黑曲霉葡萄糖淀粉酶I基因的克隆及在酵母中的表达

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PCR 扩增仪 ( Gene Amp PCR System 9600) ,PERKIN - ELMER 公司 ;高速冷冻离心机 ,日本 KUBOTA ;DNAΠRNA 定量仪 ,瑞典 Pharmacia Biotech 公司生产 ; - 70 ℃超低温冰箱 ,SANYO 公司 ; 凝胶电泳仪 ,北京六一仪器厂 。 1. 2 方法 1. 2. 1 引物设计 :根据已知的黑曲霉葡萄糖淀粉酶 I 基因序 列[3] 和表达载体 pPIC9 的多克隆位点 ,利用 DNAsis 设计一对 扩增 葡 萄 糖 淀 粉 酶 I 基 因 的 引 物 , 上 游 引 物 为 5′- TACG2 TAGCGACCTTGGATTCATGGTT - 3′,带有 SnaB Ⅰ位点 ;下游引物 为 5′- GCGGCCGCACTATAGCGAAATGGATTGAG - 3′, 带有 Not Ⅰ位点 。
Secretory Expression of GAI Gene of Aspergillus niger in Pichia pastoris
GUO De - jun1 ,LIU Zeng - shan2
(1. Food College of Heilongjiang August First Land Reclamation University ,Daqing 163319 ;2. Jilin University ,Changchun 130062 ,China)
黑曲霉葡萄糖淀粉酶 I 基因的克隆及在酵母中的表达 郭德军1 ,柳增善2
(1. 黑龙江八一农垦大学食品学院 ,黑龙江 大庆 163319 ;2. 吉林大学和平校区 ,吉林 长春 130062) 摘要 :采用 RT - PCR 技术 ,从黑曲霉的菌丝体 RNA 中扩增出葡萄糖淀粉酶 GAI 的结构基因 ,将其连接到 pPIC9 载体中 ,转入
第 15 卷第 2005 年 10
5期 月
:3
生 物 技 术 BIOTECHNOLOGY
Vol115 ,No15 :3 Oct12005
核糖体结合位点 ( RBS) ,在β2 毒素基因的 3′端有一段能形成 发卡环结构的反向重复序列 ,构成一个不依赖ρ因子的转录 终止子 。β2 基因产物编码 265 个氨基酸 ,其中 N - 末端的 30 个残基构成疏水性区域 (6～26 位残基) ,形成一跨膜区 ,这 30 个氨基酸为信号肽序列 。成熟蛋白起自 31 位的赖氨酸 (Lys) 共编码 235 个氨基酸 。β2 毒素基因与β1 毒素基因或其它已知 的产气荚膜梭菌基因序列没有明显的同源性 。免疫学实验表 明 ,抗β2 毒素的抗体能识别纯化的β2 毒素 ,并能与β1 毒素发 生弱反应 。相反 ,抗β1 毒素的抗体只能与β1 毒素反应 ,而不 能与β2 毒素发生反应 ,表明β1 毒素与β2 毒素的免疫相关性较 差 ,其机理尚不清楚 。我们现已克隆和表达了α、和β1 毒素基 因[3 - 5] ,如今又表达了β2 毒素基因 ,其表达水平占菌体总蛋白 相对含量的 13. 26 % ,为下一步研制α、β1 和β2 毒素多价基因 工程亚单位苗提供了理想基因材料 。
DNA 凝胶回收试剂盒购自北京鼎国生物公司 ;T4 DNA 连接酶 、 各种限制性内切酶 (SnaB Ⅰ、Not Ⅰ、Bgi Ⅱ) 购自 TaKaRa 公司 ,反 转录酶 AMV、Taq plus 购自 Sangon 公司 。 1. 1. 2 培养基
黑曲霉液体发酵培养基 :0. 05 % KH2 PO4 ,0. 05 % MgSO4 ,
fect of multiple copies and prefer codon on efficiency of secretory expression was also discussied in detail. etc.
Key words : Aspergillus niger ; Glucoamylase I ; Pichia pastoris ;secretory expression 黑曲霉葡萄糖淀粉酶是一种酸性糖蛋白 ,具有外切酶活 6 %玉米淀粉 ,1. 5 %玉米浆 ,pH3. 0 。LB 培养基 、YPD 培养基 、
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 实验材料
黑曲霉 T - 21 、DH5α为本室保存菌株 , Pichia pastoris 表达 系统购 自 Invitrogen 公 司 ; 总 RNA 提 取 试 剂 盒 购 自 Promega ,
MD 培养基 、MM 培养基 、BMMY 和 BMGY 培养基配方及配制方 法见 Invitrogen 公司 pPIC9 载体使用说明 。 1. 1. 3 仪器
[6 ] Henricus L , Klaasen B M ,Molkenboer J C H , et al . Detection of the alpha
- toxin gene of Clostridium perfringens in diarrhoeic piglets in the Netherlands
Abstract :Amplified gene of Glucoamylase I from total RNA of Aspergillus nigerπs mycelium by RT - PCR technology. Inserted it into pPIC9 vector . Then we transformed the recombinant plasim into Pichia pastoris GS115 by electroporation ,and got 12 strains of Muts. The activity of Glucoamy2 lase I was maximum 180UΠml in BMMY medium by methanol induction. Glucoamylase I account for 38 % of total protein in media supernate. Ef2
力的淀粉水解酶 ,从淀粉 、及其相似聚合物的非还原末端催化 水解α- 1 ,4 糖苷键和α- 1 ,6 糖苷键 ,释放β- D - 葡萄糖 。葡 萄糖淀粉酶是由多个域组成的 ,催化部位是通过 o - 糖基化链 与淀粉结合区域相连接 。在工业上 ,葡萄糖淀粉酶被广泛应 用于人造葡萄糖和果葡糖浆的生产 ,具有极高的商业价值 [1] 。 作者欲充分利用毕赤酵母菌具有较高糖基化能力 ;向细胞体 外分泌较少蛋白质 ,易提取表达产物[2] ; 生长速度比黑曲霉 快 ,易大规模工业化培养等特性 ,通过分子生物学技术 ,为在 酵母中高效分泌表达葡萄糖淀粉酶 I 探索一条新的途径 。
1. 2. 2 RT - PCR 扩增 : 第一步 ,黑曲霉保藏菌种经查氏斜面 培养基活化后 ,接种于 100ml 灭菌的黑曲霉液体发酵培养基 中 ,加少量玻璃珠 ,220rΠmin、30 ℃,培养 66 - 70h ,以其为实验材 料 ,利用总 RNA 提取试剂合提取黑曲霉的总 RNA。第二步 ,以 总 RNA 为模板 ,以下游引物进行反转录 ,获得 cDNA 第一条 链 。65 ℃热变性 5min ,冰浴 ,然后加入反转录酶 ,置于 PCR 仪
巴斯德毕赤酵母 GS115 中 ,获得 12 株 Muts 重组酵母 ;甲醇诱导目的蛋白分泌表达 ,葡萄糖淀粉酶酶活最高达 180UΠml ,占上清液 蛋白的 38 %。通过 GAI 在巴斯德毕赤酵母中的表达 ,重点讨论了目的基因拷贝数 ,基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响 。
关键词 :黑曲霉 ;葡萄糖淀粉酶 ;毕赤酵母 ;分泌表达 中图分类号 :Q786 ;Q785 文献标识码 :A 文章编号 :1004 - 311X(2005) 05 - 0003 - 03
4 生 物 技 术 第 15 卷第 5 期
的片段 。将回收产物连接到 p GEM - T 载体上 ,转化 DH5α感 受态菌 ,利用α互补法进行阳性克隆的6 - 14 ;修回日期 :2005 - 08 - 04 作者简介 :郭德军 (1968 - ) ,男 ,硕士 ,副教授 ,从事食品微生物及生物 制药的研究 ;柳增善 (1959 - ) ,男 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,从事食品 安全及生物制药的研究 。
中 ,30 ℃10min ,42 ℃1h ,94 ℃2min。再以反转录产物为底物 , PCR 扩增目的基因 ,反应条件为 :94 ℃ 3min 热变性 ;94 ℃ 30s , 54 ℃50s ,72 ℃2min ,40 个循环 ;72 ℃延伸 10min。反应结束后 , 经琼脂糖凝胶电泳 ,用 DNA 凝胶试剂盒回收大约 1. 9kb 的目
New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989. 1 - 50. [ 8 ]Meacock P A ,Cohen S N. Partitioning of bacterial plasmids during cell divi2 sion : a cis - acting locus that accomplishes stable plasmid inheritance [ J ] . Cell ,1980 ,20 (2) :529 - 542. [ 9 ]Steinporsdottir V ,Fridriksdottir V , Gunnatsson R , et al . Expression and pu2 rification of Clostridium perfringens beta - toxin glutathione S - transferase fu2 sion protein[J ] . FEMS Microbiol Letters ,1995 ,130 :273 - 278.