分子试验的验证要求
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临床分子诊断
方法学验证要求
关明
复大学附属华山医院检验医学科复旦大学附属华山医院检验医学科
主要内容
•什么是验证？自建项目？商业化项目？•如何做验证？步骤和实施路径•JAK2 V617F
举例说明突变方法的建立
JAK2 V617F突变方法的建立
分子诊断面临的挑战
•涉及方法较多，如PCR、荧光定量PCR、MLPA、测序等；•实验步骤较多，包括标本的分离保存、处理、检测；
•手工程度较高，自动化程度普遍偏低，较多依赖手工，不同的实验室条件和操作者等因素对实验结果的影响较大；•尚未建立公认的质量管理标准等；
•更高的准确性要求；
•结果报告缺乏标准化；
•……
这些基地将为个体化医学相关检测作制这些基地将为个体化医学相关检测工作制
定国家行业标准，并面向相关从业人员展开规范化、标准化的培训工作，为我国个体化医学研究与应用提供宝贵经验，大大加快我国分子诊断的进程。
•
SUMMARY OF CHANGES CONTENTS
SUMMARY OF CHANGES •
UNDERSTANDING THE 2010 CAP ACCREDITATION CHECKLIST COMPONENTS •
HOW TO INSPECT USING R.O.A.D INSPECTION TECHNIQUE •
ADDITIONAL INFORMATION C •
APPLICABILITY •
PROFICIENCY TESTING •QUALITY MANAGEMENT AND QUALITY CONTROL
GENERAL ISSUES GENERAL ISSUES
PROCEDURE MANUAL
ASSAY VALIDATION
REQUISITIONS
SPECIMEN HANDLING SPECIMEN HANDLING
SPECIMEN PROCESSING
QUANTITATIVE ASSAYS: CALIBRATION AND STANDARD REAGENTS
CONTROLS
ANALYSIS
Extraction
A lifi ti Amplification
Restriction Endonucleases
Sequencing
Detection Methods Detection Methods
Agarose and Polyacrylamide Gel Electrophoresis Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Arrays
Verification和Validation “Verification”和“Validation”
Verification (确认）
“通过提供客观证据证明特定的要求已得到满足”
•当已经存在合适的性能参数时候，有必要明确在实验室内新的试验符合参数规定，这个过程叫确认。
•正确地做某个试验（the test is being performed correctly）.
th t t i b i f d tl •其他确认的应用包括：采用某个实验室已经建立的技术开展新试验（为个新的基因测序）或者开展某个已经在其他新试验（为一个新的基因测序）；或者开展某个已经在其他实验室验证过试验。
“Verification”和“Validation” Validation(验证)
“通过提供客观证据证明预期的使用或应用要求已得到满足
”
当没有合适的性能参数可供参考时需要验证。•当没有合适的性能参数可供参考时需要验证•与”金标准“和参考试验相比较去评估性能•做正确的试验（performing the correct test)
performing the correct test)•在医学分子诊断领域，由于往往缺乏参考方法或者参考物质，通常将最可靠的方法作为标准或者参考物质通常将最可靠的方法作为标准。
不同认可体系对方法学验证的要求
•CAP的“方法学验证（assay validation）”和ISO15189中的“诊断性验证（diagnostic validation）
diagnostic validation”
•共同点：新的检测方法应用到病人临床诊断之前必须进行方法学验证，以了解该检测的临床表现，保证实验结果可信度[1-3]。
解该检测的临床表现保证实验结果可信度
•CAP提出了明确的要求：“实验室必须进行分析验证各项检测的性能参数”
，还对验证试验覆盖的标本范围（如不同的基因型等）、标本类型（如血液
、尿液、新鲜/冷冻组织、石蜡包埋组织等）、验证的参数（如参考值、报告范围、准确度、分析灵敏度、分析特异性和精确度等）做了相应的规定。
[1]Guzel O, Guner EI. ISO 15189 accreditation: Requirements for quality and competence of medical laboratories, experience of a laboratory I. Clin Biochem,2009,42: 274-278.
[6]Yanikkaya-Demirel G. ISO 15189 accreditation: Requirements for quality and competence of medical laboratories, experience of a laboratory II. Clin
Bi h200942279283
Biochem,2009,42: 279-283.
[7]Jennings L, Van DV, Gulley ML. Recommended principles and practices for validating clinical molecular pathology tests. Arch Pathol Lab Med,2009,133: 743-755.