黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western_blot分析
葡萄及其制品中真菌毒素研究进展
葡萄及其制品中真菌毒素研究进展作者：谢汉忠，黄玉南，李君，庞荣丽，乔成奎，成昕来源：《农学学报》 2017年第12期摘要：葡萄在生产、贮藏和加工过程中，受环境条件的影响可能受到真菌的污染，进而产生不同的真菌毒素，影响葡萄及其制品的质量安全，给人类健康带来安全风险。
有关葡萄及其制品中真菌毒素的研究，多集中在欧美等葡萄产区国家，中国在这方面研究以及相关的文献报道还比较少。
笔者系统分析了污染葡萄及其制品的真菌类型、污染条件以及产生真菌毒素的种类和含量；通过真菌毒素产生环境的介绍，提出了防治真菌毒素污染的控制手段，特别是真菌毒素分子生物学的深入研究，在区分真菌毒素种类和制定真菌毒素污染的控制技术方面可有效提供技术支撑。
比较各国真菌毒素检测方法的研究，发现中国在研究水果及其制品中真菌毒素的检测方法、制定标准和真菌毒素在水果及其制品中的最大残留限量标准方面都存在不足。
最后，提出了中国开展真菌毒素在葡萄及其制品中的研究方向。
关键词：葡萄；葡萄制品；真菌毒素中图分类号：S-3 文献标志码：B 论文编号：cjas17050009Research Progress of Mycotoxins in Grapes and Its ProductsXie Hanzhong1, Huang Yunan1, Li Jun1, Pang Rongli1, Qiao Chengkui1, Cheng Xin2(1Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/ Laboratory of Quality andSafety Risk Assessment for Fruit (Zhengzhou), Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450009, Henan, China;2Center for Agri-food Quality and Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China)Abstract: Fungi are major pathogens that cause contamination during grape production, storage andtransportation. Several classes of mycotoxins produced by fungi could simultaneously contaminate grape. Inaddition to their ability to cause spoilage of grape fruit and its related products, these mycotoxins could causepotential harm to human health. Studies of mycotoxins in grapes and its products were more concentrated inthe main grape production areas such as Europe and the United States, but less in China. This papersystematically analyzed the kinds of fungus contaminating grapes and its related products, pollution conditions,mycotoxins types and pollution levels. Through the introduction of mycotoxins producing environment, itdeveloped prevention strategies and control methods for mycotoxin contamination. With advancement ofscientific research in molecular biology of mycotoxins, progress was achieved in the identification ofmycotoxins and the development of techniques in controlling mycotoxins contamination. This review found thatstandards of the maximum residue levels and determination methods of mycotoxins in fruit and its products inChina were insufficient by comparing determination methods of mycotoxins in other countries. Finally, itproposed future research direction of mycotoxins in grape and itsrelated products in China.Key words: Grape; Grape Products; Mycotoxins0 引言真菌毒素(mycotoxin)是真菌在食品、农产品或饲料中生长所产生的有毒次生代谢产物，可直接污染食品、农产品和饲料，间接污染动物产品，对人类健康构成风险，是食品安全最重要的风险因子之一。
酶工程课后问答题
酶⼯程课后问答题第⼀章绪论1.什么叫酶⼯程？酶⼯程的主要任务是什么？答：（1）酶的⽣产与应⽤技术过程称为酶⼯程。
（2）酶⼯程的主要任务是经过预先设计，通过⼈⼯操作，获得⼈们所需的酶，并通过各种⽅法使酶充分发挥其催化功能。
2.常⽤酶的活⼒单位及其定义是什么？答：常⽤酶的活⼒单位：IU和卡特（kat）IU：表⽰每分钟催化1umol的底物转化为产物的酶量为⼀个酶活⼒单位。
卡特（kat）:表⽰每1s催化1mol底物转化为产物的酶量定义为 1卡特3.液体酶的酶活⼒测定⼀般要经历哪些步骤？举例说明。
答：㈠液体酶的酶活⼒测定⼀般哟啊经过四个步骤：①根据酶催化的专⼀性，选择适宜的底物，并配制成⼀定浓度的底物溶液。
②根据酶的动⼒学性质，确定催化反应的温度、PH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。
③在⼀定的条件下，将⼀定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。
④反应到⼀定的时间，取出适量的反应液，运⽤各种⽣化检测技术，测定产物的⽣成量或底物的减少量。
㈡举例说明：如测定蛋⽩酶的活⼒时，选择蛋⽩作为底物，并配制成⼀定浓度的溶液；根据蛋⽩酶的动⼒学性质，确定溶液的温度为28℃，PH值为8.5；将底物蛋⽩液蛋⽩酶混合均匀，取出适量的反应液，测出产物的⽣成量或底物的减少量。
4、酶的⽣产⽅法有⼏种？各有何优缺点？答：酶的⽣产⽅法有三种。
㈠提取分离法：采⽤各种提取、分离、纯化技术从动物和植物的组织、器官、细胞或微⽣物中将酶提取出来，再进⾏分离纯化的技术过程。
优点：设备较简单，操作⽅便。
缺点：受⽣物资源、地理环境、⽓候条件影响，或者使⼯艺路线变得繁杂。
㈡⽣物合成法：利⽤微⽣物细胞、植物细胞或动物细胞的⽣命活动⽽获得⼈们所需酶的技术过程。
优点：⽣产周期短，酶产率较⾼，不受⽣物资源、地理环境和⽓候条件影响。
缺点：对发酵设备和⼯艺条件要求⾼㈢化学合成法：采⽤化学技术合成⼈们所需酶的技术。
优点：对认识和阐明⽣物体的⾏为和规律、设计和合成⾼效率具有重要理论意义。
黑曲霉_葡萄糖苷酶的筛选_克隆及表达
2009-06-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00423
黑曲霉β-葡萄糖苷酶的筛选、 克隆及表达*
唐德芳1, 2 裴小琼1 李晓璐1 胡 承 2 陈 军3** 吴中柳1**
1.6 bgl1基因的克隆和序列分析
将 PCR 扩增产物纯化后连接到 pMD18-T克隆载体上， 转 化到 E. coli DH5α 感受态细胞 . 筛选得到含bgl1基因的阳性克 隆， 进行酶切鉴定和送 Invitrogen公司序列测序分析. 序列已 保存在 NCBI GenBank， 收录号为FJ431207.
反向引物为 FTAR： 5'-TTAGTGAACAGTAGGCAGAGACG-3'. 第 一步反转 录 反 应 组 成 为： 1 µ L 10 mmol/L dNTP、1 µ L 2.5 µ mol oligdT Primer、 1 µ L 黑曲霉 FTA-008总 RNA及 7 µ L ddH2O； 混合物在 65 °C下处理 5 min后冷却到 4 °C； 然后加入4 µL 5×Prime ScriptTM Buffer、 0.5 µL 40 U/µL Rnase inhibitor、 0.5 µL Rtase及 5 µL ddH 2O， 混匀后在 42 °C下处理 20 min后冷却 到 4 °C. 第二步 PCR反应为50 µL体系， 其中含有5 µL 10×PCR buffer、2 µL dNTP (10 mmol/L each)、 10 µmol引物各 0.5 µL、 0.5 µL 5 U/µL TaKaRa Ex TaqTM HS和 5 µL反转录反应液 . 反应 条件： 94 °C 30 s； 58 °C 30 s； 72 °C 3 min； 30个循环. PCR产物 用1%琼脂糖凝胶电泳检测并用回收试剂盒回收约 2.5 kb片段 .
黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
表达检测其蛋 白表达形式 和活性 ， 为构建食 品级载体做准备 。
基金项 目： 国家 自然科学基金（ ｏ ０ ７ ５０ ３ ８ ２９ ） 中央高校基本 国家重点实验室 ＭＥ Ｑ Ｎ ７ ２７ ， ７ ３３ ； ３ ０ Ｋ Ｏ博士构 建 的 ｐ Ｉ９ ．Ｇ２质 粒为模 ＰＣ Ｋ １ １ ３ 科研业务费专项资金资助（ ｏ Ｋ ２ ０ ０ １ Ｊ Ｑ ０９ ２ ） Ｎ Ｙ ０ ９ ２ ， ２０ ０ ２ Ｊ Ｋ
关于黑 曲霉 Ｂ葡 萄 糖苷 酶 基 因 的研 究 报道 仍 然 较 少 ］ 一 。
本课题 将 黑 曲 霉 的 Ｂ葡 萄 糖 苷 酶 基 因 （ ｅ Ｂ ｎ ． Ｇ ｎ ａｋ登 录 号
Ｅ ２ ３ ８ ． ） 隆到 原 核表 达 载 体 ｐ Ｔ２ ａ上 ， Ｕ３７８１ 克 Ｅ ．８ 转化 Ｅ ｃｌ ． ｏ ｉ Ｂ２１ Ｄ ３ 进行 ， Ｉ （Ｅ ） 运用 Ｃ ｌ ９培养基 筛 选 阳性 克隆 ， ｅ— Ｍ 并诱 导
的是丝状真菌 ， 主要为曲霉属和木霉属 ， 而细菌 中研究较 多的 是芽孢杆菌属 Ｊ 。 研究表 明， 黑曲霉 是 Ｂ葡 萄糖 苷酶 酶活 较高 的菌株 ， 一 但
２ ０ｍ ，２ ℃ 高压蒸 汽灭 菌 １ ｎ ２ ０ｍｌ１ｍｏ ・ Ｍｇ ０ ｌ１ １ ５ｍｉ） ０ ， ｌＬ ．
Ｂ ｌ ｌ１ｎｔ ｇｎ ａｍ ｎ ｙＰ Ｒ， ｌｎｄｉｔ ｐ Ｔ２ ａｖｃ ｒ ｎ ａｓ ｒ ｄｉｔ Ｅ ｃｌＢ ２ Ｄ ３ ， ｃｅｎｄｃ ｎ ｓ ｙＣ ｌ ｇ ｆ １ ｅｇ ｅｅｆ ｇ ｅ ｔ Ｃ ｃｏｅ ｏ Ｅ －８ ｅｔ ｄｔ ｎｆ ｍｅ ｏ ．ｏ Ｌ １（ Ｅ ） ｓｒｅ ｅ ｌ ｅ ｂ ｅ ２ ｕ． ｈ ｒ ｈ ｎ ｏａ ｒ ｏ ｎ ｉ ｏ —
ｐ Ｔ２ ａ载体 ， Ｅ ．８ 转化 Ｅ ｃｌＢ２１ Ｄ ３ ，ｅ． ９培养基筛选 阳性克 隆， Ｄ Ａ测序分析 ， ．ｏ Ｉ （ Ｅ ） ｃ １ ｉ Ｍ 经 Ｎ 成功构建 ｐ Ｔ ８ ・ｇ Ｅ ２ ａＢ ｌ 达载体 。Ｓ Ｓ ２表 Ｄ— ＰＧ Ａ Ｅ显示 ， 重组菌经 ＩＴ Ｐ Ｇ诱导后表达 了 目的蛋 白 ， 其相对 分子质量 与预期 结果相符 。结果 Ｓ ＳＰ Ｇ Ｄ ．Ａ Ｅ显示蛋 白以包涵体形式表达 ， 克隆可用 ｅ ｌ ９培养基筛选 。结论 ｅＭ －
黑曲霉β-葡萄糖苷酶菌株的筛选
黑曲霉β-葡萄糖苷酶菌株的筛选胡宜亮;杜迅;刘德海;宁萌;董磊【摘要】From 17 strains of Aspergillus niger,vfe obtained five strains of A.niger by using the plate transparent circle method with oxford cup.A.niger niger-2 was selected according solid fermention experiments for enzyme production, the results showed it produced high β-glucosidase activity, higher cellulase activity (CMC) and the filter paper activity (FBA) of the strain during the same fermentation. Β-glucosidase activity reached to 78.75 U/g, cellulase activity reached to 312.15 U/g, and the filter paper activity reached to 782.6 U/g.%采用牛津杯平板透明圈法对研究室保藏的17株黑曲霉菌株进行了β-葡萄糖苷酶产生菌初筛,得到5株透明圈相对明显的菌株,经固态发酵产酶复筛及相关纤维素酶活力的检测,选出一株β-葡萄糖苷酶酶活力高、且纤维素酶活力也较高的菌株niger-2,其β-葡萄糖苷酶酶活力为78.75 U/g、纤维素酶(CMC)活力为312.15 U/g、滤纸酶活力(FBA)为782.6 U/g.【期刊名称】《河南科学》【年(卷),期】2011(029)012【总页数】4页(P1451-1454)【关键词】黑曲霉;β-葡萄糖苷酶;纤维素酶;筛选【作者】胡宜亮;杜迅;刘德海;宁萌;董磊【作者单位】河南省科学院生物研究所,郑州 450008;河南省科学院生物研究所,郑州 450008;河南省微生物工程重点实验室,郑州 450008;河南省科学院生物研究所,郑州 450008;河南省工业酶工程技术研究中心,郑州 450008;河南省科学院生物研究所,郑州 450008;河南省微生物工程重点实验室,郑州 450008;河南农业大学生命科学学院,郑州 450002【正文语种】中文【中图分类】Q556+.2β－葡萄糖苷酶分布较为广泛，存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌体内．但植物来源酶的活性远比微生物来源的β－葡萄糖苷酶低．β－葡萄糖苷酶又称β－D－葡萄糖苷葡萄糖水解酶，属纤维素酶，是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶，能够水解结合于末端非还原性的β－D－葡萄糖苷键，同时释放出β－D－葡萄糖和相应的配基[1]．β－葡萄糖苷酶能参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用．β－葡萄糖苷酶的主要作用是用于降解纤维素，在酶解纤维素时起着至关重要的作用，能协助纤维素酶降解纤维素，把纤维素酶降解生成的纤维二糖和三糖转化为可发酵的葡萄糖 [2-3]．β－葡萄糖苷酶的生物学功能使它在生产中有着广泛的应用．低活力的β－葡萄糖苷酶活性是造成纤维素酶水解纤维素资源得率低、酶用量大、成本高的关键因素之一，制约了纤维素酶的有效应用及发展．本研究针对上述生产中存在的问题，应用生物技术手段，筛选选育出高活力的产β－葡萄糖苷酶生产菌株，应用于纤维素酶的生产及应用．黑曲霉（Aspergillus niger）是公认的安全菌株，而且该菌产β－葡萄糖苷酶活力较高[4]．通过对研究室保藏的十余株黑曲霉菌株进行筛选，得出一株β－葡萄糖苷酶高产菌，经所产酶酶系分析，该菌株同时具有高活力的纤维素酶（CMC）活力和滤纸酶（FBA）活力，并对其性质做了进一步研究，以待为下一步工作打下基础，为工业化生产提供依据．1．1 材料1．1．1 出发菌株从本研究室保藏菌株中选出17株黑曲霉菌株作为出发菌株．1．1．2 培养基 1）保藏培养基：①Czapek’s 琼脂培养基：蔗糖 30．0 g，NaNO3 3．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，KC l 0．5 g，FeSO4·7H2O 0．01 g，K2HPO4 1．0 g，琼脂 15．0 g，蒸馏水 1 000 m L，p H 6．0～6．5．②马铃薯（土豆）培养基：取洗净去皮、挖去芽眼的马铃薯200 g，切成片状或丝状，加水1 000 m L，煮沸15 min，用纱布过滤，加20 g琼脂、20 g葡萄糖，再加热使其溶化，补水至体积为1 000 m L，即成马铃薯培养基．2）筛选培养基：①纤维二糖15．0 g，NaNO3 3．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，KCl 0．5 g，FeSO4·7H2O 0．01 g，K2HPO4 1．0 g，刚果红0．2 g，琼脂15．0 g，蒸馏水 1 000 m L，p H 6．0～6．5．②CMC－Na 15．0 g，NaNO3 3．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，KCl 0．5 g，FeSO4·7H2O 0．01 g，K2HPO4 1．0 g，刚果红 0．2 g，琼脂 15．0 g，蒸馏水 1 000 m L，p H6．0～6．5．3）发酵培养基：麸皮 100 g，水100 m L，pH自然．以上培养基均需 0．1 MP a，灭菌 0．5 h．1．1．3 主要仪器 T6新世纪（北京普析）；HH恒温水浴锅（江苏金坛）；HZF－A200电子天平（福州华志）；LS－B75L－Z立式蒸汽灭菌器（江阴滨江）；p H－2型酸度计；秒表．1．1．4 主要试剂乙酸（AR）；乙酸钠（AR）；水杨素（生化试剂，中国医药总公司）；3，5—二硝基水杨酸（AR）；氢氧化钠（AR）；酒石酸钾钠（AR）；亚硫酸钠（AR）；苯酚（AR）；磷酸氢二钠（AR）；柠檬酸（AR）；羧甲基纤维素钠（AR）；无水葡萄糖（AR）．1．2 方法1．2．1 筛选方法1）初筛：为防止黑曲霉随着菌丝孢子蔓延影响到透明圈观察，采用牛津杯平板透明圈法．具体做法是预先制备纤维二糖的筛选培养基琼脂平板，每个平板内相距一定间隔制成同等大小的孔穴放置牛津杯，试管斜面菌株用无菌水制成菌悬液，吸取1~2滴分别涂布于初筛培养基平板上牛津杯内，28～30℃培养3~4 d．观察生长的单菌落周围产生的透明圈大小，依此初步判断菌株产β－葡聚糖苷酶活力的能力，根据酶水解底物所产生的扩散圈大小比较菌株产酶能力．2）复筛：从初筛平板中选取菌株周围透明圈较大的单菌落转接到试管保藏培养基中培养，然后再接入固体发酵培养基进行复筛．将初筛菌株孢子挑取2～3环，接入固体培养基中，每500 m L三角瓶装入50 g固体培养基（湿基），28～30℃培养36 h，进行酶活力检测，以筛选出酶活力最高的菌株．同样操作方法，筛选纤维素酶产生菌株．1．2．2 β－葡萄糖苷酶的检测方法[5]1）标准曲线的绘制：分别吸取 0．1%标准葡萄糖溶液0．0，0．2，0．4，0．6，0．8，1．0，1．2，1．5 m L 分别于1，2，3，4，5，6，7，8 号比色管中，加蒸馏水将每支试管至 2 m L．再加入3．0 m L3，5－二硝基水杨酸显色液，煮沸5 min．冷却后，加蒸馏水至25 m L，摇匀后用分光光度计，在530 nm波长下比色，以1号管为对照，记录各管的光密度值．以光密度值作纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含量的毫克数为横坐标，绘制标准曲线．2）测定方法：①样品测定：取一只小试管（15 mm×150 mm），加1%水杨素溶液1．0 m L，于50°C水浴中预热 2～3 min，加适当稀释酶液 1．0 m L，50 °C 保温 30 min，取出立即加入 3，5－二硝基水杨酸 3．0 m L，沸水浴煮沸5 min，冷却后定容至25 m L，用分光光度计530 nm处比色测定OD 值．②空白测定：另取小试管加水杨素溶液 1．0 m L，先加入 3．0 m L3，5－二硝基水杨酸，再加适当稀释酶液 1．0 m L，50 °C 保温 30 min，沸水浴煮沸5 min，冷却后定容至25 m L，用分光光度计530 nm处比色测定OD值．由光密度值在标准曲线上查出葡萄糖质量（mg），并计算出酶活力．3）β－葡萄糖苷酶酶活力定义：50°C及p H4．8条件下水解1 h催化底物水解生成1 mg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位（μ）．1．2．3 CMC酶活力的测定（3，5－二硝基水杨酸比色法）[6]1）标准曲线的绘制：精确称取分析纯的无水葡萄糖 250．00 mg，溶于蒸馏水中，定容至 250 mL 容量瓶中，即葡萄糖含量为 1 mg/m L．吸取此液 0．0，2．0，4．0，6．0，8．0，10．0 m L，分别定容至 50 m L．分别吸取 2．5 m L 上述溶液分别于 1，2，3，4，5，6 号试管中，再各加 2．5 m L 3，5－二硝基水杨酸，煮沸5 min．冷却后，用分光光度计，以1号管作对照在530 nm波长下比色，记录各管的光密度值．以光密度值做纵坐标，2．5 m L糖溶液中含糖毫克数做横坐标，绘制标准曲线（糖液分别含糖 0．0，0．1，0．2，0．3，0．4，0．5 mg）．2）测定方法：①样品测定：取一只小试管（15 mm×150 mm），加羧甲基纤维素钠 2．0 m L，于50 °C 水浴中预热 2～3 min，加适当稀释酶液 0．5 m L，50 °C 保温 30 min，取出立即加入3，5－二硝基水杨酸2．5 m L，沸水浴煮沸5 min，用分光光度计530处比色测定OD值．②空白测定：另取小试管加羧甲基纤维素钠2．0 m L，先加入2．5 m L 3，5－二硝基水杨酸，再加适当稀释酶液0．5 m L，50°C保温30 min，沸水浴煮沸5 min，用分光光度计530处比色测定OD值．由光密度值在标准曲线上查出葡萄糖量（mg），并计算出酶活力．3）CMC酶活力定义：1 g固体酶粉（或1 m L酶液），在 p H 为 5．0，50°C条件下，30 min内水解羧甲基纤维素钠生成1 mg葡萄糖的酶量，称为1个纤维素酶（CMC酶）活力单位．1．2．4 滤纸酶活力的测定（3，5－二硝基水杨酸比色法）[6] 取4．0 m L酶液和醋酸－醋酸钠缓冲液1．0 m L于小试管中，加入1 cm×3 cm新华滤纸1条，滴入甲苯2～3滴防腐，保温40°C静止反应24 h，取出观察滤纸崩溃现象．同时做一个不加酶液的空白对照．其滤纸酶酶活力的标准曲线的绘制及测定同CMC酶活力的测定．滤纸酶酶活力表示方法：1 g酶粉或1 m L酶液，在p H4．6，温度40°C条件下，24 h能水解新华滤纸生成1 mg葡萄糖的酶量，称为1个滤纸酶（FB A酶）活力单位．2．1 初筛结果以17株黑曲霉菌株作为出发菌株，通过筛选培养基，由发酵环透明圈法初筛出具有明显透明圈的菌株5 株，分别为niger－2、niger－5、niger－6、niger－12、niger－16，其中niger－2 透明圈图像见图1（平板反面）、图2（平板正面）．2．2 β－葡萄糖苷酶酶活力测定吸光度标准曲线按照β－葡萄糖苷酶酶活力测定方法对葡萄糖吸光度（OD）做标准曲线，如图3所示．2．3 纤维素酶（CMC）酶活力测定吸光度标准曲线按照纤维素酶（CMC）酶活力测定方法制作葡萄糖吸光度（OD）标准曲线，如图4所示．2．4 滤纸酶活力测定吸光度标准曲线按照滤纸酶活力测定方法制作葡萄糖吸光度标准曲线．葡萄糖吸光度标准曲线制作同CMC酶活力（图4）．2．5 五株黑曲霉菌株发酵产酶检测结果将初筛出的 5 株菌株 niger－2、niger－5、niger－6、niger－12、niger－16，分别编号菌株 1 号、2 号、3 号、4 号、5号进行固态发酵产β－葡萄糖苷酶的复筛试验，同时并对发酵产品进行纤维素（CMC）酶活力、滤纸酶活力检测，以便对3种酶活力进行比较，选育出适宜的菌株．从表1可以看出，β－葡萄糖苷酶酶活力1号＞3号＞2号＞4号＞5号．从表2可以看出，CMC酶活力2号＞3号＞1号＞5号＞4号．从表3可以看出，滤纸酶活力4号＞1号＞2号＞3号＞5号．从表4可以看出，滤纸被酶分解崩溃的程度4号＞1号＞2号＞3号＞5号．这与滤纸酶活力的高低呈正相关．从表1～表4检测观察结果可以得出，1号β－葡萄糖苷酶酶活力最大；滤纸酶活力仅次于4号，且相差不大；CMC酶活力略小于2号、3号酶活力．从研究目标筛选β－葡萄糖苷酶高产菌株出发，故选择1号菌株即niger－2进行进一步选育研究．经过牛津杯平板透明圈法初筛、固态发酵复筛试验并对相关酶酶活力进行了分析，初步筛选选育出一株β－葡萄糖苷酶酶活力高、且其它纤维素酶活力也较高的菌株niger－2，其β－葡萄糖苷酶酶活力为 78．75 U/g，CMC 酶活力为 312．15U/g，滤纸酶活力为782．6 U/g，作为备选菌株，为下一步选育出更高β－葡萄糖苷酶菌株打下基础．【相关文献】［1］王华夫，游小青．茶叶中β－葡萄糖苷酶活性的测定［J］．中国茶叶，1996（3）：16－17．［2］周晓云．酶技术［M］．北京：石油工业出版社，1995．［3］陈驹声．酶制剂生产技术［M］．北京：化学工业出版社，1994．［4］刘小杰，何国庆，陈启和，等．黑曲霉β－葡萄糖苷酶发酵培养基的优化［J］．中国食品学报，2006，6（2）：6－10．［5］ Karaffa L，Fekete E，Gamaufc，et al．D－g alactose i nduces c ellulase g ene e xpression in h ypocrea jecorina at l ow g rowth r ates［J］．Microbiology，2006，152（6）：1507－1514．［6］刘德海，杨玉华，李新杰，等．纤维素酶酶活力的测定方法［J］．中国饲料，2002（17）：27-28．。
黑曲霉中国株(3.758)葡萄糖氧化酶(GOD)基因的克隆与结构分析
摘要 ［ 目的 ］ 充分 开发 黑 曲霉 在轻 工 业 中的 用途 。方 法 ］ 为 ［ 以黑 曲霉 中 国株 （． ８基 因组 Ｄ Ａ为模 板 ， Ｌ ａ Ｎ ３５） ７ Ｎ 用 ＡＴｑＤ Ａ聚 合酶 对 葡 萄糖 氧化 酶 （ Ｏ 基 因进 行 Ｐ Ｒ扩 增 ， 增 片段 纯化 后 与 ｐ Ｃ Ｔ载 体 连接 后 ， 化 到 大肠 杆 菌 Ｄ ５ｔ 受 态 细胞 ， 琼脂 糖 凝胶 Ｇ Ｄ） Ｃ 扩 Ｕ ｍ－ 转 Ｈ ｃ感 经 电泳 法、 酶切 和 Ｐ Ｒ鉴 定获 得 阳性 克 隆。 获得 含 Ｇ Ｄ基 因的 克隆进 行 测序 ， Ｃ 对 Ｏ 分析 其 蛋 白质氨 基 酸序 列及 限制 性 内切 酶 的 图谱 。 结 ［ 果 ］ Ｐ Ｒ扩增 获得 约 １ ｂ的 片段 。 得 的 Ｇ Ｄ基 因编 码 序 列 共 １ １ ｐ与 报 道 的 黑 曲霉 （ Ｔ Ｃ ０ ９Ｇ Ｄ基 因序 列仅 有 ３个 经 Ｃ ．ｋ ８ 获 Ｏ ８ ， ８ ｂ Ａ Ｃ ９ ２ ）Ｏ 碱基 之 差 。 该基 因序 列具 有 多 个限制 性 内切 酶 位点 。 曲霉 不 同菌株 与 中国株 （． ８ Ｇ Ｄ基 因 的 同源性 比较 表 明 ， 同黑 曲霉 菌株 黑 ３ ５ ）Ｏ ７ 不 中 Ｇ Ｄ基 因 不同 ， 菌株 Ａ Ｃ ９ ２ 菌株 Ｎ Ｒ － 同一 菌株 。结论 ］ 研 究获 得 了 Ｇ Ｄ基 因的全 长 序 列 ， Ｇ Ｄ的 生物 工程 Ｏ 而 Ｔ Ｃ ０９与 Ｒ Ｌ３是 ［ 该 Ｏ 为 Ｏ
Ｅ ｃ ｅ ｗｈｉ ｏｉ Ｔ ｂａｎｅ ｏ ｉｉｅｃｏ ｅｗａ ｄ ｎｔ ｅ ｙａ ａｏ ｅｇ ｌｅｅ ｔｏ ｈ ｒ ｓｓ ｅ ｚ ｍｅｄｉｅ ｔ ｎ ａ ｄ ＰＣＲ． ｅｏ ｔｉ ｄ ｃｏ ｅｗｉ ｓ ｈ ｒ ａｃ ｌ． ｈｅｏ ｔｉ ｄ ｐ ｓｔ ｌｎ ｓｉ ｅ ｉ ｄ ｂ ｇ ｒ ｓ ｅ ｌｃｒ ｐ ｏ ｅ ｉ． ｎ ｙ ｇ ｓｉ ｎ ｖ ｉ ｆ ｏ Ｔｈ ｂａｎｅ ｌｎ ｔ ｈ
菌种报告-黑曲霉
菌种报告—黑曲霉一、黑曲霉简介①、黑曲霉（Aspergillus niger）属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等，是重要的发酵工业菌种。
②、培养温度23～28℃，好氧二、使用注意事项①、是四类病原微生物，即在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。
但由于生长快速，极易通过空气扩散污染环境，对产品的生产检验人员与环境构成威胁。
故操作过程要在阳性室生物安全柜中进行。
②、所有的培养物、储存物及其它的废物在释放前，均应121℃，30min湿热蒸汽灭菌。
实验结束后，用0.1%的新洁尔灭擦拭台面，照紫外消毒。
菌种保存方案—黑曲霉（Aspergillus niger）1、实验材料：器具：-80℃冰箱，2～8℃冰箱，试管，电动助吸器，锥形瓶，恒温培养摇床，1ml移液管，10ml移液管，冷冻管，振荡器，棉塞，接种环，250ml盐水瓶，500ml 盐水瓶试剂：冻干菌种，改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基，TSA平板，SDA平板，20%甘油，含0.05%（v/v）聚山梨酯80的生理盐水2、实验步骤：2.1 菌种复苏和复壮（改良马丁培养基）2.1.1 将干菌种（0代）按上述步骤转移到装有100ml改良马丁液体培养基的锥形瓶中复苏（第1代），23～28℃摇床震荡培养5天。
2.1.2 用接种环挑起活化后的孢子悬液，划线到改良马丁琼脂斜面复壮，接种10支试管（第2代），23～28℃静置培养5～7天。
2.1.3 向每支试管中加入5ml含0.05%（v/v）聚山梨酯80的生理盐水，反复吹打洗脱孢子。
将孢子悬液全部转移至250ml盐水瓶中，2～8℃冻存备用。
2.2 稀释倍数探索2.2.1 取1ml孢子悬液加入9ml生理盐水中，混匀得10-1管，同法依次稀释至10-6。
2.2.2 取10-3～10-6梯度稀释孢子悬液，1ml涂布SDA平板，各做3个平行。
黑曲霉果胶裂解酶基因的克隆与原核表达
Ｃｌ ｏ ｎｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ Ｐｒ ｏ ｋａ ｒ ｙ ｏｔ ｉ ｃ Ｅｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｐｅ ｃ ｔ ｉ ｎ Ｌｙ ａ ｓ ｅ Ｇｅ ｎ ｅ ｆ ｒ ｏ ｍ Ａｓ ｐｅ ｒ ｇｉ ｌ ｌ ｕｓ ｎｉ ｇｅ ｒ
ｆ ｒ ａ ｇｍ ｅ ｎ ｔ ｗａ ｓ １ ４ ３ １ ｂｐ ｉ ｎ ｌ ｅ ｎ ｇｔ ｈ， ｗ ｈｉ ｃ ｈ ｓ ｈａ ｒ ｅ ｄ ９ ９ ｉ ｄｅ ｎｔ ｉ ｔ ｙ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｋ ｎｏ ｗｎ ＰＬ ｇ ｅ ｎｅ （ ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ
ｃ ｉ ｆ ｉ ｃ ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ｐ ａ ｉ ｒ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｄ ｅ ｓ ｉ ｇ ｎｅ ｄ ｔ ａ ｒ ｇｅ ｔ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈｅ ｃ ｏ ｎｓ ｅ ｒ ｖ ｅ ｄ ｒ ｅ ｇｉ ｏ ｎｓ ， ａ ｎｄ ｔ ｈｅ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｕｒ ｅ ｇｅ ｎｅ ｅ ｎｃ ｏ ｄｉ ｎ ｇ
一
９ ９ 。表 达产 物经 １ ２ Ｓ Ｄ Ｓ—Ｐ ＡＧ Ｅ 电泳 ， 得 到 了一 条 大 小约 为 ５ ０ ｋ Ｄ 的条 带 ， 与 预期 分 子 量相 符， 证 明真 菌 Ｐ Ｌ基 因在 Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｂ Ｌ ２ １中可 以有效表 达 。 关键 词 ：黑曲霉 ；果胶 裂 解酶 ；重 组 Ｐ Ｃ Ｒ；原核 表达
谢 茂 芳 ， 薛保 国 ， 吴 坤。
（ １ ． 河南省农业科学 院， 河 南 郑州 ４ ５ ０ ０ ０ ２ ；２ ． 河 南农 业 大 学 ， 河南 郑州 ４ ５ ０ ０ ０ ２ ）
摘要 ： 根 据 ＮＣ Ｂ Ｉ 上果胶 裂 解酶 （ Ｐ Ｌ ） 基 因在 黑 曲霉基 因组 上 的 分布 特 点设 计 特 异 引物 ， 通 过 重 组
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收稿日期:2008-12-25基金项目:内蒙古自治区优秀学科带头人计划项目(20050802)作者简介:安玉麟(1954-),男,内蒙古土默特右旗人,研究员,硕士生导师,主要从事作物栽培、育种研究工作。
黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western 2blot 分析安玉麟1,孙瑞芬1,张鹤龄2,郭树春1,闫素丽3(1.内蒙古农牧业科学院生物技术中心,内蒙古呼和浩特 010031;2.内蒙古大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特 010021;3.内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特 010019) 摘要:为进一步研究黑曲酶中国株3.758葡萄糖氧化酶(G OD )在大肠杆菌中的表达水平和条件,将黑曲霉中国株3.758的葡萄糖氧化酶(G OD )基因定向克隆于原核表达载体pET 211a 上,构建了融合表达的重组质粒pET/G O ,转化E.coli BL21(DE3)plysS ,用IPTG 诱导,超声波粉碎细菌细胞,S DS 2PAGE 电泳检测,G OD 基因获得了表达,表达的融合蛋白相对分子质量为66.5kDa 。
用市售葡萄糖氧化酶免疫家兔获得抗血清,酶联法(E LIS A )测定其效价为106,West 2ern 2blot 分析证明表达的融合蛋白与兔抗G OD 血清有较强的特异性,为黑曲霉3.758葡萄糖氧化酶(G OD )抗体的制备奠定了基础。
关键词:黑曲霉3.758;葡萄糖氧化酶基因;融合表达;抗血清;E LIS A ;Western 2blot 中图分类号:T Q920.1 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2009)04-0084-04Prokaryotic Expression and Western 2blot Analysis of G lucose OxidaseG ene from Aspergillus nigerAN Y u 2lin 1,S UN Rui 2fen 1,ZHANG He 2ling 2,G UO Shu 2chun 1,Y AN Su 2li 3(1.Biotechnology Research Center ,Inner M ong olia Academy of Agriculture and Husbundary Sciences ,Huhhot 010031,China ;2.C ollege of Life Science ,Inner M ong olia University ,Huhhot 010021,China ;3.Agricultural C ollege of Inner M ong olia Agricultural University ,Huhhot 010019,China )Abstract :In order to further study expressed level and condition of G lucose oxidase (G OD )from Aspergillus niger 31758in E.coli ,the coding region of G OD from A.niger 3.758was inserted into the prokary otic expression vector pET 211a ,and the recombinant plasmid was trans formed into E.coli BL21(DE3)plysS.The result of S DS 2PAGE showed that the G OD gene was expressed by IPTG induction ,and the m olecular weight of the fusion protein was about 66.5kDa.An 2tiserum was produced in rabbit immunized with commercial G OD ,and E LIS A analysis proved that the titer of this antibody was 106.The Western 2blotting result confirmed that the antibody reacted specifically to the expressed fusion protein.The study established basis for preparation of G OD antibody from Aspergillus niger 3.758.K ey w ords :Aspergillus niger 3.758;G lucose oxidase gene ;Fusion expression ;Antiserum ;E LIS A ;Western 2blot 葡萄糖氧化酶(β2D 2glucose :oxygen 12oxidoreduc 2tase EC1.1.3.4,简称G OD ),催化β2D 葡萄糖氧化生成δ2葡萄糖酸酯和O 2,O 2被还原生成H 2O 2(β2D 2glu 2cose +O 2→glucose 2δ2lactone +H 2O 2)[1]。
G OD 的活性最早是1928年由Muller 在黑曲霉的抽提物中发现的,后来在黑曲霉[2,3]和青霉[4]中都纯化到了G OD 。
现已从几种微生物中得到了G OD ,但从黑曲霉中得到的G OD 活性最强。
目前G OD 已在临床检测、食品工业、生物传感器、有机酸生产及抗真菌病转基因研究等方面得到广泛应用[5],而且编码G OD 的基因已从不同的真菌菌株中分离、克隆。
Frederick 等[1]和Whittington 等[6]将来自黑曲霉的G OD 基因成功地重组到酵母中,获得了具有生物活性的酿酒酵母G OD 。
Witt 等[7]等在大肠杆菌中表达了青霉G OD 。
国内周亚凤等[8]也在酵母中高效表达了黑曲霉G OD 。
母敬郁等[9]利用高表达分泌纤维素酶的真菌华北农学报・2009,24(4):84287瑞氏木酶表达了重组的黑曲霉G OD。
本试验将押辉远[10]从黑曲酶中国株3.758中克隆的G OD基因连接到原核表达载体中并实现了在大肠杆菌中的表达,为进一步研究黑曲酶中国株31758G OD在大肠杆菌中的表达水平和条件及抗血清的制备奠定了基础。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒 表达载体pET211a购自德国N ovagen公司,E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞购自清华大学北京天为时代科技有限公司,克隆有G OD基因的重组质粒pMD/G O由内蒙古大学张鹤龄教授惠赠。
1.1.2 酶及主要试剂 限制性内切酶Hin dⅢ(Promega产品)、Bam H I(Fermentas产品);T4DNA Ligase、Mini plasmid DNA kit、DNA MakerⅢ(清华大学北京天为时代科技有限公司产品);E.Z.N.A(R)G el Extraction K it(美国Omega Bio2tek产品);Am p、IPTG X2gal、LA Taq DNA Ploymerase、λDNA/Hin dⅢMaker、低分子量蛋白Maker(T aK aRa公司产品);超速高灵敏度蛋白质电泳快速染液(南京博尔迪生物科技有限公司产品);BAS、T ween20(购自上海生物工程技术服务有限公司);葡萄糖氧化酶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma公司产品);山羊抗兔IgG2AP、NBT/BCIP染色kit、pNpp(华美公司),其他试剂均为进口或国内分析纯。
1.2 方法1.2.1 引物 引物1,2按文献[11],由北京华大中生科技发展有限公司合成。
1.2.2 G OD基因与表达载体的连接 用Bam H I/ Hin dⅢ双酶切重组质粒pMD/G O和表达载体pET2 11a,得到目的基因小片段和载体大片段,分别回收纯化,回收试剂盒为E.Z.N.A(R)G el Extraction K it,方法按产品使用说明进行。
用T4DNA Ligase将目的片段与载体片段连接。
1.2.3 E.coli感受态细胞的转化 用连接产物转化 E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞,转化方法按产品说明书进行。
筛选培养基中添加Am p、IPTG、X2 gal,同时分别用pET211a空载体和水作对照,在Am p 的平板上筛选阳性重组子。
1.2.4 重组子的鉴定与序列测定 将转化所得白色单菌落,用K ieser法[12]筛选重组质粒,琼脂糖凝胶电泳检测,选取落后于空质粒的单菌落,用快速PCR的方法扩增目的片段。
PCR扩增反应条件为94℃预变性5min,94℃变性30s,63℃退火30s, 72℃延伸3min,30次循环,72℃保温10min;碱裂解法小量提取质粒,用Bam H I/Hin dⅢ双酶切鉴定重组质粒,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
随机选取一个重组质粒送到大连宝生物公司测序,鉴定所插入的序列及其读码是否正确。
1.2.5 G OD基因的诱导与表达 挑取测序正确的阳性克隆,接种于10m L含Am p100mg/L的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
用含Am p100 mg/L的LB液体培养基,以1∶50稀释进行扩大培养,培养至OD600分别为0.6和1.0时,加入诱导剂IPTG使其终浓度分别为0.5mm ol/L和1mm ol/L, 37℃诱导培养2,4,6h,同时以未诱导的重组菌pET/G O培养物及诱导4h的pET211a空载体的诱导培养物作为阴性对照。
1.2.6 细胞内总蛋白质的制备及S DS2PAGE电泳检测表达蛋白 分别取以上未诱导、诱导及只含pET211a空载体的细菌培养物进行细胞内总蛋白质的制备。
制备过程为:将1m L细菌培养物12000 r/min离心2min,弃上清,用灭菌的滤纸条吸干管壁液体。
加100μL冰预冷的50mm ol/L T ris2HCl振荡悬浮菌体,0℃,12000r/min离心1min,弃上清,用灭菌的滤纸条吸干管壁液体。
加50μL ddH2O,菌体分散后,立即加入50μL2×S DS上样缓冲液悬浮沉淀,振荡20s,沸水浴中煮5min,快速冰浴2min以上,超声波粉碎5min,12000r/min离心10min,取上清液5μL进行分离胶7.5%,浓缩胶5%的S DS2 PAGE电泳[13],电泳条件:浓缩胶18mA,分离胶25 mA,同时以黑曲霉葡萄糖氧化酶(G OD)为阳性对照(CK+)。