LC-MS原理详细讲解PPT
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LC-MS原理简介
C: MALDI 激光解吸附离子源 Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization
MALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题， 离子化过程与FBI有相似之处。 1、使用基质，但基质为固体。 2、 MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。 对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化，能量 由基质传给样品使样品一起气化并离子化。
2DLC-MS的基本原理
Why 2D LC/MS?
•可鉴定极端具有pI、疏水性、分子量的蛋白质 •适合膜蛋白 •重复性好 •容易自动化 •上样量大 •高灵敏度（溶液酶切） •可根据样品灵活配置（但最后一维一般为RP）
Then why SCX/RP/MS?
• SCX和RP的分离原理是互补 的
– SCX按荷电情况，PR按疏水 性
D: ESI离子源
Electrospray Ionization
4000v强电场中，样品溶液通过毛细管喷嘴喷出，带
电液滴被静电场吸向质谱人口，同时伴随干燥或加 热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发,液滴体积变 小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥 力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更 小的带电液滴，这一过程不断重复，使最终的液滴 非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大， 使分析物离子化，带单电荷或多电荷。 一般分析物分子量<2000Da带单电荷或双电荷 > 2000Da带多电荷
• 流动相是兼容的
– pH3，ACN/water/salt – SCX流动相中的盐可以在RP 时有效去除
• Tryptic peptides 在SCX柱上 可以有效保留 • Tryptic peptides在SCX条件 下是稳定的
液相色谱-质谱(LC-MS)联用的原理及应用课件
喷雾的离子化技术, 可产生带很多电荷 的离子,最后经计
+TOF MS: 1.84 min (57 scans) from go 10
1. 26e 1
Int act Ant ibody Spect r um
算机自动换算成单
5
质/荷比离子。
2500
3000
3500
4000
m/z, amu
BioSpec Reconstruct for +TOF MS: 1.84 min (57 scans) from go, smoothed
总离子流图:
• 在选定的质量范围内，所有离子强度的 总和对时间或扫描次数所作的图,也称TIC
图.
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质量色谱图
• 指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所 作的图.
• 利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合物 分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的方式。 当样品浓度很低时LC/MS的TIC上往往看不到峰， 此时，根据得到的分子量信息，输入M+1或 M+23等数值，观察提取离子的质量色谱图，检 验直接进样得到的信息是否在LC/MS上都能反映 出来，确定LC条件是否合适，以后进行MRM等 其他扫描方式的测定时可作为参考。
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3
Ionic
IonSpray
APCI
Analyte Polarity
GC/MS
Neutral
101
102
103
104
105
Molecular Weight
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4
现代有机和生物质谱进展
• 在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。 在此之前，质谱法通常只能测定分子量500Da以下 的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解吸 （FD）离子化技术，能够测定分子量高达 1500~2000Da的非挥发性化合物，但重复性差。20 世纪80年代初发明了快原子质谱法（FAB-MS）， 能够分析分子量达数千的多肽。
制备液相色谱技术(LC-MS)
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结束
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... ...
重复性
选择性要求
色谱柱吸附等温线
正常载荷(loading)：
色谱柱吸附等温线
超载(overloading)：
纯度（purity)、产量（throughput） 和收益（yield）（PTY）三者的关系
浓度过载和体积过载
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浓度过载和体积过载色谱示意图
什么时候使用浓度过载?
影响到馏分的纯度； 参数设置方便； 需配备MS检测器，设备费用投入较大。
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Mass-based
当使用按质量进行馏分收集时，只有当 MSD检测到色谱峰含有目标质量数，且该目 标质量数的强度超出特定的阈值时，馏分收 集才被触发。这就确保了在每次进样中只收 集含目标化合物的馏分。大部分情况下只有 一个馏分。
1. 基于时间（Time-based） 2. 基于峰（peak-based） 3. 基于质量（Mass-based）
基于时间（Time-based）
根据馏分的保留时间及其色谱峰宽， 以时间作为馏分收集器动作的指令参数。
特点：
参数设置方便，样品收益高、损失少。
色谱保留时间的不稳定会影响到馏分 的纯度和收益。
高效制备液相色谱技术
高效制备液相色谱的原理：
色谱分离原理无论是分析型色谱还是制备型色谱都是相同的 ，那就是色谱理论。
但是在理论的遵循上，制备型有时需打折扣。 这是由于两种类型的色谱最终的目的是不同的。 分析型色谱：分离度高，灵敏度高，以含量测定为目的。 制备型色谱：要求纯度、产量和收益。
LC-MS原理详细讲解PPT
如何看质谱图：
(1)确定分子离子,即确定分子量 氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是 偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇 数。与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质 量差在3~8和10~13，21~25之间均不可能，则 说明是碎片或杂质。
(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片
化学式
局限性:
(1)异构体，立体化学方面区分能力差。 (2)重复性稍差，要严格控制操作条件。所
以不能象低场NMR，IR等自己动手，须专 人操作。 (3)有离子源产生的记忆效应，污染等问题。 (4)价格稍显昂贵，操作有点复杂。
质谱仪器：
质谱仪由以下几部分组成
数据及供电系统 ┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓ 进样系统 离子源 质量分析器 检测接收器 ┗━━━━━╋━━━━━━┛ 真空系统
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
1.0
2.0
3.0
4.0
质量色谱图
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
总离子流图
准分子离子:
指与分子存在简单关系的离子，通过它可
以确定分子量.液质中最常见的准分子离子 峰是[M+H]+ 或[M-H]- . 在ESI中, 往往生成质量大于分子量的离子 如M+1,M+23,M+39,M+18......称准分子离 子,表示为:[M+H]+,[M+Na]+等
(3) 尽可能判断出分子离子。 (4) 假设和排列可能的结构归属：高质量离子
lc-ms-ms定量检测原理
lc-ms-ms定量检测原理
LC-MS-MS（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Mass Spectrometry）是一种高效液相色谱质谱检测技术。
其定量检
测原理分为前处理、色谱分离和质谱检测三个主要步骤。
1. 前处理：样品通常需要进行前处理步骤，如样品提取、富集和纯化等，以提高目标分析物的检测限和减少干扰物的影响。
2. 色谱分离：前处理后的样品通常会通过液相色谱技术进行分离。
在液相色谱柱中，样品中的不同分析物会根据其化学性质和亲合性以不同速率流动，并在色谱柱中被分离。
3. 质谱检测：分离后的化合物由色谱柱连接至质谱仪进行检测和定量。
在质谱仪中，分子离子会通过电荷分离和加速器分离进入质谱仪中的两个质量分析器之一，如四极杆（quadrupole）或飞行时间质谱仪（time-of-flight）。
通过在质谱仪中引入特
定质荷比的离子或离子对，可以选择性地检测目标分析物。
定量的原理是基于目标分析物的浓度与其在质谱检测器中产生的离子信号强度之间的关系。
通过测量目标分析物的峰面积或峰高，通过校准曲线或内标法可以确定目标分析物的浓度。
内标法通常使用一个已知浓度的化合物作为内标，通过内标的信号对目标分析物的信号进行校正，提高定量的准确性和精度。
LC-MS-MS定量检测原理可应用于多种领域，如药物代谢研究、毒理学研究和环境分析等。
它具有高灵敏度、高选择性和
较宽的线性范围，因此被广泛应用于药物研发、临床检测和环境监测等领域。
LC-MS原理以及应用PPT课件
2020/1/16
电喷雾VS大气压化学电离
• 电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成 [M＋H]+或[M-H]-离子。
• 样品流速：APCI源可从0.2到2 ml／min；而电喷雾源允许流量相对较小,一般为 0.2-1 ml／min.
• 断裂程度：APCI源的探头处于高温，热不稳定的化合物会分解. • 适用范围：电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化
位的峰；有时还可以观察到M+2，M+3。。。。；
例如：CH4 M=16
12C+1H×4=16
M 分子离子峰
13C+1H×4=17 M+1 同
12C+2H+1H×3=17 M+1 13C+2H+1H×3=18 M+2
位 素 峰
m/z RA
16
1 12
3.1 1.0
15 13 3.9
14 9.2 15 85 16 100
TMP 2
2020/1/16
质量分析器 1.四极杆质量分析器 2.飞行时间质量分析器 3.离子阱质量分析器 4.傅里叶变换质量分析器四极杆质量分析器 5.扇形磁分析器
2020/1/16
多级质量分析
通常通过由惰性气体分子，例如氮气，氩气或 氦气，碰撞所选择的分子离子来实现的。这种 通过中性分子的碰撞把能量传递给离子的过程 就是所谓的“碰撞诱导解离（CID）” 。这种 能量传递足以使分子键断裂和所选择的离子重 排 碎片离子被用于对原来的分子离子的结构判断。
71 H3C CH2 CH2 CH2 CH2
CH3
57 H3C CH2 CH2 CH2
电喷雾VS大气压化学电离
• 电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成 [M＋H]+或[M-H]-离子。
• 样品流速：APCI源可从0.2到2 ml／min；而电喷雾源允许流量相对较小,一般为 0.2-1 ml／min.
• 断裂程度：APCI源的探头处于高温，热不稳定的化合物会分解. • 适用范围：电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化
位的峰；有时还可以观察到M+2，M+3。。。。；
例如：CH4 M=16
12C+1H×4=16
M 分子离子峰
13C+1H×4=17 M+1 同
12C+2H+1H×3=17 M+1 13C+2H+1H×3=18 M+2
位 素 峰
m/z RA
16
1 12
3.1 1.0
15 13 3.9
14 9.2 15 85 16 100
TMP 2
2020/1/16
质量分析器 1.四极杆质量分析器 2.飞行时间质量分析器 3.离子阱质量分析器 4.傅里叶变换质量分析器四极杆质量分析器 5.扇形磁分析器
2020/1/16
多级质量分析
通常通过由惰性气体分子，例如氮气，氩气或 氦气，碰撞所选择的分子离子来实现的。这种 通过中性分子的碰撞把能量传递给离子的过程 就是所谓的“碰撞诱导解离（CID）” 。这种 能量传递足以使分子键断裂和所选择的离子重 排 碎片离子被用于对原来的分子离子的结构判断。
71 H3C CH2 CH2 CH2 CH2
CH3
57 H3C CH2 CH2 CH2
lc-ms的原理
lc-ms的原理
LC-MS（液相色谱-质谱联用）是一种结合了液相色谱和质谱技术的分析方法。
它的原理是将样品溶解在液相中，经过色谱柱分离，并通过质谱仪进行检测和识别。
液相色谱（LC）是一种基于分子在液相中的分配和亲和性质的分离技术。
样品溶解在移动相中，并通过固定相（色谱柱）分离成不同的组分。
这些组分通过不同的相互作用（如极性、分配系数等）在色谱柱中以不同的速率通过。
质谱（MS）则是一种基于分析样品中化合物的质荷比（mass-to-charge ratio，m/z）的技术。
在质谱仪中，样品分子通过电离过程转化为离子，然后通过加速电场、磁场和其他分子分离方法，根据其质量分离并检测。
在LC-MS联用中，液相色谱系统将分离的样品进样到质谱系统中。
质谱仪将进样的分离组分一个接一个地离子化，并对其进行分析和检测。
根据质荷比分离出的离子特征谱帮助识别化合物的组成和结构。
LC-MS联用的原理利用了液相色谱和质谱的互补性，可以很好地分析复杂的样品混合物中的化合物，并提供结构和组成信息。
它广泛应用于食品、环境、制药和生物医学等领域的化学分析和生物分析。
lc-ms原理
lc-ms原理
液相色谱质谱联用（LC-MS）是一种将液相色谱与质谱相结
合的分析技术，其原理基于两个主要的步骤：样品的分离和样品的检测与鉴定。
在LC-MS分析中，首先通过液相色谱将复杂的样品进行分离。
这一步骤基于样品组分的化学性质和物理性质，如极性、分子大小和分子结构等。
通过选择不同的分离柱和流动相组合，可以将样品中的混合物分离成不同的化合物。
分离后的化合物进入质谱仪进行检测与鉴定。
质谱仪能够将化合物的分子离子进行解离，并根据其质荷比（m/z）比值进行
分析。
质谱仪一般由离子化部分和检测部分组成，其中离子化部分可以使用不同的离子化方式，如电喷雾离子源（ESI）和
大气压化学电离源（APCI），来产生分子离子。
分子离子进
入检测器后，可以通过质荷比的比较和质量谱图的生成来鉴定和定量样品中的化合物。
LC-MS技术具有高分辨率、高灵敏度、高选择性和广泛的应
用范围等优点。
它在药物分析、环境监测、食品安全和生物医学研究等领域中发挥着重要作用。
通过优化分离条件和选择合适的质谱参数，LC-MS技术可以实现对复杂混合物的快速、
准确和可靠的分析。
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Ionic
IonSpray离子喷雾
Analyte Polarity
APCI大气压化学电离
GC/MS
Neutral 101 102
Molecular Weight
103
104
105
现代有机和生物质谱进展
在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。
在此之前，质谱法通常只能测定分子量500Da以 下的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解 吸（FD）离子化技术，能够测定分子量高达 1500~2000Da的非挥发性化合物，但重复性差。 20世纪80年代初发明了快原子质谱法（FABMS），能够分析分子量达数千的多肽。 随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂， 分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质谱法 （ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法 （MALDI-MS）应运而生。
为什么LC需要MS-MS联用而 GC不需要？
液质联用与气质联用的区别:
气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，
适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的 化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图， 可与标准谱库对比。 液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问 题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的 分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分 子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的 分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只 能自己建库或自己解析谱图。
同位素离子
由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子. 各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的
丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化 合物及碎片的元素组成有很大方便, 还可利用 稳定同位素合成标记化合物,如:氘等标记化合 物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌 上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物 结构,反应历程等
目前的有机质谱和生物质谱仪，除了GC-MS的EI和
CI源，离子化方式有大气压电离（API）（包括大气 压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压 光电离APPI）与基质辅助激光解吸电离。前者常采 用四极杆或离子阱质量分析器，统称API-MS。后者 常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器称为 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDITOF-MS）。API-MS的特点是可以和液相色谱、毛 细管电泳等分离手段联用，扩展了应用范围，包括 药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、 组合化学、有机化学的应用等；MALDI-TOF-MS的 特点是对盐和添加物的耐受能力高，且测样速度快， 操作简单。
两台质谱仪串联组装而成。即前面列出的串 列式多级质谱仪。 第二类利用了一个质谱仪时间顺序上的离子 储存能力，由具有存储离子的分析器组成， 如离子回旋共振仪（ICR）和离子阱质谱仪。 但不能进行母离子扫描或中性丢失。
实验室现有的质量分析器类型：
串联四极质谱仪(MS/MS)
：
三重四极（QqQ）
有机质谱的特点
优点:
(1)定分子量准确，其它技术无法比。 (2) 灵敏度高，常规 10 -7 — 10 -8 g, 单离子检测可
达10-12g。 (3)快速，几分甚至几秒。 (4) 便于混合物分析， LC/MS ， MS/MS 对于难 分离的混合物特别有效, 其它技术无法胜任。 (5)多功能，广泛适用于各类化合物。
高压放电发生了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]离子。 样品流速：APCI源可从0.2到2 ml／min；而电喷 雾源允许流量相对较小,一般为0.2-1 ml／min. 断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定 的化合物就足以使其分解. 灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小 分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而 APCI更适合于分析极性较小的化合物。 多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子
其中ESI，APCI，APPI统称大气压电离(API)
实验室现有的离子源:
ESI电喷雾电离源 APCI大气压化学电离源
电喷雾（ESI）的特点
通常小分子得到[M+H]+ ]+,[M+Na]+ 或[M-H]-单电荷
离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测 定质 / 荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱 仪可测定质量数十几万的生物大分子。 电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离 子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定 的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析 蛋白质和DNA等生物大分子；通过调节离子源电压 控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。
(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器 部分的真空。 只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到 达接收器，真空度不够则灵敏度低。
进样系统
把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进
样，GC，LC及接口，加热进样，参考物进样 等。
离子源
使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离
子)的装置，并对离子进行加速使其进入分析器， 根据离子化方式的不同，有机质谱中常用的有 如下几种，其中EI，ESI最常用。
正负离子模式:
一般的商品仪器中,ESI和APCI接口都有正负
离子测定模式可供选择。 根据样品的性质选择，也可两种模式同时进 行
质量分析器:
是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子
通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相 同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。
质量分析器的分类：
双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector).
碰撞的形式输送给分子离子，这个能量足以使 得处在能量亚稳态分子中的某些化学键断裂并 使一些特定的分子发生结构重排。
数据及供电系统
将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果
及控制质谱仪个部分工作。 从几伏低压到几千伏高压。
LC-MS分析条件的选择和优化
四极质谱仪(Q). 飞行时间质谱仪(TOF). 离子阱质谱仪（TRAP） 付利叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS).
┏四极+TOF（Q-TOF） 串列式多级质谱仪┫三重四极（QqQ） (MS/MS) ┗TOF+TOF
进行பைடு நூலகம்S/MS的仪器从原理上可分为两类
第一类仪器利用质谱在空间中的顺序，是由
局限性:
(1)异构体，立体化学方面区分能力差。 (2)重复性稍差，要严格控制操作条件。 (3) 有离子源产生的记忆效应，污染等问题。 (4)价格稍显昂贵，操作有点复杂。
质谱仪器：
质谱仪由以下几部分组成
数据及供电系统 ┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓ 进样系统 离子源 质量分析器 检测接收器 ┗━━━━━╋━━━━━━┛ 真空系统
总离子流图:
在选定的质量范围内，所有离子强度的
总和对时间或扫描次数所作的图,也称 TIC图.
质量色谱图
指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所
作的图. 利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合 物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的 方式。当样品浓度很低时LC/MS的TIC上往往看 不到峰，此时，根据得到的分子量信息，输入 M+1或M+23等数值，观察提取离子的质量色谱 图，检验直接进样得到的信息是否在LC/MS上 都能反映出来，确定LC条件是否合适，以后进 行MRM等其他扫描方式的测定时可作为参考。
质谱原理简介：
质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比
分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分 析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离 子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所 作的条状图就是我们常见的质谱图。
常见术语:
质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电
荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z. 峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰. 离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度. 基峰: 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的 离子峰称作基峰. 总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子； 多电荷离子；同位素离子
真空系统
质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在
高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免 发生不必要的离子 - 分子反应。所以质谱反应属 于单分子分解反应。利用这个特点，我们用液 质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子 离子，从而得到分子量。
由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵
大气压化学电离（APCI）特点
大气压化学电离也是软电离技术，只产生单电
荷峰，适合测定质量数小于 2000Da 的弱极性 的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低 水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压控 制离子的碎裂。
电喷雾与大气压化学电离的比较
电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是
离子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器
MS1 Q1
q2
MS2 Q3
QqQ仪器可以方便的改变离子的动能，因此
扫描速度快，体积小，常作为台式进入常规 实验室，缺点是质量范围及分辨率有限，不 能进行高分辨测定，只能做到单位质量分辨。 （通过高分辨能得到化合物的分子式）
在液质联机中使用的碎片化手段，能量都是以
EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离—硬电离。 CI(Chemical Ionization):化学电离—核心是质子转移。 FD(Field Desorption):场解吸—目前基本被FAB取代。 FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击—或者铯离子 (LSIMS,液体二次离子质谱 ) 。 ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离—属最软的电离 方式。适宜极性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋 白质分子多肽等) APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压 化学电离—同上，更适宜做弱极性小分子。 APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大气 压光喷雾电离—同上，更适宜做非极性分子。 MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基体辅助激光 解吸电离。通常用于飞行时间质谱和 FT-MS，特别适合蛋 白质，多肽等大分子．