9-3-化学键合相色法-极性键合相
药物色谱分析大题
色谱大题（挑了一些，留着用）气相1．简要说明气相色谱分析的基本原理答：借在两相间分配原理而使混合物中各组分分离。
气相色谱就是根据组分与固定相与流动相的亲和力不同而实现分离。
组分在固定相与流动相之间不断进行溶解、挥发（气液色谱），或吸附、解吸过程而相互分离，然后进入检测器进行检测。
2．气相色谱仪的基本设备包括哪几部分?各有什么作用?答：气路系统、进样系统、分离系统、温控系统以及检测和记录系统．气相色谱仪具有一个让载气连续运行的管路密闭的气路系统．进样系统包括进样装置和气化室．其作用是将液体或固体试样，在进入色谱柱前瞬间气化，然后快速定量地转入到色谱柱中．3．当下列参数改变时：(1)柱长缩短，(2)固定相改变，(3)流动相流速增加，(4)相比减少是否会引起分配系数的改变?为什么?答：固定相改变会引起分配系数的改变,因为分配系数只于组分的性质及固定相与流动相的性质有关.所以：（1）柱长缩短不会引起分配系数改变（2）固定相改变会引起分配系数改变（3）流动相流速增加不会引起分配系数改变（4）相比减少不会引起分配系数改变4．当下列参数改变时：(1)柱长增加，(2)固定相量增加，(3)流动相流速减小，(4)相比增大是否会引起分配比的变化?为什么?答：k=K/?，而??VM/VS，分配比除了与组分、两相的性质、柱温、柱压有关外，还与相比有关，而与流动相流速、柱长无关。
故：不变化，增加，不改变，减小。
?5．试以塔板高度H做指标,讨论气相色谱操作条件的选择.答：提示：主要从速率理论(van Deemer equation)来解释，同时考虑流速的影响，选择最佳载气流速。
（1）选择流动相最佳流速。
（2）当流速较小时，可以选择相对分子质量较大的载气（如N2,Ar)，而当流速较大时，应该选择相对分子质量较小的载气（如H2,He),同时还应该考虑载气对不同检测器的适应性。
（3）柱温不能高于固定液的最高使用温度，以免引起固定液的挥发流失。
9-3-化学键合相色法-极性键合相
药物色谱分析课程中国药科大学药物分析教研室第九章－3化学键合相色谱极性键合相色谱中国药科大学药物色谱分析课程宋敏极性键合相•概述•分离机制•固定相•流动相主要内容中国药科大学药物色谱分析课程宋敏一、概述•极性键合相(polar bonded phase)：硅胶表面键合了极性有机基团的固定相。
•常见的极性有机基团有氰基、二醇基、氨基、硝基、醚基等。
中国药科大学药物色谱分析课程宋敏组成：键型、主体基团、极性端基。
•键型：如Si-O-Si-C或Si-O-Si-N整个极性键合基团与硅胶母体直接相连的桥梁。
•主体基团：直键烃基或醚基使硅胶表面与特定的极性基团之间保持一定距离。
•极性端基：极性基团)、氰基(-CN)、二醇基(diol)、如氨基(-NH2）硝基（-NO2中国药科大学药物色谱分析课程宋敏中国药科大学药物色谱分析课程宋敏例如•以极性基团命名的商品键合相：Lichrosorb NH 2, Lichrosorb Diol •不以极性基团命名的商品键合相：Vydac polar, Bondapak Carbohydrate中国药科大学药物色谱分析课程宋敏二、分离机理•极性键合相的分离机制有两种说法：①分配作用：把硅胶表面键合的极性基团视为一层液膜，样品组分的分子在流动相与极性液膜间分配，按分配系数的差别而分离。
②吸附作用：把极性键合相视为一种弱吸附剂，样品组分的分子与固定相的极性基团发生诱导作用、氢键作用或静电作用而实现分离。
吸附系数大的组分的保留时间长。
二、分离机理作用力：主要靠范德华作用力的定向作用力、诱导作用力或氢键作用力。
例如：用氨基键合相分离极性化合物时，主要靠被分离组分的分子与键合相的氢键作用力的强弱差别而分离，如对糖类的分离等。
若分离含有芳环等可诱导极化的非极性样品，则键合相与组分分子间的作用力，主要是诱导作用力。
中国药科大学药物色谱分析课程宋敏中国药科大学药物色谱分析课程宋敏三、固定相•氨基、氰基、芳硝基、二醇基、醚基键合相可用作正相色谱。
化学键合相色法
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（2）溶剂与试剂预处理
• 硅烷化试剂对水很敏感，使用前应以蒸馏方式 进行纯化或以玻璃棉将其中的悬浮物滤去。所 使用的有机溶剂，必须进行干燥。
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（3）衍生化反应
（1）Si－O－C键型
（2）Si－N或Si－C键型
（3）Si－O－Si－C键型
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1、化学键合相色谱的定义
化 学 键 合 相 色 谱 借助于化学反应的方法将有机分子以 共价键连接在色谱担体上形成化学键 合相，以化学键合相为固定相的色谱 法称为化学键合相色谱（bonded phase chromatography，BPC），简 称键合相色谱。
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2、化学键合相的特点
衍生化反应
端基封尾
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(1)硅胶的预处理
• 在制备键合相时，首先作为担体的硅胶需要酸 处理，洗去制备、运输和保存过程中引入的污 染物；除去表面层的金属氧化物杂质，如Na+、 Ca2+、Al3+、Fe3+等；使表面的硅氧烷键打开， 形成尽可能多的自由羟基，有利于反应。
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1. 与液－液分配色谱相比，使用过程中固定相 不流失，耐溶剂冲洗。 2. 与液－固吸附色谱相比，消除了担体上的表 面活性作用点，清除了某些可能的催化活性。 3. 表面改性灵活，容易获得重复性产品。 4. 化学性能稳定，耐受范围为pH2～8。 5. 热稳定性好，一般在70℃以下稳定。 • 载样量大，比硅胶约高一个数量级。 • 梯度洗脱平衡快。
+ O M Si
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4、化学键合相的分类
高效液相色谱法习题
第12章高效液相色谱法习题（一）选择题单选题1. 在高效液相色谱中影响柱效的主要因素是( )A 涡流扩散B 分子扩散C 传质阻力D 输液压力2. 在高效液相色谱中，提高柱效能的有效途径是( )A 提高流动相流速B 采用小颗粒固定相C 提高柱温D 采用更灵敏的检测器3. 高效液相色谱法的分离效果比经典液相色谱法高，主要原因是( )A 流动相种类多B 操作仪器化C 采用高效固定相D 采用高灵敏检测器4. 在高效液相色谱中，通用型检测器是( )A 紫外检测器B 荧光检测器C 示差折光检测器D 电导检测器5. HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为( )A 柱前压力高B 流速比GC的快C 流动相黏度较小D 柱温低6．液相色谱定量分析时，要求混合物中每一个组分都出峰的是( )A 外标标准曲线法B 内标法C 面积归一化法D 外标法7．下述四种方法中最适宜分离异构体的是是( )A 吸附色谱B 反离子对色谱C 亲和色谱D 空间排阻色谱8．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离( )A 异构体B 沸点相近，官能团相同的化合物C 沸点相差大的试样D 极性变化范围宽的试样9．在HPLC中，范氏方程中对柱效影响可以忽略不计的因素是( )A 涡流扩散B 纵向扩散C 固定相传质阻力D 流动相传质阻力10．当用硅胶为基质的填料作固定相时，流动相的pH范围应为( )A 在中性区域B 5一8C 1一14D 2一811．高效液相色谱法中，常用的流动相有水、乙腈、甲醇、正己烷，其极性大小顺序为( )A 乙腈>水>甲醇>正己烷B 乙腈>甲醇 >水>正己烷C 水> 乙腈>甲醇>正己烷D 水>甲醇> 乙腈>正己烷12．高效液相色谱法中,使用高压泵主要是由于( )A 可加快流速，缩短分析时间B 高压可使分离效率显著提高C 采用了细粒度固定相所致D 采用了填充毛细管柱13．液相色谱的H-u曲线（）。
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第三节 非极性键合相色谱法 （non-polar bonded phase 四、非极性键合相色谱法的ch流动ro相m的设a计t原o则graphy）
原则 首选溶剂
多元溶剂
洗脱能力
替代溶剂
离子抑制 色谱
解释
非极性色谱首选溶剂为甲醇、乙腈、四氢呋喃， 底剂为水
由不同组别的纯溶剂与底剂（或极性调节剂）组 成，一般不同时使用两个相同组别的纯溶剂
（一）中性化合物的分析
2、改变有机溶剂的类型
流动相的洗脱强度与有机溶剂的类型有关如图：
第三节 非极性键合相色谱法 （non-polar bonded phase
chromatography）
四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则
（一）中性化合物的分析
2、改变有机溶剂的类型
一般改变有机溶剂不会影响样品的出峰顺序，但也有特例如图：
第四节 极性键合相色谱法 （polar bonded phase chromatography）
极性键合色谱相表面的基团组成：键型、主体基团和
极性端基，如图
第五节 离子交换键合相色谱法 （ion exchange chromatography,IEC）
以离子交换剂为固定相,以缓冲液为流动相,借助试样中电离组分对离子交换剂亲 和力的不同而达到分离离子型或可离子化的化合物的目的的方法
chromatography）
三、非极性键合相色谱法的流动相的基本组成
1、一元溶剂系统：一般不采用纯水系统
2、二元溶剂系统：一般采用洗脱能力较弱的水作为底剂，再加 入一定量与水相混溶的有机溶剂作为调节剂，如甲醇、乙腈， 也可考虑四氢呋喃
3、三元溶剂系统：在二元溶剂系统基础上添加四氢呋喃、三乙 胺、离子对试剂、缓冲盐、醋酸、磷酸等
化学键合相色谱法
一、原理“化学键合相色谱法”——采用化学键合相作固定相的液相色谱法。
化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体（硅胶）表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。
其分离机理为吸附和分配两种机理兼有。
对多数键合相来说，以分配机理为主。
通常，化学键合相的载体是硅胶，硅胶表面有硅醇基，≡Si–OH，它能与合适的有机化合物反应，获得各种不同性能的化学键合相。
从键合反应的性质可分为：酯化键合（≡Si-O-C）、硅氮键合（≡Si-N）和硅烷化键合（≡Si-O-Si-C）等；硅烷化键合相应用最广泛。
这种键合相是用有机氯硅烷与硅醇基发生反应：≡Si–OH + C18H37 SiCl3→ ≡Si-O–Si–C18H37 + HCl,这种固定相在pH = 2～8.5 范围内对水稳定，有机分子与载体间的结合牢固，固定相不易流失稳定性好。
十八烷基硅烷键合相（Octadecylsilane 简称ODS或C18）：是最常用的非极性键合相。
它们用于反相色谱法，在70℃以下和pH 2～8范围内可正常工作。
化学键合固定相具有如下优点：①柱效高：传质速度比一般液体固定相快；②稳定性：耐溶剂冲洗，耐高温，无固定液流失，从而提高了色谱柱的稳定性和使用寿命；应用范围广：改变键合有机分子的结构和基团的类型，能灵活地改变分离的选择性，适用于分离几乎所有类型的化合物；且能用各种溶剂作流动相（梯度洗脱）。
二、流动相化学键合相色谱所用流动相的极性必须与固定相显著不同，根据流动相和固定相的相对极性不同分为：1、正相键合相色谱法：流动相极性小于固定相极性。
常用非极性溶剂如烷烃类溶剂，样品组分的保留值可用加入适当的有机溶剂（调节剂）的办法调节洗脱强度。
常用有机溶剂为极性溶剂如氯仿、二氯甲烷、已腈、醇类等。
适用于分离中等极性化合物，如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药等。
2、反相键合相色谱法：流动相极性大于固定相极性。
流动相多以水或无机盐缓冲液为主体，再加入一种能与水相混溶的有机溶剂（如甲醇、乙睛、四氢呋喃等）为调节，根据分离需要，改变洗脱剂的组成及含量，以调节极性和洗脱能力。
18高效液相色谱法习题答案
高效液相色谱法思考题和习题1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。
相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测不同点：2．何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。
优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。
目前常用的Si-O-Si-C型键台相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。
①非极性键合相：常见如ODS键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。
3．什么叫正相色谱？什么叫反相色谱？各适用于分离哪些化合物？正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。
用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。
反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。
用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。
4．简述反相键合相色谱法的分离机制。
典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。
固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。
非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。
反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。
硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。
对于反相色谱的分离机制 目前，保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。
分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。
高效液相色谱法习题答案
第二十章 高效液相色谱法思考题和习题1． 简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。
相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测不同点：2．何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。
优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。
目前常用的Si-O-Si-C 型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。
①非极性键合相：常见如ODS 键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。
3．什么叫正相色谱？什么叫反相色谱？各适用于分离哪些化合物？正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。
用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。
反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。
用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。
4．简述反相键合相色谱法的分离机制。
典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。
固定相，常用十八烷基（ODS 或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。
非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。
反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。
硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。
对于反相色谱的分离机制两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。
分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。
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应用实例：HILIC法分离糖类化合物 ACN/H2O：70/30
固定相：Zorbax NH2 流动相：ACN：H2O
吴春宋勇敏
ACN/H2O：75/25
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四、流动相－反相色谱
• 对强极性的化合物，极性键合相也可用反相色谱
• 如用氨基柱分离糖类或多肽化合物时，用乙腈-水（高 含量的有机溶剂：乙腈60% ~ 80%）作洗脱液
• 用水溶液做流动相的极性键合相色谱：亲水相互作用 色谱法（hydrophilic interaction chromatography， HILIC）
• 极性端基：极性基团
如氨基(-NH2)、氰基(-CN)、二醇基(diol)、 硝基（-NO2）
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3
例如
• 以极性基团命名的商品键合相： (Merck) Lichrosorb NH2, Lichrosorb Diol
• 不以极性基团命名的商品键合相： (Waters) μBondapak Carbohydrate
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Waters公司： ATLANTIS HILIC
分离机制：分配＋离子交换 1. 极性待分析物在HILIC填料表面 的水层和乙腈/水流动相之间进行 分配； 2. 带电荷的极性分析物同固定相极 性官能团之间发生离子交换作用、 氢键作用力等。
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二、分离机理
作用力：定向作用力、诱导作用力或氢键作用力。
氨基键合相分离极性化合物：主要靠氢键作用力的 强弱差别而分离，如对糖类的分离等。
氨基键合相分离含有芳环等可诱导极化的非极性样 品：主要是诱导作用力。
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三、固定相
• 氨基、氰基、芳硝基、二醇基、醚基键 合相可用作正相色谱。它们主要以氢键 力与溶质相互作用，其氢键力以下列顺 序逐渐减弱： 氨基﹥氰基﹥芳硝基﹥二醇基﹥醚基
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1、氨基键合相
Si(CH2，具
有强极性。它对具有较强氢键作用力的样
品，显示强的分子间相互作用，而呈现大
的k值。
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• 氨基具有碱性，可在酸性水溶液中作为弱阴离 子交换剂，用于分离酚、羧酸、核苷酸。
公用信箱 sepucpu@
cpu20131111
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第九章－3 化学键合相色谱
极性键合相色谱
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1
极性键合相
主要内容
• 概述 • 分离机制 • 固定相 • 流动相
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一、概述
• 极性键合相(polar bonded phase)： 硅胶表面键合了极性有机基团的固定相。
• 对几何异构体或含双键数目不同的化合物（环状 宋敏化合物）具有良好的分离能中力国药。科大学药物色谱分析课程
4、二醇基键合相
• 二醇基键合相呈弱极性，可用于分 离有机酸，还可作为分离蛋白质的 凝胶过滤色谱。
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5、醚基键合相
• 醚基键合相呈弱极性，可分离形成氢键 的化合物，如酚类和硝基化合物，也可 用作分离蛋白质的凝胶过滤色谱。
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二、分离机理
• 极性键合相的分离机制有两种说法：
① 分配作用：把硅胶表面键合的极性基团视为 一层液膜，样品组分的分子在流动相与极性 液膜间分配，按分配系数的差别而分离。
② 吸附作用：把极性键合相视为一种弱吸附剂， 样品组分的分子与固定相的极性基团发生诱 导作用、氢键作用或静电作用而实现分离。 吸附系数大的组分的保留时间长。
• 氨基用作反相固定相可与糖分子中的羟基作用， 因此广泛用于单糖、双糖以及多糖的分离。
注意
氨基柱不可分析羰基的化合物
（如甾酮、还原糖等）
希夫氏碱反应
宋敏
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2、氰基键合相
氰基键合相是将氰乙硅烷基键合在硅胶上制成的。
Si(CH2)2CN
• 氰基键合相为质子接受体，具有中等极性，分离 选择与硅胶类似，但比硅胶的保留值低。
吴春宋勇敏
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四、流动相－正相色谱
流动相：弱极性溶剂＋适量极性溶剂 （烃类） （氯仿、醇、乙腈）
溶质保留规律：
① 溶质的分离是基于亲水结构的差异；
② 溶质的极性越大，保留值越大；
③ 流动相极性越大，洗脱强度越大。
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吴春宋勇敏
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• 常见的极性有机基团有氰基、二醇基、 氨基、硝基、醚基等。
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2
组成：
键型、主体基团、极性端基。
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• 键型：如Si-O-Si-C或Si-O-Si-N 整个极性键合基团与硅胶母体直接相连的桥 梁。
• 主体基团：直键烃基或醚基 使硅胶表面与特定的极性基团之间保持一定 距离。