[讲义]高效液相色谱!

要求： 固定相→多孔性凝胶 流动相→水——凝胶过滤色谱 流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱 分离机制见图示
[X S ] [X m ]
渗透系数
KP
注：Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小， 与流动相的性质无关 next
图示

分离机制： 利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性 渗透实现分离
二、色谱法定义、分离基础和目的
定义：利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流 经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分 配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移 动，最终达到分离的目的。图例
分离基础：差速迁移 (例:赛跑)
目的：多组分分离，实现定性定量分析
图示
石油醚 流动相
碳酸钙
色素
吸附剂

分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开
方法缩写 方法全称 分子量范围 能检测的有机化 合物的比重
GPC HPLC GC
凝胶渗透色谱 高效液相色谱法 气相色谱法
＞103 400--2000 10—400 80—85% 15—20%
2. HPLC与GC的比较
相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼
具分离和分析功能，均可以在线检测。
分析对象及范围 能气化、热稳定性好、 G 且沸点较低的样品，占 C 有机物的20% 流动相的选择 操作条件
流动相为有限的几种 加温常压 “惰性”气体，只起运 操作 载作用，对组分作用小
溶解后能制成溶液的样 H 流动相为液体或各种液 品，高沸点、高分子量、 P 体的混合。它除了起运 室温、高 难气化、离子型的稳定 L 载作用外，还可通过溶 压下进行 或不稳定化合物，占有 C 剂来控制和改进分离。 机物的80%
1．1906年由俄国植物学家Tsweet创立 植物色素分离见图示
2、20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对 植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛的应用。
3、30～40年代发表了薄层色谱、纸色谱的论文。 4、40年代瑞典科学家Tiselius等在分配液相色谱、 吸附色谱和电泳领域取得了成果。 5、50年代英国Martin和Synge建立GC色谱。
反相分配色谱：极性强的组分先出柱。
（三）离子交换色谱法

要求：
固定相→离子交换树脂 流动相→水为溶剂的缓冲溶液
被分离组分→离子型的有机物或无机物 分离机制见图示

阳离子交换树脂 RSO3-H+ + X+ → RSO3-X+ + H+
固定离子 可交换离子 待测离子
[ RSO3 X ]S [H ]m [ RSO3 H ]S [ X ]m
经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在 大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶 质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，仅有 低柱效，分析时间很长。 高效液相色谱法使用全多孔微粒固定相，装填在小口 径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的 色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而
径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质 凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
（一）吸附色谱法


要求： 固定相→吸附剂（硅胶或AL2O3） 具表面活性吸附中心 分离机制：见图示
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，利用吸附 剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开
注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质 以及柱温有关 next
图示

分离机制
利用组分在ห้องสมุดไป่ตู้动相和固定相间溶解度差别实现分离，是 一个连续萃取过程。
分配色谱法分类
正相分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性 反相分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性
正相分配色谱：极性强的组分后被洗脱。 （库仑力和氢键力）
四、高效液相色谱法的特点
与经典液相色谱法相比

颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相， (键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；
高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；


高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检
测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。
与气相色谱法相比
高效液相色谱法
经典液相色谱法
2. HPLC与GC的比较
高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有 选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于 分析蒸汽压低、沸点低的样品，而不适于分析高沸点有机物、高分子 和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。 在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相 色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进 行分离和分析，此两种方法的比较如下：不同色谱方法适用的分子量范围
第一节 高效液相色谱的特点
高效液相色谱法作为色谱分析法的一个分支，是在20世纪60年
代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型 的分离分析技术。液相色谱包括传统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。
20世纪50年代后气相色谱法在色谱理论研究和实验技术上迅速崛
起，而液相色谱技术仍停留在经典操作方式，其操作繁琐，分析时间 很长，因而未受到重视。
结论：

四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、 分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡 K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和 渗透系数

除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶 孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流 动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响
按固定相的固定方式分：
三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较
1. HPLC与经典LC的比较
从分析原理上讲，高效液相色谱法和经典液相（柱）
色谱法没有本质的差别，但由于它采用了新型高压输液泵、
高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱 法焕发出新的活力。
三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较
1. HPLC与经典LC的比较

缺点： 对未知物分析的定性专属性差
需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)
思考题：高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和 不同之处？
第二节 HPLC分类

按分离机制分类：


分配色谱法
吸附色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法
基本类型色谱法的分离机制
对于不同的分离机理，K的含义不同。
吸附色谱 吸附系数
分配色谱
离子交换色谱 分子排阻色谱
分配系数
离子交换系数 分子排阻系数 统称K
1.
吸附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固
定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的 硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多 元溶剂。 2. 分配色谱（液-液分配色谱）：早期通过在担体上
（二）分配色谱法

要求： 固定相→机械吸附在惰性载体上的液体 流动相→不能与固定相互溶 载体→惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反 应
分离机制见图示 分配系数
Cs X s Vs K Cm X m Vm
Vs为固定相的体积 Vm为流动相的体积

Cs为溶质分子在固定相中 的浓度 Cm为溶质分子在流动相中 的浓度
6、60年代GC-MS联用分析已不能满足分析测试的要求。 7、70年代HPLC崛起，气相色谱和高效液相色谱，逐步成 为各行各业必不可少的分析工具，广泛应用于各个生产领 域。
8、1975年，美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出 的离子色谱的概念，在分离柱后加一个抑制柱，同年商品 化的离子色谱仪问世。 9、1979年，美国依阿华州立大学J.S.Fritz等人提出的非 抑制型离子色谱仪。
涂渍一薄层固定液制备固定相, 担体表面。
现多为化学键合固定
相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在
3. 离子交换色谱：固定相为离子交换树脂，流动相为 无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树 脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。 4. 空间排阻色谱（凝胶色谱）：以凝胶为固定相。凝
胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔
10、20世纪80年代以后，一种新型的色谱技术—毛细管电 泳技术随之出现。 11、20世纪90年代以后，ELSD一种新型的检测器出现， 改变了弱紫外吸收物质的梯度检测难题。 12、20世纪90年代中期以后，用于HPLC的MS检测器开 始普及，使液相进入定性的时代。
进入21世纪，HPLC在多个方面取得突破： Merck商品化的一体化柱，给人们一种全新的色谱柱概念。 2004年，Waters提出了UPLC的新概念，超高压液相色谱。 借助小颗粒的填料，特殊化的设计，实现超高效和快速、 高通量的分析。 2004年10月13日，ESA公司向外界宣布了一项高效液相 色谱的最新技术突破，Corona™带电气溶胶检测器 （CAD）诞生，新一代的通用型检测器。 2005年，岛津发布了第一个基于Web的HPLC系统。 HPLC向高通量、高灵敏、网络化、小型化发展。

不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广； 可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大 作用，选择性高； 一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。


优点：“三高”、“一快”、“一广” 高选择性——可将性质相似的组分分开 高效能——反复多次利用组分性质的差异 产生很好分离效果 高灵敏度——10-11~10-13g，适于痕量分析 分析速度快——几~几十分钟完成分离 一次 可以测多种样品 应用范围广——气体，液体、固体物质