植物抗虫基因工程研究进展

植物抗虫基因工程研究进展摘要植物抗虫基因工程为防治农业害虫提供了一条崭新途径。

本文对植物抗虫基因工程近年来所取得的某些研究进展，包括目前已发现和利用的抗虫基因、提高抗虫基因在植物体内表达的方法以及防止或延缓害虫产生抗性的策略等方面进行了综合评述，并对植物抗虫基因工程中有待解决的问题和发展前景提出了自己的看法。

关键词植物，抗虫基因，基因工程虫害是造成农业减产的重要原因。

据统计，各种作物因虫害而遭受的经济损失平均达30％以上。

化学农药和生物农药的使用虽然可以减轻害虫对农作物的危害，但长期而大量的使用农药已使害虫产生了极高的抗性。

同时，化学农药的过量使用，还带来了严重的人畜中毒和环境污染等问题。

植物抗虫基因工程的诞生，为防治害虫提供了一条崭新的途径。

由于该方法具有安全、有效、可降低投资和减少环境污染等诸多优点，因而，自1987年首次报道抗虫转基因植物以来，植物抗虫基因工程的研究取得了迅猛发展。

一方面，已经发现了大量可利用的抗虫基因，并有40多种抗虫基因已被导入植物体。

另一方面，对于如何提高抗虫基因的表达以及防止害虫产生抗性的问题日益受到重视，并进行了多方面研究，已经取得许多重要的研究成果。

本文试图对上述几个方面的进展作一综述。

⒈微生物来源的抗虫基因苏云金芽孢杆菌的毒蛋白（简称Bt-toxin)基因是目前世界上应用最为广泛的抗虫基因，Bt-toxin是是苏云金芽孢杆菌在孢子形成时期所产生的一种杀虫毒素，是一类分子量为130~160KD的蛋白质。

当被昆虫吞食后，在昆虫中肠碱性环境下，经蛋白酶的作用Bt-toxin 被讲解产生的60KD左右的毒性小肽，并和中肠上皮细胞纹缘膜上的受体特异结合，然后插入细胞膜造成细胞膜穿孔，破坏细胞内外的渗透平衡，导致细胞膨胀而裂解，使得昆虫停止取食并最终死亡。

第一个Bt-toxin基因是1981年由Schnepf和Whiteley分离克隆的，到目前为止，已经有近180个不同的Bt-toxin基因被克隆和测序，并且新的Bt-toxin基因还在不断的被克隆和分析。

根据Crickmore等人（1998）所提出的新的命名法则，这些已克隆的基因被划分为30大类，不同的Bt-toxin基因具有不同的杀虫谱。

截止1999年7月，在所发现的Bt-toxin基因中，已有40余种获得了专利。

自第一次分离克隆到Bt-toxin基因以后，人们一直在试图将该基因转移进植物体并实现表达，以获得能够抗虫的转基因植物。

1987年，世界上有四家实验室首次获得了转Bt-toxin基因的烟草或番茄（Barton等，1987；Fischhoff等，1987；Hilder等，1987；Vaeck 等，1987）。

由于所用的基因是完整的野生型Bt-toxin基因或截短了3’端的野生型基因，所获得的转基因植株抗虫性都很弱，在转基因植物中毒蛋白的表达量只有0.001％或几乎检测不到毒蛋白的表达。

进一步的研究发现，Bt-toxin基因在植物体内表达量过低是由于野生型基因的mRNA不稳定造成的(Murry等，1991）。

此外，Bt-toxin基因是原核基因，在植物中进行翻译时由于某些种类的tRNA含量过少而降低了翻译效率。

于是，在后来的工作中，人们把注意力集中在了Bt-toxin基因的改造上。

美国Monsanto公司的Fischhoff小组在这方面做出了出色的工作。

该研究组的Perlak等人在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，对cry 1 Ab基因进行了部分改造和完全改造，选用了植物偏爱的密码子，去除了原序列中存在的类似植物内含子、多腺苷酸信号序列或富含AT的ATTTA等不稳定元件（Perlak等，1991），然后将改造的基因转入番茄和烟草中，结果转基因植株的毒蛋白表达量增加了30100倍，有些植株的毒蛋白可高达可溶性蛋白的0.2％～0.3％。

此外，Fischhoff小组还利用完全改造的Bt-cry1Ab基因首次获得了在大田中具有明显抗虫性的棉花(Perlak等，1993），利用完全改造的cryⅢA基因获得了抗鞘翅目害虫的马铃薯。

继Monsanto公司人工改造 Bt-toxin基因之后，国内外广泛开展了Bt基因的改造和转化研究。

可以说，利用改造或人工合成的 Bt-toxin基因进行遗传转化已成为植物抗虫基因工程的主流，近几年已有大量的相关研究被报道。

Iannacone等（1997）将Bt cry3基因进行改造，去除了影响表达的不稳定元件，选用了植物偏爱的密码子，极大地提高了毒蛋白的表达水平，获得了高抗鞘翅目甲虫的茄子。

Maqbool等（1998）通过基因枪将人工合成的Bt cry2A 基因转入水稻，毒蛋白的表达量可高达1％某些植株的杀虫率达到100％另外，Cornelisson等（1991）、Adang等（1995）、Bosch等（1995）、Stewart等（1996）以及 Cao 等（1999）也分别利用人工改造的 Bt-toxin基因得到了抗虫转基因植株，其中有些研究已获得专利。

我国在以 Bt基因为基础的植物抗虫基因工程领域也取得了丰硕成果,，范云六领导的研究小组将3’端截短了的 Bt-toxin基因导入棉花和水稻，均已获得转基因植株。

另外，他们还将天然的 Bt cry1 Ab基因进行改造，获得了适合于植物高效表达的毒蛋白基因（王京红等，1994）。

郭三堆等人的研究小组人工合成了全长1824bp的 cry1 Ab和cry1 Ac融合的 GFM cry1A 基因，转基因烟草能显著抑制棉铃虫的生长发育，表现出有效的杀虫活性（黄其满等，1998；)。

田颖川等人的研究小组和白永延等人的研究小组也先后合成和部分改造了 cry1A基因，并导入烟草、甘蓝和油菜等，均获得了抗虫转基因植株（田颖川等，1991；毛慧珠等，1996；李学宝等，1999）。

大量的研究表明，Bt-toxin基因在经改造或重新合成以后其抗虫效果大为提高，与其它抗虫基因相比，在同等表达量之下,Bt类基因产物的抗虫能力最强（Schuler等，1998），因此，迄今为止，所获得的抗虫转基因植物大多都被引入了 Bt-toxin 基因，目前在美国已经商品化的三种抗虫作物（棉花、玉米、马铃薯）也无一例外地都使用了 Bt-toxin基因。

值的一提的是，最近Selvapandiyan等（1998）从苏云金杆菌中克隆了一种新的 Bt-toxin基因cry1Ia5，发现该基因不经改造即可直接在植物体内高效表达，表达量与经改造的其它类 Bt 基因相近，杀虫效果非常明显。

这一结果对于深入研究和发现新型 Bt 基因不无启发。

除了苏云金芽孢杆菌的 Bt-toxin基因以外，来自根癌农杆菌的异戊烯转移酶(isopen-tenyl-transferase）基因是另一类被证明具有抗虫性的基因。

该基因的编码产物是细胞分裂素生物合成过程中的关键酶，当被导入烟草和番茄，发现能减轻由烟草天蛾（Manduca sexta)所造成的危害（Carozzi和Koziel，1997）。

来自链霉菌的胆固醇氧化酶（cholesterol-oxidase）基因也被转入烟草，发现对烟青虫和棉铃象（ Anthonomus grandis）有较强毒杀效果（Purcell等，1993）。

2 植物来源的抗虫基因2.1 蛋白酶抑制剂基因蛋白酶抑制剂是一类存在于某些植物中的蛋白质，它能抑制昆虫或动物消化系统的蛋白酶活性，对植物起着天然保护作用。

昆虫体内的蛋白酶负责食物中蛋白质的消化，将蛋白酶抑制剂基因引入植物，即可通过影响昆虫的消化作用而致昆虫死亡。

据最近的研究，蛋白酶抑制剂的直接抗消化作用似乎不是导致昆虫死亡的主要原因，更重要的是，由于蛋白酶抑制剂的存在，引起了昆虫体内蛋白酶的过量产生，从而造成昆虫体内必需氨基酸的亏空而致昆虫死亡（Gatehouse等，1992）。

除此之外，蛋白酶抑制剂还可影响昆虫体内的水分平衡、酶的调节以及昆虫的蜕皮等。

然而，有研究表明，在蛋白酶抑制剂的作用下，某些昆虫会被诱导产生一种适应机制，即通过产生新型的蛋白酶而避开抑制剂的影响（Jongsma等，1995）。

迄今所发现的蛋白酶抑制剂主要有4类：丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂。

目前已有多种蛋白酶抑制剂（主要是丝氨酸蛋白酶抑制剂）基因被导入植物，有些已获得专利（Lee，1992；Acedo等，1994；Confalonieri 等，1998；Lee等，1999;Altpeter；1999等，1999）。

其中豇豆的胰蛋白酶抑制剂（简称 CpTI）被认为是最有效的蛋白酶抑制剂。

这种抑制剂具有广谱抗虫性，对鳞翅目、鞘翅目及直翅目的许多昆虫都有毒杀活性。

CpTI基因目前已被转入至少10种植物。

例如：CpTI 基因转化的烟草、油菜、马铃薯和水稻等对鳞翅目和鞘翅目害虫均具有良好的抗虫效果（刘春明等，1992；Mckersie和Brown,1997)。

2.2 淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂是应用于植物抗虫基因工程的第二类酶抑制剂。

这类抑制剂在植物界广泛存在，可以抑制动物、微生物的淀粉酶活性而对植物本身的淀粉酶不起作用。

目前了解较多的是来自菜豆（Phaseolus vulgaris）的α-淀粉酶抑制剂（αAI-Pv），它是一种热稳定的糖蛋白，能够与昆虫或哺乳动物的α-淀粉酶1:1形成复合物。

实验表明转αAI-Pv 基因的烟草和豌豆均能阻止鞘翅目幼虫的生长发育（Altabella和Chrispeels，1990；Schroeder等，1995）。

2.3外源凝集素基因外源凝集素是存在于植物中的能够与糖类复合物上的糖基结合的蛋白质。

目前发现有些外源凝集素对同翅目、鞘翅目、鳞翅目和双翅目的昆虫有毒性。

导致昆虫中毒的机理虽然未有完全搞清，但已知外源凝集素是通过结合于昆虫中肠纹缘膜细胞而发挥作用的，很可能是影响了昆虫对营养物质的消化吸收，使昆虫饥饿直至死亡。

某些外源凝集素不仅对昆虫有毒性，对哺乳动物也有强毒性。

但来自豌豆和雪花莲的外源凝集素对哺乳动物却是低毒的，因此，近年来利用这两类凝集素基因所进行的基因转化工作日渐增多，已在包括马铃薯、小麦、陆地棉等多种植物中得到表达，并增强了转基因作物的抗虫性（Birch；等，1999；Stoger等，1999；王伟等，1999）。

2.4 来自植物的其它抗虫基因豆科植物的几丁质酶基因曾被引入马铃薯，但并未发现对鳞翅目害虫具有抗虫性，只是对蚜虫有较弱的抑制生长作用（Gatehouse等，1996）。

用来自烟草的阴离子过氧化物酶（anionic peroxidase）基因导入番茄等植物中，结果发现对鳞翅目和鞘翅目的某些害虫有显著的抗虫效果(Carozzi和Koziel，1997）。