饲料酶活性测定方法
纤维素酶酶活的测定方法
检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所 刘德海 杨玉华 安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽 饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。
纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。
据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。
下面就此两种方法作一介绍。
1 C MC(羧甲基纤维素)法1.1 材料1.1.1 饲用纤维素酶 由河南省科学院生物研究所提供。
1.1.2 试剂 磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。
1.1.3 仪器 721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。
1.1.4 试剂配制1.1.4.1 pH5.0柠檬酸缓冲液 制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。
1.1.4.2 羧甲基纤维素溶液 准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。
1.1.4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液 准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。
1.1.4.4 0.1%标准葡萄糖溶液 准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。
邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力-文档资料
邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力1 引言葡萄糖氧化酶是一种绿色饲料添加剂，在饲料和畜牧生产中可作为抗氧化剂减缓饲料氧化变质[1]，改善动物肠道微生物平衡[2]，提高饲料利用率[3]，促进动物生长，降低中毒反应更在一定程度上替代抗菌药物和抗球虫病药物，具有广泛的应用前景。
由于葡萄糖氧化酶的高度专一性，基于不同的酶活定义而建立的检测方法主要有电化学法、测压法、凝胶电泳法、滴定法、分光光度法和傅立叶变换红外光谱法等[4]。
电化学法、测压法、凝胶电泳法存在方法操作复杂，要求严格，有很强的仪器依赖性；滴定法存在工作量大、样品需要量大、人工读数导致的测量精度低，尤其在混合型饲料添加剂的检测中不能排除酸性、碱性载体干扰的缺点。
傅立叶变换红外光谱法是较新开发的一种检测方法，优点为检测速度快，试剂用量少。
缺点为仪器要求和模型建立需要前期投入太大，限制了其使用范围。
因此寻找一种简便，快捷，灵敏的高的酶活力检测方法很有意义。
本研究采用邻联茴香胺分光光度法测定葡糖糖酶活力。
反应机理为：葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。
在一定的pH、温度、浓度及反应时间内通过测定产物吸光度在460nm 波长下的变化速率定量计算出酶活力。
基本反应式为：β-D-葡萄糖+H20+O2 δ-D-葡萄糖基-1，5-内酯+H2OH2O2+邻联茴香胺氧化型邻联茴香胺+2H2O1实验部分1.1仪器设备北京瑞利仪器XX公司UV-2600型紫外可见分光光度计；北京中兴伟业仪器XX公司DZKW-2型电热恒温水浴锅；赛多利斯科学仪器XX公司BSA224S型分析天平。
1.2实验试剂和材料标示含量为40GODU/g的葡萄糖氧化酶饲料添加剂；辣根过氧化物酶（上海蓝季生物）；邻联茴香胺（sigma，D9143）；磷酸二氢钠（国药试剂）；磷酸氢二钠（国药试剂）；葡萄糖（国药试剂）。
饲料中木聚糖酶活性测定_(1)
东莞泛亚太生物科技有限公司研发方案一、实验目的：测定颗粒饲料中木聚糖酶活性，考察饲料调质制粒过程中对木聚糖酶活性的影响。
二、试验方案⒈、饲料中木聚糖酶活性标准曲线的制作[1]根据饲料中添加木聚糖酶含量，配制梯度浓度木酶的标准酶液A；[2]空白饲料样品：从饲料厂取粉碎粒度均匀的适量未加酶制剂饲料样品，包括粉料和颗粒料，分别在调质前进料口（未接触蒸汽）、调质出口和制粒后的颗粒料取样，每个点取样本数不低于4个，且取样时间都控制在饲料混合均匀的中间阶段；[3]空白饲料样品加酶后处理：称取7 份空白饲料样品，先粉碎，（约3～4g，须预实验进一步确定保证其吸光度在0.300左右），然后加入木酶缓冲液振荡混合15min，然后依次加入6份不同体积的酶液A（其中一份饲料原料不加入酶液A），定容，摇匀，离心得到上清酶液；[4]空白饲料样品及加酶后样品的还原糖含量OD540值测定：参照APAC实验室木酶检测方法，测定[3]中上清液的OD吸光值；540[5]标准曲线的绘制：以OD540值为横坐标,以0.2ml上清液中所含木聚糖酶活力（U/g）为纵坐标Y，绘制OD 值-酶活梯度曲线。
空白：以0.20ml缓冲液替代0.2ml上清液，其它操作步骤同上。
⒉调质制粒饲料中木聚糖酶活性的测定[1]制备木聚糖酶单酶样品30000U/g，运用APAC实验室检测方法先测定木聚糖酶酶活；[2]在饲料中添加200g木聚糖酶样品，样品用玉米粉(40目)逐级稀释至20kg，再与其他原料混合（因此，要求预混料中没有酶制剂，这步骤要与兴业协商），并且饲料配方组成及原料要最大程度与上述1[2]的空白饲料样品一致；[3]分别在调质前进料口（未接触蒸汽）、调质出口和制粒后的颗粒料取样，每个点取样本数不低于4个，且取样时间都控制在饲料混合均匀的中间阶段；[4]称取3中的加酶饲料（添加木聚糖酶），先粉碎，加入木酶缓冲液定容、振荡15min、离心取上清。
随后参照标准曲线制作方法测其吸光值，并根据标准曲线计算得出其酶活；[5]根据不样品的酶活性结果计算调质、制粒过程中对酶活性的损失率。
β-葡聚糖酶活性测定
β-葡聚糖酶活性测定β-葡聚糖是由葡萄糖单体通过β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中的糊粉层和胚乳细胞壁中。
β-葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷键，使之降解为小分子。
由于在饲料中，大麦的β-葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分的消化利用具有明显的干扰和抑制作用，成为麦类饲料中的抗营养因子。
在饲料中添加β-葡聚糖酶，能有效地消除β-葡聚糖的抗营养作用，促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，增进畜禽健康。
在啤酒生产中，添加β-葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒的过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖的含量。
此外，β-葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛的应用，对β-葡聚糖酶的研究将越来越受到人们的重视。
β-葡聚糖酶活力的测定方法主要有3种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。
其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用的一种酶活测定方法。
其原理是：β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色的深浅与还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液的吸光度值来计算还原糖的生成量，从而得出β-葡聚糖酶的活力。
但在该测定方法的具体操作中存在一些影响酶活力测定结果的因素，本文即对还原糖法测定β-葡聚糖酶活力的几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件。
1 材料与方法1.1 菌株与培养基1.1.1 发酵产酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）A47菌株，由本实验室保藏。
1.1.2 固态发酵培养基麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3 2.95 g、微量元素液0.05 ml、蒸馏水100ml，pH值5.0，121 ℃灭菌20 min。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
饲料添加剂中纤维素酶活力的标准测定方法
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饲 料 添 加 剂 中 纤 维 素酶 活 力 的 标 准 测 定 方 法
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_饲用植酸酶活性的测定_分光光度法_新旧国标变化及解读
2009年第20期从2009年10月1日起，GB/T 18634-2009《饲用植酸酶活性的测定———分光光度法》标准正式实施。
随着植酸酶的大规模应用，饲料企业如何选择和鉴别植酸酶产品的问题，已经成为使用者的当务之急。
在众多影响使用效果的因素中，产品本身的原因主要包括酶的种源、含量、温度稳定性、容重、pH 特性及体内水解效率等，其中酶活含量是最重要的质量指标。
GB/T 18634-2002《饲用植酸酶活性的测定———分光光度法》是在参考了AOAC 方法的基础上制定的，在国标颁布之初，由于市场上的植酸酶菌种相对单一，国标检测方法具有普遍的代表性，对植酸酶的生产、应用和检测起到了很好的指导作用。
随着植酸酶的逐渐普及，特别是在2004年以后，国内对植酸酶的研究开发进展迅速，有大量采用不同菌种发酵的植酸酶相继问世，GB/T18634-2002在检测新型植酸酶产品上显现出缺陷和不足，直接影响到检测结果的准确性。
这次标准的修订为植酸酶的制造、贸易、应用甚至纠纷仲裁、以及加酶饲料的质量控制和检测方法的统一都提供了充分的依据，也是植酸酶发挥效果的基本前提。
下面结合生产检测实际，谈谈新旧国标的主要区别：1缩小了方法的适用范围新标准（GB/T 18634-2009，以下同）适用范围删去原国标（GB/T 18634-2002，以下同）中规定的“添加有植酸酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料”。
修订为：“本标准适用于饲料添加剂用植酸酶产品、也适用于添加有植酸酶的配合饲料”。
预混合饲料、浓缩饲料中金属离子浓度高，成分复杂，对样品干扰大，随着样品保存时间的延长，酶的活性很不稳定，用现行的提取条件不能将酶活提取完全，检测结果不准确。
因此，新国标适用范围中去掉了“添加剂预混合饲料、浓缩饲料”，保留“添加剂用植酸酶产品、配合饲料”。
后两类产品按照新标准的方法检测均能达到较好结果。
2调整了最低检出限量和添加植酸酶的配合饲料样品两次试验的允许差方法最低定量限由原标准的“90U/g ”调整为“130U/g ”。
饲用植酸酶活性的测定
饲用植酸酶活性的测定一、适用范围本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。
适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。
样品最低检出量为90U／kg。
二、方法原理植酸酶在一定温度和pH条件下，水解低物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]复合物，在波长415nm下进行比色测定。
三、试剂和溶液3.1乙酸缓冲液(I)，c(CH3COONa·3H2O)为0.25mol／L：称取34.02g三水乙酸钠于1000 mL烧杯中，加入1000mL蒸馏水溶解，用冰乙酸调节pH至5.50±0.01。
室温下存放2个月有效。
3.2乙酸缓冲液(Ⅱ)，c(CH3COONa·3H2O)为0．25mol／L：称取34.02g三水乙酸钠，0.5 g TritonX-100, 0.5g牛血清白蛋白于1000mL烧杯中，加入1000mL蒸馏水溶解，用冰乙酸调pH至5.50±0.01，室温下存放2个月有效。
3.3植酸钠溶液，c(C6H6O24P6Na12)为7.5mmol／L：称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(3.1)溶解并定容至刻度，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0 mmol／L)。
3.4硝酸溶液：1+2水溶液。
3.5100g／L钼酸铵溶液：称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100mL。
容量瓶中，加入1．0mL 氨水(25％)用水溶解定容至刻度。
3.62.35 g／L钒酸铵溶液：称取0.235 g钒酸铵(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2 mL 硝酸溶液(3.4)，用水溶解定容至刻度。
避光条件下保存一周有效。
3.7颜色终止液：移取2份硝酸溶液(3.4)，1份钼酸铵溶液(3.5)，1份钒酸铵溶液(3.6)混合后使用，现用现配。
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饲用酶活性测定方法附录A木聚糖酶活力的测定方法A1应用范围本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中木聚糖酶的活力。
本标准适用于饲料添加剂木聚糖酶产品，最低检出限为10.0U/g。
A2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
A3木聚糖酶活力单位定义在37℃，pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
A4测定原理木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂发生显色反应。
反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。
A5.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
A5.1乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。
加水溶解，定容至100ml。
A5.2乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。
加水溶解，定容至100ml。
A5.3氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L：称取氢氧化钠20.0g。
加水溶解，定容至100ml。
A5.4乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L，pH为5.50 称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。
再加水溶解，定容至2000mL。
测定溶液的pH。
如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50。
A5.5木糖储备溶液，c(C5H10O5)为10.0mg/ml：称取无水木糖1.000g，加缓冲液（5.4）溶解，定容至100ml。
A5.6木聚糖溶液，浓度为5mg/mL称取木聚糖（Sigma X0672）1.00g，加入氢氧化钠0.32g(或0.5mol/LNaOH溶液16mL)，再加入90mL水（75mL）,加热，磁力搅拌至木聚糖完全溶解。
再加入冰乙酸0.5mL，再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。
如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节pH 至5.50，然后再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。
使用前，适当摇匀。
4℃避光保存，有效期为12h。
A5.7DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。
然后逐步加入100mL 氢氧化钠溶液（5.3），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。
再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。
继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。
用烧结玻璃过滤器过滤。
取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7天后可以使用，有效期为180d。
A6.仪器与设备A6.1实验室用样品粉碎机或碾钵。
A6.2分样筛：孔径为0.25mm（60目）。
A5.3分析天平：感量0.001g。
A6.4 pH计：精确至0.01。
A6.5磁力搅拌器：附加热功能。
A7.4以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。
新配制或超时的DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
A8试样溶液的制备A8.1固体样品的反应用酶液制备按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g。
加入40mL乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。
磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.4）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.4）做适当稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL之间）。
A8.2液体样品的反应用酶液制备液体样品可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）进行稀释、定容（稀释后的酶液中木聚糖的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL之间）。
如果稀释后酶液的pH偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。
A9测定步骤，按下表操作。
反应顺序样品管空白管BK —标准曲线的斜率；C O—标准曲线的截距；M —木糖摩尔质量，M(C5H10O5)=150.2g/moL；t —酶解反应时间，min；1000 —转化因子，1mmol=1000umol。
X D值应在0.04—0.10U/ml之间。
如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
X=X D·D f （2）式（2）中：X —试样木聚糖酶的活力，U/g（或U/mL）；D f—试样的总稀释倍数。
酶活力的计算值保留三位有效数字。
A10. 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过5.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。
A11. 样品酶活力与建议称样量的对应关系见表3表3 样品酶活力与建议称样量的对应关系木聚糖酶活力（U/g或U/mL）称样量（g或mL）≥2000 0.1-0.2500-1999 0.2-0.5200-499 0.5-1.050-199 1.0-2.010-49 2.0-5.0附录Bβ-葡聚糖酶活力的测定B1应用范围本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中葡聚糖酶的活力。
本标准适用于饲料添加剂葡聚糖酶产品。
B2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
B3β-葡聚糖酶活力单位定义在37℃、pH为5.5的条件下，每分钟从4mg/mLβ-葡聚糖溶液中降解释放1ug还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位，以U/g表示。
B4测定原理β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。
反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。
B5试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
B5.1葡萄糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/mL：称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100mL。
B5.2乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。
加水溶解，定容至100mL。
B5.3乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。
加水溶解，定容至100mL。
B5.4氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氢氧化钠20.0g。
加水溶解，定容至100mL。
B5.5乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L,pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。
再加水溶解，定容至2000mL。
测定溶液的pH。
如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节至5.50。
B5.6β-葡聚糖溶液：浓度为4mg/mL 。
称取β-葡聚糖0.80g，加入10mL无水乙醇，润湿β-葡聚糖2分钟，再加入50mL乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）。
磁力搅拌，同时缓慢加热，直至β-葡聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100mL）。
然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）定容至100mL。
β-葡聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。
4℃避光保存，有效期为3天。
（如冷冻保存，有效期为60天，使用前在4℃条件下解冻）B5.7 DNS试剂称取3，5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。
然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（5.4），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。
在逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g，苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。
继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。
用烧结玻璃过滤器过滤。
取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7天后可以使用，有效期为180d。
B6.仪器与设备B6.1实验室用样品粉碎机或碾钵。
B6.2分样筛：孔径为0.25mm（60目）。
B6.3分析天平：感量0.0001g。
B6.4pH计：精确至0.01。
B6.5磁力搅拌器：附加热功能。
B6.6电磁振荡器。
B6.7烧结玻璃过滤器：孔径为0.45μm。
B7.3 分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2mL缓冲液（5.5）和5mLDNS试剂（5.7）。
电磁振荡3s，沸水浴加热5min。
然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。
吸取缓冲液（5.5）4.0mL，加入DNS试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，再用水定容至25mL，以标准空白样为对照调零，在540nm 处测定吸光度A值。
B7.4以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。
新配制或超时的DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
B8.试样溶液的制备B8.1固体样品的反应用酶液制备按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g。
加入40mL乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。
磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.5）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.5）做适当稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL之间）。
B8.2液体样品的反应用酶液制备液体样品可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）进行稀释、定容。
如果稀释后酶液的pH偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.5）做适当稀释定容。