功能基因组学及其研究方法

功能基因组学
• 概念：利用结构基因组学提供的信息，以高通量， 大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面 系统地分析全部基因的功能的学科。 • 近年来应用计算机生物信息技术，分析研究已测序 完DNA序列的生物基因组后，发现了未知功能的许多 基因，这促进了基因定位和基因表达调控的研究。 • 但目前功能基因组学的研究，还只局限于RNA水平。 今后随着蛋白质分析技术的发展，例如，高效和超 高灵敏度的双向凝胶电泳、色谱仪的出现，人们有 可能在蛋白质水平上，分析基因组中基因间的相互 作用，进而进一步地丰富和发展功能基因组学。
功能基因组学及其研究方法
一、基因组学概念
基因组 (genome) 是德国遗传学家 H. Winkler 在
1920 年将 gene （基因）和 chromosome( 染色体 ) 两 个词缩合而创造的一个新词，意思是指染色体上的全部 基因。几十年来，随着分子生物学的发展，其含义扩展 为在个体水平代表一个个体所有遗传性状的总和，在细 胞水平代表一个细胞所有不同染色体（单倍体）的总和， 在分子水平代表一个物种所有DNA分子的总和。
蛋白质组学的研究方法 双向电泳（two dimension electrophoresis,2-DE）： 蛋白质具有等电点和分子量的特异 性，将蛋白质混合物在电荷（等电聚焦， IEF）和分子量（变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳，SDS-PAGE）两个水平上进行分离。
生物质谱技术 Mass Spectrometry：
基因组学（genomics）
研究生物基因组的结构和功能的科 学，即从整体水平上来研究一个物种的 基因组的结构、功能及调控的一门科学。 1986年提出，至今20年，已经发展 成为遗传学中最重要的分支学科。
基因组学研究的最终目标
1. 2. 获得生物体全部基因组序列; 鉴定所有基因的功能;
3.
4.
明确基因之间的相互作用wk.baidu.com系;
蛋白质组学(proteomics)
• 研究细胞内蛋白质组成及其活动规律。旨 在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功 能模式,内容包括鉴定蛋白质表达、存在方 式、结构、功能和相互作用方式等。
蛋白质组学比基因组学更为复杂：DNA 线状结构与二级结构的功能差异不大， 但多肽链需折叠成一定的三维空间结 构才形成有功能的蛋白质；同一种蛋 白质经不同的加工修饰可形成不同的 功能，因此蛋白质的多样性远复杂于 基因本身。
（三）实验性研究基因功能
基因克隆 基因敲除（knock-out） 转座子插入突变 基因的超表达 反义RNA技术 RNAi
基因克隆的策略
• 基因文库—传统方法
• PCR 扩增– 后基因组时代
• 基因敲除技术（gene knockout) • 通过基因工程的方法将一个结构已知但功能 未知的基因去除，或用其他序列相近的基因 取代（又称基因敲入,基因替换），然后从整 体观察生物体，从而推测相应基因的功能。 这种人为地把生物体某一种有功能的基因完 全缺失的技术称为基因敲除技术。
主要具体内容包括以下方面 （一）鉴定DNA序列中的基因 （二）同源搜索预测基因功能 （三）实验性研究基因功能 （四）描述基因表达模式 （五）蛋白质相互作用的模式
（一）鉴定DNA序列中的基因
计算机对基因组序列(DNA序列)进行分析， 包括鉴定和描述推测的基因、非基因序列 及其功能。
根据序列分析搜寻基因
蛋白质之间相互作用研究的重要性
蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形 成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成 者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制
与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢
人类基因 组计划
结构基因组学
• 基因定位
• 基因组作图 • 测定核苷酸序列
The E.coli genome
A portion of the E.coli chromosome showing genes and operons.
A dot indicates the promoter for each gene or operon. Arrows and color indicate the direction of transcribtion: dark blue genes are transcribed left to right, light blue are transcribed right to left.Overlapping gene are shown in green.
阐明基因组的进化规律.
基因组学包括2-3个亚领域
亚领域 结构基因组学 内容 整个基因组的遗传制图、物理 制图、DNA测序； 认识、分析整个基因组所包含 的基因、非基因序列及其功能； 研究细胞内蛋白质的组成及其活 动规律。
功能基因组学
蛋白质组学
结构基因组学
结构基因组学
• 结构基因组学，顾名思义，就是研究生物基因组 结构的科学。它是基因组研究的第一阶段的工作， 建立功能基因组学的基础。其主要目标是绘制生 物的遗传图（genetic map）、物理图（physical map）、转录图（transcript map）和序列图 （sequence map）。
生物信息学(bioinformatics)
是运用计算机技术和信息技术开发新的算法和统 计方法，对生物实验数据进行分析，确定数据所 含有的生物学意义，并开发新的数据分析工具以 实现对各种信息的获取和管理的学科。
利用生物信息学能够分析从微生物、动物、植物 以及人类基因组序列测定产生的大量资料，阐明 遗传信息。 研究内容两大类：DNA 数据分析； 蛋白质数据分析。
查 找 开 放 阅 读 框 （ open reading frame, ORF） 开放阅读框都有一个起始密码子，ATG，还 要有终止密码子。 从ATG开始，然后向下游寻找终止密码子。 起始密码子和终止密码子之间的碱基数目 要能够被3整除 每一条链都有 3 种可能的阅读框， 2 条连共 计有6种可能的阅读框.
• • • •
基因替换 转座子诱变 整合突变 自杀质粒介导的缺失突变
（四）描述基因表达模式 采用DNA微点阵进行整体基因表达谱-转录组分析； 采用蛋白质或多肽微点阵、改进的双 向电泳结合飞行质谱技术分析蛋白质 表达谱--蛋白质组分析。
转录组(transcriptome):
一个细胞内的一套mRNA转录物， 包含了某一环境条件、某一生命阶段、 某一生理或病理(功能)状态下，生命 体的细胞或组织所表达的基因种类和 水平。
Liver
mRNA
cDNA Express sequence tag
Determining a gene expression pattern characteristic of liver’s function
Sequencing thausands tags cloning
基因芯片技术
信息时代的产物90年代兴起的一项前沿 生物技术 横跨： 生命科学、 物理学、 计算机科学、微电子技术 光电技术、 材料科学 等现代高科技 高度集约化 高灵敏度 大通量平行分析
通过测定样品离子的质荷比（m/z） 来进行成分和结构分析。
Ions Moleculars
蛋白质2D电泳分析 A对照；B为人的垂体瘤蛋白质2D电泳箭头示 有明显差异的蛋白质。
酵母菌双杂交系统(two hybrid-systems) ： 是利用酵母菌同一个细胞中共同表达不同蛋白质，以 鉴定蛋白质之间互作的一种分析方法。 ∵真核生物的基因表达受转录因子控制，转录因子需与启 动子区域的DNA结合并激活RNA聚合酶转录。 转录因子具有DNA结合及激活转录两功能，分别由不同 区域完成，而且将这两部分分割成两个片段后仍由互作 能装配成一个完全有功能的转录因子。 基于这一特点，设计出酵母双杂交系统。
（二）同源搜索设计基因功能
同源基因在进化中来自共同的祖先，通过核 苷酸序列或氨基酸序列的同源性比较推测基 因组内相似功能的基因。
同源基因 起源于同一个祖先，在不同的物种中结构 和功能相同或相似的基因。
同源查询的依据
有亲缘关系的物种，基因组可能存在某 种程度的相似性： 存在某些完全相同的序列； ORF演绎的氨基酸序列相似； ORF的排列相似，如等长的外显子； 模拟的多肽链的高级结构相似，等。
• 基因组测序是结构基因组学最基本的研究工作。 • 结构基因组学(structural genomics)是通过人类 基因组计划(Human Genome Project, HGP) 的实 施来完成的。
结构基因组学
• HGP的内容就是制作高分辨率的人类遗传图和物理图， 最终完成人类和其它重要模式生物全部基因组DNA序 列测定。
转录组学的研究方法－DNA芯片技术
基因表达谱类型: 1，组织、细胞表达谱 2，差异的组织、细胞表达谱 3，诱导的细胞表达谱表达谱 专用技术: 1，SAGE分析 2，生物芯片技术(基因芯片，细胞芯片， 组织芯片) 3，其它
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)
实验组
制备固相 探针
（组织，细胞） 对照组 （组织，细胞）
提取mRNA
Cy5标记
提取mRNA
Cy3标记
杂交
结果观察，信息分析
扫描图
蛋白质组(proteom)：
• 一个细胞内的全套蛋白质，反映了特 殊阶段、环境、状态下细胞或组织在 翻译水平的蛋白质的表达谱。 • 基因是遗传信息的携带者,而全部生物 功能的执行者却是蛋白质, 仅仅从基 因的角度来研究是远远不够的。
DNA序列分析 基因结构域分析，包括启动子、转录 因子结合序列、内含子、外显子、重 复序列、开放读码框架等。
同源分析和检索，包括DNA数据库、 EST数据库、STS数据库、Unigene数据 库、Swissprot数据库等。
蛋白质的数据分析 蛋白质一级结构分析： 结构特点分析，包括等电点、信号肽、 穿膜区、DNA结合序列等同源分析和检索， 包括Nr数据库、Swissprot 数据库等功能区 分析，包括Prosite、Emotif、Identify分析等。 蛋白质空间结构分析： 蛋白质晶体结构数据库检索，如PDB数 据库。蛋白质空间结构预测，如Homology 等软件分析。
DNA微列阵(DNA microarrays)是利用DNA芯 片技术，同时进行大量分子杂交，以分析比 较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突 变基因，从核酸水平分析基因表达模式。是 后基因组学研究中的重要方法之一。
基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot
Dot Blot
Macroarray
Microarray
其基本原理是将一系列的核酸片段固定在 芯片载体上作为固相靶片段（target）， 待 测的核酸片段人工标记上不同的荧光、或 同位素等作为探针（probe），一定条件下 两者杂交，根据杂交后不同的信号即可获 得靶片段的信息，进行计算机分析。
制备靶 片段
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)用于定量地、平行地分析大量的转录本。若要 知道一种组织，器官或细胞的基因表达谱，首先从组 织细胞里分离出短的诊断性Tags ，归类并克隆。测 定数千个克隆的DNA序列就可以了解代表这种组织、 器官或细胞的功能的基因表达谱。所以SAGE提供了一 种广泛应用的工具，定量地分析比较各种正常组织细 胞，各种发育状态和各种病理状态下的基因表达谱。 http://www.sagenet.org/网站搜集了大量的SAGE供研 究者检索。
• 自1990年开始实施人类基因组计划以来，在它的影 响下，迄今已完成了400多个物种的基因组DNA序列 的测定，其中包括流感嗜血杆菌、大肠杆菌、酵母、 秀丽线虫等多个病原微生物和模式生物以及人类基 因组的测序。
• 模式生物是指一类被深入研究旨在揭示特 定生命现象普遍规律的生物物种。大多数 生物学过程在长期的进化过程中是高度保 守的，因此，许多生物学过程在大多数或 所有的模式生物中都是类似的，模式生物 也因此在生物学研究中具有不可替代的重 要作用。