高效液相色谱讲义
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
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▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
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色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
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什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
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高效液相色谱讲义
高效液相色谱法色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。
后来逐渐发展了柱色谱法，纸色谱法，气相色谱法，高效液相色谱法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。
现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。
不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。
经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。
而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9 107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器。
一、分离原理及分类。
二、HPLC与GC差别三、HPLC与经典LC区别四、高效液相色谱仪流程图。
五、HPLC 特点.一、液相色谱分离原理及分类和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动相组成。
液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。
根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。
色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
二、HPLC与GC差别✓相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测✓主要差别：分析对象的差别和流动相的差别✓液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。
液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。
高效液相色谱的基本参数讲义
4.0×10-11
0.4
6.4×10-11
Hdc²: 容积消耗指标
Hdc²qmin: 包括检测器在内的整个系统检测能力指标
qmin: 浓度型监测器的最小检测量
24
色谱流出曲线的描述
htA 2 0 ex (p tt2 g t)2t d t
1.11
0.250
6.3
5×10-10 1.3×10-10
15cm×2mm 1.1 15cm×2mm 8.7 20cm×1mm 1.0 20cm×1mm 9.0
1.18
0.040
1.10
0.054
1.84
0.010
1.10
0.016
1.0
4×10-10 1.6×10-1
1.6
2.6×10-10
0.3
17
色谱峰的有关参数
W½ =a + bt
18
几种描述分离状况参数的关系
Rstr(2)tr(1) (tr(2) 1)tr(1) (d1) N 1
W 1/2
tr(1)
W 1/2
5.54
两峰分离的必要条件： 1、两组分的保留值不同 2、样品组分应有一定的保留值 3、色谱柱应具有分离必须的柱效
空柱管体积（Vc ) * 总孔隙度（εT)
to=
流动相体积流速（F c)
= π/4 *d²c *L * εT/Fc
计算孔隙度
4
§2 选择性指标(´)和相对保留值()
´= t r(2) / tr(1) =(1+ k´(2)/(1+ k´(1)) = t r '(2) / tr' (1) = k´(2) / k´(1) ´作为选择性指标比 直观
高效液相色谱法指导培训讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱的基本参数讲义
降低检测器噪声
通过优化检测器条件，如调整光 源强度、选择合适的滤光片等， 可以降低检测器噪声，从而提高 信噪比和灵敏度。
增加进样量
在保证色谱柱不过载的前提下， 适当增加进样量可以提高检测器 的响应值。
灵敏度与检测器选择关系
不同检测器灵敏度差异
不同类型的检测器对同一物质的灵敏度可能存在较大差 异，如紫外检测器对含有共轭体系的化合物具有较高的 灵敏度，而荧光检测器则对某些具有荧光特性的化合物 具有较高的灵敏度。
改变柱温
选择合适的色谱柱
柱温升高，分子运动加快，保留时间缩短 ；柱温降低，保留时间延长。但需注意柱 温过低可能导致色谱柱效能下降。
根据分析需求选择合适的色谱柱类型、粒径 和长度，以获得理想的保留时间。
保留时间预测模型
线性溶剂强度模型
假设溶质在固定相和流动相之间的分配系数与流动相组成 呈线性关系，通过实验数据拟合得到线性方程，可用于预 测不同流动相组成下的保留时间。
仪器组成与工作流程
01
仪器组成
高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检 测器、数据记录与处理系统等部分组成。其中输液系统包 括储液器、泵、流动相梯度程序等；进样系统包括进样器 、定量环等；色谱柱是实现分离的核心部件；检测器用于 对分离后的组分进行检测；数据记录与处理系统则用于数 据的采集、处理和分析。
使用后，应及时清洗色谱 柱，避免残留物对色谱柱 造成损害。
ABCD
在使用前，应对色谱柱进行 充分的平衡和条件化，以确 保其分离效果和稳定性。
长期不使用的色谱柱应妥 善保存，并定期进行检查 和维护。
仪器操作规范与安全防护
01
操作人员应熟悉仪器的结构、原理和操作方法，并按照规范进行操作。
高效液相色谱法讲解
进样针
用于抽取和注射样品，需 保持清洁并避免交叉污染。
进样阀
切换进样状态，使样品进 入色谱柱或废液瓶。
色谱柱及填料选择
色谱柱类型
根据分离需求选择合适的色谱柱，如 反相色谱柱、正相色谱柱、离子交换 柱等。
填料粒径
填料类型
根据分离机制和样品性质选择合适的 填料，如C18、C8、氨基柱等。
影响色谱柱的分离效果和柱压，常用 填料粒径有3μm、5μm、10μm等。
检测系统
检测器
数据处理系统
将色谱柱分离后的组分转化为电信号进行 检测，常用的有紫外可见检测器、荧光检 测器、电化学检测器等。
采集、处理色谱数据，包括峰高、峰面积 、保留时间等，并输出结果。
检测池
光源
用于放置检测器，保持恒温并避免气泡产 生。
为检测器提供稳定的光源，确保检测结果的 准确性和稳定性。
03 高效液相色谱法实验操作
样品前处理与制备
样品提取
根据样品性质选择合适的 溶剂进行提取，确保目标 化合物能够充分溶解。
样品净化
采用固相萃取、液液萃 取等方法去除杂质，提 高目标化合物的纯度。
样品浓缩
通过蒸发、氮吹等方式将 样品浓缩至一定体积，便
于后续进样操作。
制备标准品
根据需要制备不同浓度 的标准品，用于后续定
量分析和质量控制。
质量控制
对实验过程进行质量控制，包括重 复性实验、加标回收实验等，以确
保实验结果的可靠性和准确性。
实验注意事项
01
02
03
04
仪器校准
定期对高效液相色谱仪进行校 准，确保仪器处于最佳工作状
态。
试剂与耗材选择
选择高质量的试剂和耗材，避 免对实验结果产生干扰。
高效液相色谱法讲义(包含讲义和实验)
高效液相色谱仪在基础有机化学实验产物分析中的应用第一部分：基础理论部分一、色谱法简介1. 色谱法简史1906年俄国植物学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法”（Chromatography）的概念。
他在论文中写到：“（原文）植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就像光谱一样，称之为色谱图。
”2. 色谱法分类色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。
根据物质的分离机制的不同，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。
（1）吸附色谱吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。
（2）分配色谱分配色谱是利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。
分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。
分配色谱的色谱过程本质上是组分分子在固定想和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。
（3）离子交换色谱离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。
离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。
固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。
（4）凝胶色谱凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。
待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。
第十二章讲义高效液相色谱
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱 色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱 入 口 压 强 （ kg/cm2 ） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以 上的液体作流动相，增大分离的选择性。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间 等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管， 减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度 等都是克服柱后展宽的途径
第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
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实验七 高效液相色谱法分离芳香烃
一、实验目的
1、了解高效液相色谱法的原理。
2、学习高效液相色谱的操作方法。
3、掌握高效液相色谱法分离芳香烃的一般步骤及过程。
二、实验原理
色谱法是利用不同物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数，当两相作相对移动时，使这些物质在两相间进行反复多次分配，使原来微小的分配差异产生了很明显的分离效果，从而依先后顺序流出色谱柱，通过适当的检测手段，对分离后的各组分进行测定。
高效液相色谱是选用颗粒很细的高效固定相，采用高压泵输送流动相，分离、分析、定性及定量全部分析过程都通过仪器来完成的一种重要液相色谱法。
除了有快速、高效的特点外，它能分离沸点高、分子量大、热稳定性差的试样。
它的定性方法是用与标准品对照的方法，即采用保留时间对照法，当某两种物质在相同的色谱条件下保留时间相同时，就认为是同一种物质。
它的定量方法有很多，如外标法、内标法、面积归一法等。
我们采用面积归一法，即用一定量的标准品进样，记录其峰面积，然后进未知样品，根据未知样品的峰面积与标准品的面积比，计算某物质的含量。
计算公式：
其中W i 是未知物中被测物的浓度或质量，W s 是标准品的浓度或质量， A i 、A s 分别是被测物和标准品的峰面积（设定两者进样量相同）。
三、高效液相色谱仪的构造（Waters 600E 高效液相色谱仪）
1、高压输液系统：贮液器、高压泵、过滤器和梯度洗脱装置
2、进样系统
3、分离系统：柱系统（150 mm× 4.6 mm ，n -C 18柱）
4、检测器： 2487紫外检测器
5、控制和数据处理系统
W i =A i W s A s
四、试剂
1、流动相：80% 甲醇（色谱纯）+ 20% 水（经0.45μm膜过滤）（使用前超声波脱气）。
2、微量注射器：50 μL。
3、苯、甲苯（均为A.R）、二甲苯；样品（苯、甲苯、二甲苯）混合物均用甲醇（色谱纯）配制
五、实验步骤
1、接通电源，启动四元高压泵。
设定A泵为运行泵、流速为0.8 mL/min，用流动相平衡色谱柱30 min。
2、打开紫外检测器，输入所需波长：254 nm。
3、打开电脑，在开始→ 程序→ M32打开操作程序。
进行方法设置
4、点击moniter，监视基线5—10 min。
5、基线平稳后，点击工作栏上方的“停止”键，点击“进样”键。
6、用微量注射器抽取40—50μL标样，针头朝上排出气泡后，扎入进样孔（进样阀柄应处于向上位置），快速注射，迅速将进样阀柄扳下。
7、待样品峰全部显示后，再进行标样2及样品的测试（按6、7步进行）。
8、点击工作栏上方的“查看”，进行保留时间、面积积分记录。
9、实验做完后，用甲醇作流动相，冲洗色谱柱30 min，进行封柱。
10、关机：先关程序，然后关紫外检测器、四元高压泵，最后关电源。
六、数据处理
1、测定每一个标准样品的保留时间和峰面积。
2、测定未知样中每一个峰的保留时间，与标准样色谱图比较，标出未知样中每一个峰代表什么化合物。
3、测定未知样中每一个峰的峰面积，用标准样品的峰面积，计算未知样中相应化合物的含量。
七、思考题
1、在该色谱条件下，苯、甲苯和二甲苯的保留时间各是多少？
2、如何确定混合样中各组分的含量？。