化学键合相色法
第9章2-化学键合相色法-非极性键合相
AU
0.008
3.462
19.706
分离不同pKa值的化合物：
通过控制流动相pH值的方式进行分离 缓冲溶液的要求 1。要有一定的缓冲容量，但是过高的缓冲液会损害 色谱柱，不要超过50mM. 2。要与检测体系匹配，常用的磷酸盐缓冲液不挥发， 没有紫外吸收，多用于紫外检测器；醋酸铵盐系统挥 发性好，可用于ELSD、MS检测器； 3。注意缓冲液在有机溶剂中溶解度较小，因此采用 梯度洗脱时要特别注意避免出现盐析现象。 郑枫 中国药科大学药物色谱分析课程
普鲁卡因胺
n-普鲁卡因酰胺
普鲁卡因胺 n-普鲁卡因酰胺
甲醇-水（40：60）
甲醇-水+三乙胺
郑枫
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3。溶样溶剂的影响
溶剂效应：注意用流动相稀释样品
Column: HP-C18 (5m, 120Å, 4.6x250mm, 08050816168) Mobile phase:ACN:1%H3PO4 =0.3:99.7 Flow rate:1.0mL/min Column tem.: RT Wavelength:210 nm Injection Volume: 10.0L
药物色谱分析
第九章－2 化学键合相色谱
非极性键合相色谱
22:44
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1
正相键合相色谱 VS 反相键合相色谱
正 相 键 合 相 色 谱
反 相 键 合 相 色 谱
键合相极性>流动相极性
键合相极性<流动相极性
22:44
2
一、概 述
非极性键合相色谱，又称反相 HPLC(reversed phase HPLC,RP-HPLC),或反相键合相 色谱（RPBC）：硅胶表面键合 了非极性有机基团(烃基硅烷) 的固定相。常见的烃基有丙基、 己基、辛基、十六烷基、十八 烷基和苯基，其中以十八烷基 键合相（简称ODS或C18）应用 最广泛。
第9章4-化学键合相色法-离子交换键合相
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1
如何提高分离度？
可采用不同pH的缓冲液作为梯度淋洗
阴离子交换为例
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2）离子强度对保留值得影响 离子强度（缓冲盐浓度）增加，ｋ＇减
小。 原因归结于离子交换平衡的移动。
3）有机改性剂对保留的影响
如果洗脱液中加入极性有机组分（如乙 醇），则抑制离子交换，并且产生按分 配机理进行的分离。
流动相：含5 %甲酸的10 %甲醇水溶液（A相）－含1 %甲酸 的10 %甲醇水溶液（B相）0min100％B→3min100％A
色谱柱：Alltech Allsep Anion column（100mm×4.6mm, 7μ
m）
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保留规律
阳离子交换剂分离有机碱
• 在用强阳离子交换键合相分离碱性药物 时，pH↑→游离碱↑→ｋ’↓，保留时 间↓。
2）阴离子交换
A：样品离子 N：流动相离子 R：固定相带正电荷的交换基团
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1）pH值对保留时间的影响
先解离并 参加离子 交换而被 分离
弱酸及弱碱的 保留值与洗脱 液的pH值有关
不解离，不参 加离子交换， 而以分子形式 几乎无保留地 通过柱子
Tips
流动相的pH选择应适中，最好选择 在被分离的酸或碱的pka或pkb附 近，使它们解离适中，达到最佳分 离。
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第九章－4 化学键合相色谱
离子交换键合相色谱
ion exchange chromatography，IEC
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1、分离机理
1）阳离子交换
Xm+ + Y+Rs-
键合相色谱法
键合相色谱法键合相色谱法随着科学技术的不断进步，人类对于生命体的研究日益深入。
对于分子结构的识别和分析，是生物化学研究中的一项重要工作。
化学分析中的传统技术往往是使用气相色谱、液相色谱等技术进行分离和识别。
然而，有一种技术也逐渐得到应用，它就是键合相色谱法。
1.什么是键合相色谱法？键合相色谱法是一种高效液相色谱技术，用于确定化合物的分子量和结构。
该技术通过在柱子内填充载有特殊化学结构的固相键合相材料，将试样中的化合物与材料中的相结合，在分离过程中获得化学信息。
2.键合相色谱法的原理键合相色谱法的原理是将分子与特殊的固相材料相结合，然后通过改变流动相成分的性质，使之离开材料表面，实现分离的过程。
常见的键合相材料有氨基、硅胶、硅胶大孔、疏水性、离子交换、配基和亲水性等材料。
3.键合相色谱法的应用键合相色谱法具有许多应用。
最常见的应用是用于鉴定和识别化合物的分子量和结构。
另外，该技术还可使用于制药、食品、环保、化妆品等领域中的生产工艺和质量控制。
此外，由于键合相色谱法操作简单，易于掌握，因此在许多人文和社会科学领域中也得到广泛的应用。
4.键合相色谱法的发展前景随着时代的进步，各行各业的要求越来越高。
对于分子结构的研究和生产领域中化合物的分离和识别，越来越需要更强大的技术手段。
键合相色谱法正是一个很好的选择。
由于它的分离效率高，能够满足更高的分析要求，因此可以预见，键合相色谱法在未来的发展中，将会变得更加重要。
综上所述，键合相色谱法是一种非常有前途的液相色谱技术。
它的分离效率、操作简单、易于掌握等优点，为其在分子结构的识别和分析方面提供了广泛应用的前景。
我们期待着，随着科学技术的不断进步，键合相色谱法将会给我们带来越来越多的惊喜。
键合相色谱法缩写
键合相色谱法缩写
键合相色谱法缩写
一、什么是键合相色谱法？
键合相色谱法（bonded phase chromatography）是一种常用的高效液相
色谱技术，在生物医药领域的分离、纯化、鉴定等方面有着广泛的应用。
它利用化学键结合作为液相固定相，对化学反应物质进行强制吸附，利用物质分子的亲密接触，以此实现物质的分离。
二、键合相色谱法的优点
1. 良好的分离效果
键合相色谱法通过制备稳定的固定相，在不同的条件下对物质进行吸
附和排除，从而实现对物质的分离。
由于化合物之间的吸附作用很强，所以键合相色谱法能够很好地分离化学反应物质。
2. 高效性
键合相色谱法的吸附效果稳定，与分析程序的时间较短相关，可以处
理大量的样品，提高工作效率。
3. 容易操作
键合相色谱法设备简单，操作容易，也容易选择和准备固定相。
三、键合相色谱法缩写的意义
键合相色谱法的缩写是BPC，其全称为“Bonded Phase Chromatography”。
缩写的使用是为了方便人们记忆，并且能够简洁、明确地表达技术名称。
此外，缩写也有助于人们在文献资料中进行查询和阅读。
四、总结
键合相色谱法是一种应用广泛的高效液相色谱技术，用于生物医药领
域的分离、纯化、鉴定等方面。
其具有良好的分离效果、高效性和容
易操作等优点。
为了方便人们记忆、查询和拓展文献资料，BPC就是
该技术的缩写形式。
药物色谱分析
当不能达到分离要求时，可用相同洗脱能力的不 同溶剂系统代替原溶剂系统。
在色谱柱耐受范围内，可加入调节剂，抑制弱酸 的解离或弱碱的质子化，增加其分配系数。
第三节 非极性键合相色谱法 （non-polar bonded phase chromatography）
第三节 非极性键合相色谱法 （non-polar bonded phase chromatography）
三、非极性键合相色谱法的流动相的基本组成 1、一元溶剂系统：一般不采用纯水系统 2、二元溶剂系统：一般采用洗脱能力较弱的水作为底剂，再加
入一定量与水相混溶的有机溶剂作为调节剂，如甲醇、乙腈， 也可考虑四氢呋喃 3、三元溶剂系统：在二元溶剂系统基础上添加四氢呋喃、三乙 胺、离子对试剂、缓冲盐、醋酸、磷酸等
第三节 非极性键合相色谱法 （non-polar bonded phase chromatography）
四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则
原则 首选溶剂
多元溶剂
洗脱能力
替代溶剂
离子抑制 色谱
解释
非极性色谱首选溶剂为甲醇、乙腈、四氢呋喃， 底剂为水
由不同组别的纯溶剂与底剂（或极性调节剂）组 成，一般不同时使用两个相同组别的纯溶剂
第三节 非极性键合相色谱法 （non-polar bonded phase chromatography）
四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则
四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则
（一）中性化合物的分析
减小保留值
增加保留值
使用碳链较短的键合相C8、 使用碳链较长的键合相C18、 C4
使用极性低的流动相，增加 使用极性大的流动相，增加
何谓化学键合相色谱,正相色谱和反相色谱
化学键合相色谱是一种分析化学方法，它利用化学键合相作为固定相，通过化学键合相与样品分子之间的化学作用来实现分离。
化学键合相色谱分为正相色谱和反相色谱两种类型。
正相色谱中，固定相是极性的，而流动相是非极性的，样品分子在固相和流动相之间根据极性差异进行分离。
反相色谱与之相反，固定相是非极性的，而流动相是极性的，样品分子根据溶解度差异进行分离。
1. 化学键合相色谱的定义化学键合相色谱是一种以化学键合相为固定相的色谱分离技术。
化学键合相是一种将固定相与填料表面通过化学键结合的材料，它能够提供更高的稳定性和选择性，并且适用于更广泛的分析对象。
化学键合相能够与样品分子进行特定的化学作用，从而实现样品分离。
2. 正相色谱正相色谱的固定相是极性的，如硅胶或乙醇胺等，而流动相是非极性的溶剂，例如正己烷或甲醇等。
在正相色谱中，样品分子根据其极性差异在固定相和流动相之间进行分离。
极性分子与固定相的作用力较强，因此在固定相中停留时间较长，而非极性分子则停留时间较短。
3. 反相色谱反相色谱的固定相是非极性的，如碳链或苯基等，而流动相是极性的溶剂，例如水或乙腈等。
在反相色谱中，样品分子根据其在固定相和流动相中的溶解度差异进行分离。
溶解度较大的分子在固定相中停留时间较长，而溶解度较小的分子则停留时间较短。
4. 化学键合相色谱的应用化学键合相色谱广泛应用于生物化学、药学、食品安全等领域。
正相色谱常用于酚类、羟基化合物、酮类等极性化合物的分离，反相色谱则常用于脂溶性化合物、脂肪族化合物的分离。
由于化学键合相色谱能够提供更高的选择性和分辨率，因此在复杂样品分析中具有较大的优势。
5. 化学键合相色谱的发展随着化学分析技术的不断发展，化学键合相色谱也在不断完善和创新。
新型的化学键合相材料和方法的引入，使化学键合相色谱具有更广泛的适用性和更高的分析效率。
未来，化学键合相色谱将会在更多领域得到应用，并且成为分析化学中不可或缺的重要方法之一。
正相化学键合色谱和反相化学键合色谱的异同点
正相化学键合色谱和反相化学键合色谱的异同点正相化学键合色谱和反相化学键合色谱是一种应用于分析化学品的分析手段，主要用于研究化合物的结构。
两者的最大的不同在于所使用的溶剂以及所采用的技术。
正相化学键合色谱是一种基于气相色谱（GC）仪器的技术，它以正电解质为柱前溶剂，其中含有微量氯化物或其它类似物质，以及氢气或氦气作为柱间溶剂。
在正相化学键合色谱中，样品以常压抽取或低温热抽取的方式进入柱内，在高温下分解，分子会通过柱内的色谱运动，其中包含的元素会在柱内按照不同的速度移动，从而形成一个准确的按照时间的排列的色谱。
反相化学键合色谱是一种基于液相色谱（LC）仪器的技术，它以带有负电解质的溶剂，如乙腈、甲醇、甲醛、乙醇或水作为柱前溶剂，以及氢气、氦气或其他气体作为柱间溶剂。
在反相化学键合色谱中，样品以常压抽取或低温热抽取的方式进入柱内，在高温下分解，分子会通过柱内的色谱运动，其中包含的元素会在柱内按照不同的速度移动，形成一个准确的按照时间的排列的色谱。
正相化学键合色谱和反相化学键合色谱的最大区别在于柱前溶剂的不同。
由于柱前溶剂的不同，正相化学键合色谱和反相化学键合色谱在分解样品时，其分子移动速度存在显著差异。
此外，由于反相化学键合色谱柱前溶剂中含有负电解质，样品中的分子在柱内会受到电解质的影响，从而影响样品的分解，从而影响色谱的检测精度。
正相化学键合色谱和反相化学键合色谱之间的区别使得它们的应用领域也有所不同，正相化学键合色谱更适合分析烷烃、芳烃和其他脂类物质，而反相化学键合色谱更适合分析芳香族物质、碳酸酯和其他有机酸类物质。
总之，正相化学键合色谱和反相化学键合色谱之间的差异在于所使用的溶剂以及所采用的技术，他们的应用领域也不同，有助于更好地分析化合物的结构，从而更好地了解化学品的性质。
化学键合相色谱法
一、原理“化学键合相色谱法”——采用化学键合相作固定相的液相色谱法。
化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体（硅胶）表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。
其分离机理为吸附和分配两种机理兼有。
对多数键合相来说，以分配机理为主。
通常，化学键合相的载体是硅胶，硅胶表面有硅醇基，≡Si–OH，它能与合适的有机化合物反应，获得各种不同性能的化学键合相。
从键合反应的性质可分为：酯化键合（≡Si-O-C）、硅氮键合（≡Si-N）和硅烷化键合（≡Si-O-Si-C）等；硅烷化键合相应用最广泛。
这种键合相是用有机氯硅烷与硅醇基发生反应：≡Si–OH + C18H37 SiCl3→ ≡Si-O–Si–C18H37 + HCl,这种固定相在pH = 2～8.5 范围内对水稳定，有机分子与载体间的结合牢固，固定相不易流失稳定性好。
十八烷基硅烷键合相（Octadecylsilane 简称ODS或C18）：是最常用的非极性键合相。
它们用于反相色谱法，在70℃以下和pH 2～8范围内可正常工作。
化学键合固定相具有如下优点：①柱效高：传质速度比一般液体固定相快；②稳定性：耐溶剂冲洗，耐高温，无固定液流失，从而提高了色谱柱的稳定性和使用寿命；应用范围广：改变键合有机分子的结构和基团的类型，能灵活地改变分离的选择性，适用于分离几乎所有类型的化合物；且能用各种溶剂作流动相（梯度洗脱）。
二、流动相化学键合相色谱所用流动相的极性必须与固定相显著不同，根据流动相和固定相的相对极性不同分为：1、正相键合相色谱法：流动相极性小于固定相极性。
常用非极性溶剂如烷烃类溶剂，样品组分的保留值可用加入适当的有机溶剂（调节剂）的办法调节洗脱强度。
常用有机溶剂为极性溶剂如氯仿、二氯甲烷、已腈、醇类等。
适用于分离中等极性化合物，如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药等。
2、反相键合相色谱法：流动相极性大于固定相极性。
流动相多以水或无机盐缓冲液为主体，再加入一种能与水相混溶的有机溶剂（如甲醇、乙睛、四氢呋喃等）为调节，根据分离需要，改变洗脱剂的组成及含量，以调节极性和洗脱能力。
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（2）溶剂与试剂预处理
• 硅烷化试剂对水很敏感，使用前应以蒸馏方式 进行纯化或以玻璃棉将其中的悬浮物滤去。所 使用的有机溶剂，必须进行干燥。
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（3）衍生化反应
（1）Si－O－C键型
（2）Si－N或Si－C键型
（3）Si－O－Si－C键型
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1、化学键合相色谱的定义
化 学 键 合 相 色 谱 借助于化学反应的方法将有机分子以 共价键连接在色谱担体上形成化学键 合相，以化学键合相为固定相的色谱 法称为化学键合相色谱（bonded phase chromatography，BPC），简 称键合相色谱。
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2、化学键合相的特点
衍生化反应
端基封尾
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(1)硅胶的预处理
• 在制备键合相时，首先作为担体的硅胶需要酸 处理，洗去制备、运输和保存过程中引入的污 染物；除去表面层的金属氧化物杂质，如Na+、 Ca2+、Al3+、Fe3+等；使表面的硅氧烷键打开， 形成尽可能多的自由羟基，有利于反应。
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1. 与液－液分配色谱相比，使用过程中固定相 不流失，耐溶剂冲洗。 2. 与液－固吸附色谱相比，消除了担体上的表 面活性作用点，清除了某些可能的催化活性。 3. 表面改性灵活，容易获得重复性产品。 4. 化学性能稳定，耐受范围为pH2～8。 5. 热稳定性好，一般在70℃以下稳定。 • 载样量大，比硅胶约高一个数量级。 • 梯度洗脱平衡快。
+ O M Si
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4、化学键合相的分类
• 化学键合相的分类可以有不同的依据。 按键合相的表面结构：单分子键合和聚合键合；
按键合有机硅烷的官能团：极性键合相、非极
性键和相和离子交换键合相三种。
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二、制备与评价
1、化学键合相的制备 2、常见的官能团 3、常用的键合相商品牌号 4、化学键合相性能评价
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3、化学键合相的稳定性
1．在较低pH值条件下（pH<2） 键合相中Si―O―Si键易受Lewis酸等亲电试剂的进攻 而断裂：
Si O Si Si OH +
+ -
Y
Si
Y-H+
2．化学键合固定相在较高pH值条件下的稳定性（pH>9） 键合相中Si―O―Si键很容易被KOH和NaOH这一类强碱 性亲核试剂所切断： Si O Si Si OH + M+OH-
• X 通常为－Cl、－OH、－OCH3、－OC2H5等官能团； • R 通常为直链或支链烷基、芳香基，如－CH3、－C4H9、 －C8H17、－C18H37、苯基等，也可以是它们被不同的基 团取代后的衍生基团，如－(CH2)2CN、－(CH2)2NH2、 －(CH2)n－O－CH2－OH等。 中国药科大学药物色谱分析课程
③ Si－O－Si－C键型
• Si－O－Si－C键型是一类目前占绝对优势的键 合相类型，具有良好的热稳定性及化学稳定性， 能在pH 2～8的介质中使用。这类键合固定相 是硅胶上的硅羟基与有机氯硅烷或有机氧硅烷 试剂反应而得。
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单官能团有机硅烷
R Si OH + R3SiX Si O Si R + HX R
双官能团有机硅烷
• 双官能团化合物如R2SiX2可单独形成线型或环 状有机硅氧烷。
R Si OH + R2SiX2 Si O Si R + HX X
Si OH O Si OH + R2SiX2 Si O O Si O Si R R + 2HX
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三官能团有机硅烷
硅烷化试剂中三个X基团都参与硅醇基反应的 可能性很小。三官能团化合物如RSiX3反应后的 产物可水解进一步形成硅羟基，进而形成三维 交联化合物
1、化学键合相的制备
要形成化学键合固定相，有两个必要条件：
① 所用的担体材料应有某种化学反应活性， 如硅胶、氧化铝、硅藻土等表面都具有化 学反应的官能团，一般以硅胶最为理想的 和常用。
② 有机分子应含有能与担体表面发生反应的 官能团。
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1、化学键合相的制备
硅胶预处理
溶剂与试剂 预处理
最常用的封尾剂有三甲基氯硅烷（TMCS）和六甲基 乙硅氧烷（HMDS）以外，现已研制出三甲基硅咪唑 （TMSI） 中国药科大学药物色谱分析课程
X X
Si OH O Si OH + RSiX3 Si O O Si O Si X R + 2HX
Si OH + RSiX3
Si O Si R
+ HX
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• 硅烷化试剂的反应活性为：
RSiX3＞R2SiX2＞R3SiX。 • Si-O-Si-C：不水解，热稳定性好，在pH 2~8范 围内对水稳定。
基的存在会降低硅胶表面的疏水性，而对极性
化合物或溶剂产生吸附，使键合相的分离性能 改变。
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（4）端基封尾
定 义 • 用氯化三甲基硅烷等试剂与硅胶表面的残留硅 醇基反应，将残留硅醇基封锁起来的
（4）端基封尾
方 法
• 为了进一步消除残留的游离硅醇基，一般在键 合反应后再用封尾剂钝化，也可用十八烷基三 氯硅烷再键合一次。
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聚合层键合相
• 在硅胶表面与硅烷化试剂反应时加入一定量 的水，即形成聚合物，可以制备较致密的键 合层，从而更有效地掩蔽硅胶表面的硅羟基 • 但若反应控制不当，会产生过厚的聚合网， 而引起传质较慢，柱效降低
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（4）端基封尾
原 因
• 残余的硅醇基会对键合相的分离性能产生一定 影响，特别是在非极性键合相的情况下，硅醇
(1)硅胶的预处理
干燥
酸处理
酸处理可以用 0.1 mol/L的盐 酸，于90℃下 浸泡24 h，或 以10%的盐酸 在回流状态处 理8 h 。
中和 中和，水洗至 无Cl- ，经酸处 理后的硅胶表 面的羟基浓度 已达到理论值8 μmol/m2左右 。
在200℃以下真 空烘干除去物 理吸附水，注 意不得超过 200℃，否则硅 醇基脱水形成 硅氧烷结构。