分子试验的验证要求

临床分子诊断方法学验证要求关明复大学附属华山医院检验医学科复旦大学附属华山医院检验医学科主要内容•什么是验证？自建项目？商业化项目？•如何做验证？步骤和实施路径•JAK2 V617F举例说明突变方法的建立JAK2 V617F突变方法的建立分子诊断面临的挑战•涉及方法较多，如PCR、荧光定量PCR、MLPA、测序等；•实验步骤较多，包括标本的分离保存、处理、检测；•手工程度较高，自动化程度普遍偏低，较多依赖手工，不同的实验室条件和操作者等因素对实验结果的影响较大；•尚未建立公认的质量管理标准等；•更高的准确性要求；•结果报告缺乏标准化；•……这些基地将为个体化医学相关检测作制这些基地将为个体化医学相关检测工作制定国家行业标准，并面向相关从业人员展开规范化、标准化的培训工作，为我国个体化医学研究与应用提供宝贵经验，大大加快我国分子诊断的进程。

•SUMMARY OF CHANGES CONTENTSSUMMARY OF CHANGES •UNDERSTANDING THE 2010 CAP ACCREDITATION CHECKLIST COMPONENTS •HOW TO INSPECT USING R.O.A.D INSPECTION TECHNIQUE •ADDITIONAL INFORMATION C •APPLICABILITY •PROFICIENCY TESTING •QUALITY MANAGEMENT AND QUALITY CONTROLGENERAL ISSUES GENERAL ISSUESPROCEDURE MANUALASSAY VALIDATIONREQUISITIONSSPECIMEN HANDLING SPECIMEN HANDLINGSPECIMEN PROCESSINGQUANTITATIVE ASSAYS: CALIBRATION AND STANDARD REAGENTSCONTROLSANALYSISExtractionA lifi ti AmplificationRestriction EndonucleasesSequencingDetection Methods Detection MethodsAgarose and Polyacrylamide Gel Electrophoresis Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR) ArraysVerification和Validation “Verification”和“Validation”Verification (确认）“通过提供客观证据证明特定的要求已得到满足”•当已经存在合适的性能参数时候，有必要明确在实验室内新的试验符合参数规定，这个过程叫确认。

•正确地做某个试验（the test is being performed correctly）.th t t i b i f d tl •其他确认的应用包括：采用某个实验室已经建立的技术开展新试验（为个新的基因测序）或者开展某个已经在其他新试验（为一个新的基因测序）；或者开展某个已经在其他实验室验证过试验。

“Verification”和“Validation” Validation(验证)“通过提供客观证据证明预期的使用或应用要求已得到满足”当没有合适的性能参数可供参考时需要验证。

•当没有合适的性能参数可供参考时需要验证•与”金标准“和参考试验相比较去评估性能•做正确的试验（performing the correct test)performing the correct test)•在医学分子诊断领域，由于往往缺乏参考方法或者参考物质，通常将最可靠的方法作为标准或者参考物质通常将最可靠的方法作为标准。

不同认可体系对方法学验证的要求•CAP的“方法学验证（assay validation）”和ISO15189中的“诊断性验证（diagnostic validation）diagnostic validation”•共同点：新的检测方法应用到病人临床诊断之前必须进行方法学验证，以了解该检测的临床表现，保证实验结果可信度[1-3]。

解该检测的临床表现保证实验结果可信度•CAP提出了明确的要求：“实验室必须进行分析验证各项检测的性能参数”，还对验证试验覆盖的标本范围（如不同的基因型等）、标本类型（如血液、尿液、新鲜/冷冻组织、石蜡包埋组织等）、验证的参数（如参考值、报告范围、准确度、分析灵敏度、分析特异性和精确度等）做了相应的规定。

[1]Guzel O, Guner EI. ISO 15189 accreditation: Requirements for quality and competence of medical laboratories, experience of a laboratory I. Clin Biochem,2009,42: 274-278.[6]Yanikkaya-Demirel G. ISO 15189 accreditation: Requirements for quality and competence of medical laboratories, experience of a laboratory II. ClinBi h200942279283Biochem,2009,42: 279-283.[7]Jennings L, Van DV, Gulley ML. Recommended principles and practices for validating clinical molecular pathology tests. Arch Pathol Lab Med,2009,133: 743-755.方法学验证的要求的修正和改进IVDs And LDTs IVDs. And LDTs.I it di ti (IVD )•In vitro diagnostics (IVDs):商业化生产试剂盒；通过FDA 510(k) clearance or PMA (premarket approval)。

•Laboratory-developed tests (LDTs):Laboratory developed tests (LDTs):自建项目；局限于实验室内使用。

•Many of these clinically important LDTs are unlikely to ever become FDA cleared or approved because low test volumes make it approved because low test volumes make it economically unfeasible to go through the current FDA 510(k)or PMA approval process.•FDA cleared:In vitro diagnostics that have gone through and passed a 510(k) trial. •FDA approved:An IVD that has gone through and passed a PMA trial.current FDA 510(k) or PMA approval process.•510(k) trials are designed to show that an IVD is substantially equivalent to a legally marketed predicate device. 510(k) trials are less involved and less expensive than PMA trials.•Premarket approval trials are required for class III medical devices or if there is no predicate device available for comparison. They are significantly more expensive to perform than 510(k) trials.Verification/确认试验•使用范围：主要用于商业化试剂盒（in vitro diagnostics，IVDs）项目，指已经商业化生产，并已经通过美国FDA ）项目指已经商业化生产并已经通过美国FDA510(k) clearance 或approval过程的分子诊断项目。

•主要目的：确证厂家提供的数据在本实验室的的实际效果•主要指标：准确性、精确性、参考范围和可报告范围主要指标准确性精确性参考范围和可报告范围（这些指标通常在厂商的说明书中提及）。

PARR(precision, accuracy, reportable range, and reference range).Validation/验证试验•使用范围：自建项目（LDTs）和修改项目（modified FDA-cleared/approved tests）•主要目的：验证本试验在临床使用的各项性能指标及其实际效果•主要指标：准确性、精确性、参考范围和可以接受范围（与确证实验要求相同）分析敏感性、分析特异性（验证试验要求）其他涉及的重要的评价指标（标本稳定性、干扰物质、线性……）（验证试验要求）•与确诊试验相比相对复杂PARR+AS+AS(precision, accuracy, reportable range, reference range, analyticsensitivity and analytic specificity)sensitivity, and analytic specificity)和其他涉及的重要的临床评价指标Clinical validity/临床验证•主要包括：临床敏感性（clinical sensitivity）和临床特异性（clinical specificity) 。

specificity)•临床敏感性不同于分析敏感性：分析敏感性主要指参考方法检测结果为阳性的结果中用实验方法得到阳性结果的一致性（对定性试验来说）阳性的结果中，用实验方法得到阳性结果的一致性（对定性试验来说）；临床敏感性主要指结果为真阳性的人群中真正罹患某种疾病或异常的比例，强调实验结果与临床诊断的一致性。

•临床特异性也不同于分析特异性：分析特异性主要指参考方法检测结果为阴性的结果中，用实验方法得到阴性结果的一致性（对定性试验来说；临床特异性要指实验结果为阴性的人群中真正没有罹患某种疾说）；临床特异性主要指实验结果为阴性的人群中真正没有罹患某种疾病或异常的比例，也强调实验结果与临床诊断的一致性。