(整理)分子生物学研究方法.

一．名词解释

IP（免疫沉淀、免疫印迹）：

是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。这个实验是用特异性抗体结合细胞裂解液中的目的蛋白，洗涤后解离特异性抗体和目的蛋白质，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），最后用Western blot分析目的蛋白质。这种方法可以分析溶液中的、细胞内的、结合在细胞膜上的蛋白质或者受体，但只能是定性或者半定量的实验。NLS（核定位序列）：

核定位信号是另一种形式的信号肽, 可位于多肽序列的任何部分。一般含有4～8个氨基酸, 且没有专一性, 作用是帮助亲核蛋白进入细胞核。可分为单一型NLS和双分型NLS。单一型NLS，由一段连续的碱性氨基酸序列排列而成（RKKKRKV），双分型NLS，有两段碱性氨基酸被中间10~12GE 非特异性氨基酸所分割而形成，（KRPAA TKKAGQAKKKKLDK）。SUMO（small ubiquitin-related modifier）：

是一种小的泛素相关修饰蛋白，它与泛素在序列上虽只有18%相同，但在二级结构和三级结构上有惊人的相似。SUMO家族成员都有独特的N端氨基酸序列和C端外延序列。SUMO 化（sumoylation）的功能与泛素化（ubiquitination）不同，它并不是蛋白降解，反而加强它们的稳定性或调解它们在细胞内的定位和分布，甚至与凋亡相关。

二．问答题

1.什么是近交系小鼠，它们有什么特征？有哪些常见的近交系小鼠？

答：

近交系小鼠：

是经连续20代（或以上）的全同胞兄妹交配（或亲代与子代交配）培育而成的小鼠，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。

特性：

①基因位点的纯合性（Homozygosity）

近交系小鼠中任何一个基因位点上纯合子的概率高达99％，因而也能繁殖出完全一致的纯合子后代。

②遗传组成的同源性（Isogenicity）

品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先，个体在遗传上是同源的，基因型完全一致。

③表型的一致性（Uniformity）

由于基因型的一致，近交系个体的表型也是相同的，在实验中用较少的近交系动物就可获得具有统计意义的结果。

④对外界因素的敏感性（Sensitivity）

由于近交系某些生理功能的稳定性降低，对外界环境因素变化的反应更为敏感，这使近交系更容易被制备成疾病模型动物。供研究使用。

⑤遗传特征的可辨性（Identifiability）

每个近交系都有自己的标准遗传概貌，选择适当的遗传监测方法，即可分辨各个近交系。

⑥遗传组成的独特性（Individuality）

每个近交系都具有独特的遗传组成和独特的生物学特性。由于这一特点，采用某近交系所作的实验结果往往不直接代表整个种属的反应，而必须在多个近交系作动物实验，以增加其代表性。

⑦分布的广泛性（Extensity）

同一品系在不同地区不同国家都广泛存在，引种方便并利于研究结果的交流。

⑧背景资料的可查性（Accessibility）

具有一份完整的研究背景资料，便于实验设计和结果分析。

国内外常用近交系小鼠：

①BALB/c系：乳腺癌发病率低，与其他品系相比血压较高，对慢性肺炎敏感，对放射线特别敏感，繁殖期长。

②C57BL系：毛色黑色（隐性），乳腺癌发病率低，对化学致癌剂不敏感，全身照射后淋巴瘤发病率99～100％，干扰素产量高。

③129sv 系：毛色agouti 棕褐色（显性）

④FVB 系：毛色白化

⑤我国培育的小鼠近交系

1946年，我国从印度Haggkine研究所引入小鼠，这是当今广泛应用的昆明种小鼠的原种。

2.简述C.elegans作为模式生物被用于研究生命科学的基本问题的优点及其局限性。（10）答：

优点：

（1）经济以德，便于实验室培养

（2）繁殖速度快

（3）全身透明，可清楚直观的观察发育过程

（4）雌雄同体的生活史类型，可以产生大量的“自交后代”

（5）雄性个体可用于杂交（遗传交配）

（6）加入甘油作为防冻介质，线虫可长期保存于—80℃/液氮中

（7）19000个基因，基因冗余少

（8）复杂程度低，但具有组织和器官的分化

（9）基因组已经完全测序

（10）相关信息和资源丰富

局限性（不足）：

（1）生物化学研究困难

（2）至今仍没有线虫相关的可用细胞系

（3）特殊组织解剖分析困难

3.什么叫免疫共沉淀。（10）

答：

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：

是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。。

其优点为：

（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复

合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

实验流程为：

（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清；

（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；

（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C 缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；

（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；

（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。

三、简述题

1.C-elegans两种转基因技术？该技术可用于解决什么问题？

答：

两种转基因技术：

（1）显微注射法转基因

该方法是将外源基因或体外构建的目的基因在显微操作仪下用极细的微吸管直接注射到活细胞中，已经成功的应用于大的青蛙卵、线虫、培养的哺乳动物细胞、哺乳动物胚胎、植物原生质和组织。

（2）粒子轰击法转基因（基因枪法）

是物理性导入DNA得方法，用包裹DNA 的金属小颗粒轰击受体组织,使DNA 实现穿壁并被导入众多细胞中,称为“基因枪法”(或微粒轰击技术) . 包裹着DNA 的金属粒加速到一个很高的速度后(通常需要部分真空以减少颗粒的速度损失) 穿透受体组织,一般可以穿透2～3 层细胞。

解决的问题：

（1）通过挽救一个突变表型（用野生型复制）来确定一个基因的功能

（2）通过目的基因的报告者建立表达模式

（3）借助过表达野生型基因或者突变基因来干扰生物过程

（4）建立人类疾病的动物模型

（5）生产药用蛋白

（6）提高动物的抗病性、培育抗病品种

（7）提高动物的生产性能

3. 简述02年诺贝尔奖的研究贡献。（王亚梅）

答：

２００２年诺贝尔生理学或医学奖分别授予了英国科学家悉尼·布雷内、美国科学家罗