HPLC高效液相色谱实验讲义

自动 进样器
储 液 瓶
溶剂输 送系统
手动 进样阀
色谱柱
数据采集 处理系统
检测器 废液瓶
定量分析
1.归一化法 (Normalized Percent) 2. 外标法 (External Standard) 3. 内标法 (Internal Standard)
定量分析
归一化法定量
将试样中所有组分的含量之和按100％计 算，以它们相应的色谱峰面积为定量参数。如 果试样中所有组分均能流出色谱柱，并在检测 器上都有响应信号，都能出现色谱峰，可用此 法计算各待测组分X的含量。其计算公式如下：
梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制 流动相的组成（如溶剂极性、离子强度和 pH 值等），适用于分析组分数多、性质相差较 大的复杂混合物样品，从而使所有组分都在 适宜条件下获得分离。
4 、检测器
检测器 特点 最低检测限 适用范围
紫外检测器（UV或UVD） 分为:①可变波长型②二 极管阵列检测器
①用于检测有外吸收的物质; ②灵 敏度较高,噪音低,线性范围宽,对流 速和温度波动不灵敏,可用于梯度洗 脱.
用于检测糖、高分子子化合 物、高级脂肪酸、磷脂、维 生素、氨基酸、甘油三酯及 甾体等几十类化合物
4 、检测器
电化学检测器 (ECD) 用于能氧化、还原的有机物质 的检测 1× 10-12g/ml 适用生物胺、酚、羰 基化合物、巯基化合 物等 尤其适合于糖类的检 测
示差折光检测器 (RID) ①属通用型检测器 ,利用组分 10-8g/ml 与流动相折射率之差进行检测 . ②稳定性好 ,操作方便 .③灵敏 度低 ,受环境温度、流动相组 成等波动的影响大 ,不适合梯 度洗脱 化学发光检测器 (CLD) ①高选择性、高灵敏度的新型 检测器 . ②设备简单,自身发 光 ,无需光源 ,价格便宜 Pg级 (10-12)
②流动相脱气 HPLC所用的流动相必须预先除去其中的空气，习 称脱气，一般在临用前对流动相进行脱气，常用的脱 气法有 •超声波振荡脱气、 •惰性气体（He）鼓泡吹扫脱气、 •抽真空 •加热法。 ③过滤 过滤是为了防止不溶物堵塞流路和色谱柱入口处 的微孔垫片，因此应预先除去流动相中的任何固体微 粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是 过滤，采用0.45μm以下微孔滤膜过滤。 滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种。
（2）庚烷=
9.0 0.70 100% 34.7% 18.15
定量分析
内标法定量
准确称量样品的重量为m克，取一纯物质（内标物）适量，加 入其中，并准确称量内标物重量为ms克，混匀，进样。测量色谱 图上需定量的i组份的峰面积Ａi及内标物的峰面积Ａs，则i组份在 样品m中所含的重量mi，与内标物质的重量ms，有下述关系：
2、流动相的选择 1）反相键合相色谱
反相键合相色谱常用流动相
流动相 常用溶剂 适用范围
部分含水溶剂 非水溶剂 缓冲溶液
甲醇 -水、乙腈 -水系统 乙腈 -二氯甲烷、甲醇 -四氢呋喃 等 三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐 溶液
用于分离中等极性、弱极性药物 用于分离疏水性物质 用于可溶于水并具可解离特性的化合物
用于分析微量脂质、 核酸、生物胺等
5、HPLC前处理 （1）流动相的处理
①溶剂的纯化 选择专供色谱分析用的“色谱纯”溶剂， 分析纯或优级纯溶剂在很多情况下也可满足色 谱分析的要求。由于不同的色谱柱和检测方法 对溶剂的要求不同，有时需进行除去紫外杂质、 脱水、重蒸等纯化操作。水一般采用石英系统 二次蒸馏水。
（1）反相键合相色谱法 反相键合相色谱法是现代液相色谱中应用最为广泛 的方法，占整个HPLC应用的80%左右。 反相色谱法一般采用非极性键合相，十八烷基键合 相（简称ODS或C18）是最常用的非极性固定相，对于各 种类型的化合物都有较强的适应能力； 流动相通常以水为基础溶剂，再加入一定量能与水 互溶的极性调整剂，常用的有甲醇 -水、乙腈- 水系统。 极性调整剂的性质及其与水的混合比例对溶质的保 留值和分离选择性有显著影响， 流动相的极性增大，洗脱能力降低，溶质的k增大， tR增大；反之，k与tR减小。调整流动相的极性，可控制 k值在所要求的范围内（k=1-10），对于结构类似的组 分，极性大的组分先出柱。
Ai f m (i ) mi ms As f m ( s )
。
mi Ci % 100% m
Ai f mi ms Ci % 100% As f ms m
只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出 待测组分在样品中的百分含量。
定量分析
例：无水乙醇中的微量水的测定可按下述方法进行： 样品配制准确量取被检无水乙醇10ml称重（净重）为79.3700g。用减重法加入 无水甲醇约0.25g，精密称定为0.2572g，混匀待用。 经色谱分析测得数据如下： W h 0.130cm 水： h=4.60cm，
外标法定量
比较相同分析条件下纯样（标准样品）与样品中该 组份色谱峰面积或峰高，进行定量的分析方法称为外标 法。也被称为定量进样校正曲线法，或定量进样法。 此方法是在进样量、色谱仪器及操作等分析条件严 格固定不变的情况下，先将不同含量的组份纯样等量进 样，进行色谱分析，求得含量与色谱峰面积或峰高的关 系，将此关系绘成定量校正曲线，而后在同样条件下分 析待测样品，测量待测样品的峰高或计算峰面积，并以 此在校正曲线上求出样品含量。
2）正相键合相色谱
①常采用饱和烷烃（如正已烷）中加入 一种极性较大的溶剂作为极性调节剂（如异 丙醚），通过调节极性调节剂的浓度改变溶 剂强度；
②常采用二元以上的混合溶剂系统。
3、洗脱方式
等度洗脱是在同一分析周期内流动相的 组成保持恒定，使所有组分的 k值都处于这个 范围内，适用于组分数较少、性质差别不大 的样品。
外标法定量
当被测样品中各组份浓度变化不大时，例如工厂中 控制分析的样品，其组成一般变化不大，可以不必做校 正曲线，用单点校正法来分析。即配制一个和被测组份 含量十分接近的标准样，在同一条件下定量进样分析标 准样及待测样品，由两者的峰高比或峰面积比计算未知 样品含量。
Ai ms mi As
五、奶粉中三聚氰胺测定实例
其中液-液分配色谱是中药制剂分析中应 用最广泛的方法，根据固定相与流动相的极性 差别，分为正相色谱和反相色谱两类。
正相色谱:流动相极性小于固定相极性的分配 色谱法，主要用于极性物质的分离测定；

反相色谱 :流动相极性大于固定相极性的分 配色谱法，主要用于非极性、中等极性物质的 分离测定

化学键合相是将固定液的官能团键合在载体上 所形成的固定相。
高效液相色谱法
海南大学材料与化工学院 周雪晴
一. 色谱法概述 二. 高效液相色谱法（原理、相关术语、分类） 三. 高效液相色谱仪（仪器结构与原理） 四. 色谱的定性定量分析 五. 奶粉中三聚氰胺测定实例 六. 液相色谱分析方法的开发
工作原理
用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的 混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样 品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器， 由数据处理系统记录色谱信号或进行数据处理而得到分 析结果。
样品组分分离示意图
色谱术语： 色谱图、保留时间、死时间、 峰高、峰面积、峰宽、半峰宽、 分辨率、柱效、塔板数
色谱分析可以认为进入柱子内的样品成分在流动相中是 呈“正态分布”的，我们可以根据 tR（峰的位置〕来定性； 根据峰面积或峰高（h）来定量。
无保留物质
HPLC系统构成
进样系统 流动相供应系统
具有化学性能稳定，热稳定性好，一般在pH28范围的溶液中不变质，使用过程不流失，载样量 大，适于梯度洗脱等特点，已广泛用于正相与反相 色谱，离子抑制色谱，离子对色谱。
药典中HPLC法所采用的固定相均为化学键合相。 以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色 谱法. 现就中药制剂分析中最常用的键合相色谱法作 一介绍。
定量分析
例：分析乙醇、庚烷、苯及乙酸乙酯的混合物。实验测得 它们的色谱峰面积各为5.0、9.0、4.0、及7.0cm2，由手册 查得它们的相对重量校正因子FＷ分别为0.64、0.70、0.78 及0.79，按归一化法分别求它们的重量百分浓度。
（1）乙醇%=
5.0 0.64 100% 5.0 0.64 9.0 0.70 4.0 0.78 7.0 0.79 3.20 100% 18.15 17.6%
i离子对试剂的选择 通常所选用离子对试剂的电荷应与试样离子的电荷 相反。
离子对试剂 1、季铵类（如四甲基、四丁基、十六烷基 三甲基铵） 2、叔胺类（如三辛基胺） 3、烷基磺酸盐（如戊烷、已烷、庚烷、辛 烷、十二烷基磺酸盐） 4、高氯酸 主要应用对象 强酸和弱酸（如磺酸染料、羧酸、磺胺类药 物、水溶性维生素） 磺酸盐等 强碱和弱碱（如儿茶酚胺、罂粟碱、烟酰胺）
奶类制品中的三聚氰胺
������ 伊利雪糕、四洲甜点、乐天蛋糕、大白兔奶糖、雀 巢 牛奶、立顿三合一奶茶、亨氏米粉、吉百利巧克力„„
样品前处理过程及设备
氮吹
第六章 液相色谱分析方法
1、色谱柱的选择 根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度等因素进 行选择。 ①大多数药物可用C18反相（ODS）柱加以分离测定； ②也可选用正相分配色谱柱（氨基柱、氰基柱）或硅胶 吸附色谱柱等； ③解离药物可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交换 色谱分离测定； ④脂溶性药物异构体的分离测定可采用硅胶吸附色谱柱。
（2）样品的处理 HPLC分析前需对样品进行预处理，以便将待测物质有 效地从样品基质中释放出来，使样品的形式及所用溶剂符 合HPLC的要求。 ①待测组分的提取 根据样品成分及组分性质选择合适的 提取方法和提取条件。 ②溶剂的挥发 对于液体样品或经处理后得到的样品溶液， 若待测物的浓度在定量限以上，且溶剂对HPLC系统没有干 扰，可以直接进样分析。但很多情况下需除去溶剂，浓缩 甚至干燥样品，除去溶剂的方法有： 自然挥散或在氮气流下吹干，适用于小体积样品和挥 发性溶剂； 减压蒸发，适用于热不稳定样品； 冷冻干燥，适用于受热易分解破坏的样品。 ③滤过 样品溶液进样前，需用滤膜抽滤或针头滤器过滤，