐受范围为pH2～8。 5. 热稳定性好，一般在70℃以下稳定。 • 载样量大，比硅胶约高一个数量级。 • 梯度洗脱平衡快。
+ O M Si
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4、化学键合相的分类
第9章3-化学键合相色法-极性键合相
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三、固定相
• 氨基、氰基、芳硝基、二醇基、醚基键 合相可用作正相色谱。它们主要以氢键 力与溶质相互作用，其氢键力以下列顺 序逐渐减弱： 氨基﹥氰基﹥芳硝基﹥二醇基﹥醚基
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2、氰基键合相
• 氰基键合相为质子接受体，具有中等极性，分 离选择与硅胶类似，但比硅胶的保留值低。
• 对酸性、碱性样品可获得对称的色谱峰。 • 对含双键的异构体或双键环状化合物具有良好
的分离能力。
• 与氨基键合相比较，溶质在此类固定相的k值 会减小。
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分离结构相近的组分时，极性大的组 分后出柱。
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四、流动相－正相色谱
3、溶质保留值随溶剂极性变化的一般保
留规律
在正相色谱中，使
用弱极性溶剂作流
动相，则极性弱的
B组分先流出，A组
分后流出。当更换
中等极性溶剂作流
动相时，二者流出
顺序不便，但他们
的保留值都进一步
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中国减药科小大。学药物色谱分析课程
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1、氨基键合相
• 氨基具有碱性，可在酸性水溶液中作为弱阴离 子交换剂，用于分离酚、羧酸、核苷酸。
• 氨基用作反相固定相可与糖分子中的羟基作 用，因此广泛用于单糖、双糖以及多糖的分 离。
注意
氨基柱不可分析羰基的化合物 （如甾酮、还原糖等）
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化学键合相色谱法
化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体（硅胶）表面， 形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。其分离机理为吸附和分配两种机 理兼有。对多数键合相来说，以分配机理为主。通常，化学键合相的载体是硅胶， 硅胶表面有硅醇基， ≡Si–OH，它能与合适的有机化合物反应，获得各种不同 性能的化学键合相。
荧光量子产率 荧光量子产率（Yf）即荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光 的光子数之比值。它的数值在通常情况下总是小于 1。YF 的数值越大则化合物的 荧光越强，而无荧光的物质的荧光量子产率却等于或非常接近于零。Yf=kf/(kf+ Σki)
量子产率取决于辐射和非辐射跃迁过程，即荧光发射、系间跨越、外转移和 内转移等的相对速率，式中 kf 是荧光发射的速率常数，Σki 是系间跨越等非辐 射跃迁过程的速率常数的总和。通常 kf 主要取决于分子的化学结构，Σki 主要 取决于化学环境，同时也与化学结构有关。磷光的量子产率与荧光相似。 蓝移（或紫移，hypsochromic shift or blue shift)是吸收峰向短波长移动。 保留值 气相或液相操作中，当仪器的操作条件保持不变时， 任一物质的色谱峰总是在 色谱图上固定的位置出现， 即有一定的保留值。又包含：死时间，保留时间， 校下保留时间，保留体积，等等、 电子光谱 分子中电子在电子能级之间跃迁产生的光谱 斯托克斯位移 固体吸收光子（吸收）的能量将大于辐射光子（发光），因此发光光谱与吸收光 谱相比，将向能量较低的方向偏移（红移），两个光子能量的差值称为斯托克斯 谱位移。能量的差值主要是由于晶体中热质子的损耗，在该过程相反过程中使得 晶体得到冷却。 荧光光谱发生向短波方向的位移被称为反斯托克位移 （Anti-Stoke’s shift）。 偶极矩 正、负电荷中心间的距离 r 和电荷中心所带电量 q 的乘积，叫做偶极矩μ=r×q。 共振线 原子受到外界能量激发时，其外层电子从基态跃迁到激发态所产生的吸收线称为 共振吸收线，简称共振线。 外层电子由激发态直接跃迁到基态时所辐射的谱线 称为共振发射线，也简称为共振线。原子由激发态直接跃迁到基态所发射的谱线。 由最低激发态跃迁到基态所发射的谱线，称为第一共振线。第一共振线的激发能 最低，原子最容易激发到这一能级。因此，第一共振线辐射最强，最易激发。上 述为共振线的广泛定义。 生色团 生色团是指分子中含有的，能对光辐射产生吸收、具有跃迁的不饱和基团。某些 有机化合物分子中存在含有不饱和键的基团，能够在紫外及可见光区域内（200～ 800nm）产生吸收，且吸收系数较大，这种吸收具有波长选择性，吸收某种波长 （颜色）的光，而不吸收另外波长（颜色）的光，从而使物质显现颜色，所以称 为生色团，又称发色团(chromophore)。 增色效应 增色效应是指由于化合物结构改变或其他原因，使吸收强度增加的效应 HPLC 高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统， 将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固 定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样 的分析。
何谓化学键合相色谱,正相色谱和反相色谱
化学键合相色谱是一种分析化学方法，它利用化学键合相作为固定相，通过化学键合相与样品分子之间的化学作用来实现分离。
化学键合相色谱分为正相色谱和反相色谱两种类型。
正相色谱中，固定相是极性的，而流动相是非极性的，样品分子在固相和流动相之间根据极性差异进行分离。
反相色谱与之相反，固定相是非极性的，而流动相是极性的，样品分子根据溶解度差异进行分离。
1. 化学键合相色谱的定义化学键合相色谱是一种以化学键合相为固定相的色谱分离技术。
化学键合相是一种将固定相与填料表面通过化学键结合的材料，它能够提供更高的稳定性和选择性，并且适用于更广泛的分析对象。
化学键合相能够与样品分子进行特定的化学作用，从而实现样品分离。
2. 正相色谱正相色谱的固定相是极性的，如硅胶或乙醇胺等，而流动相是非极性的溶剂，例如正己烷或甲醇等。
在正相色谱中，样品分子根据其极性差异在固定相和流动相之间进行分离。
极性分子与固定相的作用力较强，因此在固定相中停留时间较长，而非极性分子则停留时间较短。
3. 反相色谱反相色谱的固定相是非极性的，如碳链或苯基等，而流动相是极性的溶剂，例如水或乙腈等。
在反相色谱中，样品分子根据其在固定相和流动相中的溶解度差异进行分离。
溶解度较大的分子在固定相中停留时间较长，而溶解度较小的分子则停留时间较短。
4. 化学键合相色谱的应用化学键合相色谱广泛应用于生物化学、药学、食品安全等领域。
正相色谱常用于酚类、羟基化合物、酮类等极性化合物的分离，反相色谱则常用于脂溶性化合物、脂肪族化合物的分离。
由于化学键合相色谱能够提供更高的选择性和分辨率，因此在复杂样品分析中具有较大的优势。
5. 化学键合相色谱的发展随着化学分析技术的不断发展，化学键合相色谱也在不断完善和创新。
新型的化学键合相材料和方法的引入，使化学键合相色谱具有更广泛的适用性和更高的分析效率。
未来，化学键合相色谱将会在更多领域得到应用，并且成为分析化学中不可或缺的重要方法之一。