质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化
酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化质粒构建和转化是进行酵母菌表面展示的重要步骤之一。
在这一过程中，我们需要合成包含目标基因序列的质粒，并将其转化到酵母菌细胞中。
下面是酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化的详细描述。
1. 质粒构建质粒是一种带有自主复制序列的DNA分子。
在酵母菌表面展示中，我们需要构建一种质粒，其中包含用于表达和展示目标蛋白的基因序列。
a. 选择适合的质粒载体：选择合适的质粒载体，例如pYD1或pPICZα，这些载体在酵母菌表面展示中被广泛使用。
b. 插入目标基因：根据目标基因的序列设计引物，通过PCR扩增目标基因，并在引物的末端添加限制酶切序列，以便后续的质粒构建。
c. 酶切和连接：将PCR扩增产物与质粒载体进行酶切，并使用连接酶将两者连接起来。
此步骤需要选择合适的限制酶，并优化酶切和连接的条件。
d. 转化大肠杆菌：将连接好的质粒转化到大肠杆菌中，并通过培养和筛选获得含有目标质粒的克隆。
2. 酵母菌质粒转化在完成质粒构建之后，我们需要将质粒转化到酵母菌细胞中。
转化是指将质粒导入到细胞内，并使其在细胞内复制和表达。
a. 制备质粒：从大肠杆菌培养物中提取包含目标质粒的质粒DNA。
使用质粒提取试剂盒按照厂家说明书进行质粒提取。
b. 酵母菌预处理：用含有酵母菌培养基预处理酵母菌细胞。
这一步骤可以增加酵母菌细胞对质粒的转化效率。
c. 质粒转化：将预处理后的酵母菌细胞与质粒DNA一起孵育。
孵育温度和时间依据具体的实验要求进行设置。
质粒转化的方法包括热激冷冻法、锂乙酸法等，选择合适的方法进行转化。
d. 筛选阳性克隆：将经过转化的酵母菌细胞转移到含有适当选择压力的培养基中，并在培养基上筛选出带有目标质粒的阳性克隆。
这些步骤是进行酵母菌表面展示的质粒构建和转化的基本操作流程。
在每个步骤中，实验者需要采取严谨的操作、选择合适的试剂和工具，并根据实验要求进行优化。
通过这一步骤，可以成功构建和导入目标质粒，为后续的酵母菌表面展示实验奠定基础。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
一般普通质粒扩增：先将质粒转化到DH5α等大肠杆菌中，通过扩大培养获取大量含有质粒的大肠杆菌。
大肠杆菌的培养需要用到LB液体培养基，配方见下文。
根据质粒带有的抗生素抗性基因，还需要在LB中加入适量相应抗生素，如氨苄青霉素、卡那霉素等。
LB 液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml 去离子水中，用NaOH 调pH至7.5, 加去离子水至总体积1 升,高压下蒸气灭菌20 分钟。
质粒提取目前一般都有商业化生成的试剂盒销售，可按照相应试剂盒的说明书操作。
转化：①取出感受态细胞（也有商品化感受态销售），冰浴10分钟。
②取连接产物10μl 放入感受态细胞中（100μl/管），轻轻旋转以混匀内容物，冰浴30分钟。
③42℃热休克120 秒（按照需要加长或减少时间），不能摇动Ep管。
冰浴5 分钟，然后转移到事先预热至37℃的无抗生素的普通LB培养基800ul，50~100rpm 37℃恒温振荡 1 小时30 分钟。
④用无菌弯头玻棒铺菌器将150ul 菌液铺于含有抗生素的LA平板。
⑤铺菌的LA 平板于37℃正放2~3 小时，然后倒置培养16-24 小时。
⑥将疑似阳性克隆的白斑选出，接到新的含有抗生素的LB中培养14小时左右，做菌液PCR或抽提质粒酶切以进一步鉴定转化是否成功。
转染：①将3μl（约4μg）纯化好的经除菌的质粒DNA溶入250μl 无血清培养基DMEM (无双抗) 中，轻轻混匀，室温放置5 mim。
②再吸取10 μl 脂质体溶入250 μl 无血清培养基DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，室温放置5 mim。
③将制备好的DNA 与脂质体轻轻混合均匀，室温放置20 mim。
然后加入1.5 ml 无血清培养基DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，即为包裹好的脂质体/DNA。
④将包裹好的脂质体/DNA小心滴加至备用细胞表面，37℃，5% CO2，饱和湿度中孵育10小时。
质粒生产工艺
质粒生产工艺质粒生产工艺是生物技术领域中重要的研究方向之一。
质粒是一种环状的DNA分子，可以在细胞内自我复制和传递基因信息。
质粒生产工艺是指通过基因工程技术，将目标基因插入质粒中，并将质粒引入宿主细胞中，实现目标基因的表达和生产。
质粒生产工艺的关键步骤包括质粒构建、质粒提取和质粒转染等。
首先，需要选择合适的质粒载体，一般选择具有高复制能力和稳定性的质粒。
质粒载体通常包含了起始子、启动子、终止子和选择标记等功能元件，以确保目标基因能够在宿主细胞中得到正常表达。
质粒构建是质粒生产工艺的核心步骤之一。
在质粒构建过程中，需要将目标基因插入质粒的多克隆位点中。
常用的质粒构建方法有限制性内切酶切剪、连接酶法和PCR扩增等。
在限制性内切酶切剪法中，首先将目标基因和质粒载体通过限制性内切酶的作用，切割成互补的末端。
然后，通过连接酶的作用，将目标基因与质粒载体连接起来。
最后，将构建好的质粒转化到宿主细胞中。
质粒提取是质粒生产工艺的另一个重要步骤。
质粒提取的目的是从宿主细胞中分离出质粒。
常用的质粒提取方法包括碱裂解法、盐溶解法和商业化提取试剂盒等。
在碱裂解法中，首先通过细菌培养扩增质粒的数量。
然后，使用碱溶液破坏细菌细胞壁，释放质粒。
接下来，通过酸性中和和酒精沉淀的步骤，将质粒从混合物中分离出来。
质粒转染是质粒生产工艺的最后一步。
质粒转染是将构建好的质粒引入宿主细胞中的过程。
质粒转染的方法有多种，包括热激法、电穿孔法和化学法等。
在热激法中，首先将质粒与细胞一起暴露在高温下，使细胞膜通透性增加。
然后，在室温下快速冷却，使质粒能够进入细胞内。
在电穿孔法中，通过电场作用，使细胞膜产生孔隙，质粒通过孔隙进入细胞内。
在化学法中，通过化学试剂改变细胞膜的性质，使质粒能够进入细胞内。
总结起来，质粒生产工艺是通过将目标基因插入质粒中，并将质粒引入宿主细胞中，实现目标基因的表达和生产的过程。
质粒生产工艺包括质粒构建、质粒提取和质粒转染等关键步骤。
质粒转化、细胞转染步骤
质粒转化、细胞转染步骤
转化是指将外源DNA（常以质粒作为载体）导入受体细
胞（如大肠杆菌），从而使其获得新的遗传特性。
具体步骤如下：首先将12ul的质粒DNA加入50ul感受态cell中，轻柔混合后进行冰浴30min。
接着向管中加入培养基，混匀后使细菌
恢复正常生长状态。
然后在42℃下热激90s，迅速冰浴2min，最后在37℃下震荡培养（﹤225rpm）1h，使细菌获得新的遗
传特性。
转染（n）是将含有目的基因的载体转移到真核细胞内的
过程。
在进行质粒转染时，需要先将6-well-plate中的每个孔
培养至60-70%的状态。
然后在接种时每个孔加入2.5×105个
/ml的细胞。
接下来，将2.5ug质粒DNA和200ul的opti-
MEM混合，再加入6ul的转染液进行混匀，并在室温下静置
15min。
待转染细胞换成1.3ml的opti-MEM培养基后，将转
染复合物（200ul）轻轻均匀滴入细胞培养基中，并十字形摇
晃6-well-plate以混匀转染复合物。
最后将6-well-plate放入37℃、CO2培养箱中进行培养。
质粒转染步骤
质粒转染步骤引言：质粒转染是基因工程中常用的实验技术之一，用于将外源基因导入目标细胞内，从而使目标细胞表达外源蛋白或产生特定的功能。
本文将详细介绍质粒转染的步骤及相关注意事项。
一、质粒制备在进行质粒转染实验前，首先需要制备质粒。
质粒通常由DNA构成，可由质粒抽提试剂盒等方法进行提取。
提取质粒的关键是确保DNA质量和纯度，以及质粒的浓度，这将直接影响到后续转染的效果。
二、细胞培养在进行质粒转染前，需要培养目标细胞。
细胞培养的关键是选择适当的培养基和培养条件，以保证细胞的健康生长。
细胞的形态、生长速度和细胞密度等因素需要在细胞培养过程中进行监测和调整。
三、质粒转染试剂的选择质粒转染试剂是实现质粒导入细胞的关键。
根据不同的细胞类型和转染目的，可以选择不同的转染试剂，如磷脂体转染试剂、聚合物转染试剂等。
在选择转染试剂时，需考虑其转染效率、细胞毒性和适用细胞类型等因素。
四、质粒转染步骤1. 细胞处理：将培养好的细胞用适当的培养基洗涤，并吸取适量的细胞悬液。
2. 质粒与转染试剂的混合：将提取好的质粒与转染试剂按照一定比例混合，形成转染复合物。
注意避免过高的转染试剂浓度，以免对细胞产生毒性影响。
3. 转染复合物的加入：将转染复合物缓慢加入细胞悬液中，充分混合，并保持一定的转染时间。
转染时间的长短需根据实验要求来确定。
4. 转染条件的优化：根据实验需要，可以对转染条件进行优化，如转染时间、转染温度、转染复合物的浓度等。
5. 转染后的培养：转染完成后，将细胞悬液转入含有适当选择性抗生素的培养基中进行培养，以筛选成功转染的细胞。
五、转染效果的验证转染完成后，需要进行转染效果的验证。
常用的验证方法包括荧光显微镜观察、蛋白质表达分析、PCR验证等。
根据实验要求，选择合适的验证方法，评估转染效果。
六、注意事项1. 转染试剂的质量需经过严格检测和筛选，确保其稳定性和转染效率。
2. 转染过程中需注意无菌操作，避免细菌、真菌等污染对实验结果的影响。
重组载体质粒扩增流程
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载重组载体质粒扩增流程地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容重组载体质粒扩增的实验步骤：Ⅰ、感受态细菌的制备（CaCl2化学转化法）准备：LB液体培养基、LB固体平板（含抗生素和未含抗生素）、0.1mol/L 氯化钙溶液（预冷）、细菌冻存液（0.1Mol/L CaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油）、高压过的EP管等1、将适合的冻存菌（ stbl3）挑取一点（枪头沾取一点）加入盛有1ml LB液体培养基的15ml离心管中；37℃，220rpm，摇菌培养1个小时（复苏)。
2、取10μl以下刚复苏的stbl3涂布于非抗性的LB固体培养基上37℃过夜培养（纯化）。
3、挑取20多个前一天培养的细菌菌落加入3ml LB液体培养基里37℃，220rpm，摇菌培养12个小时（扩增，需使细菌老化，因为下一步摇出的菌才可处于对数生长期）。
4、以1：100的比例将3ml培养物转接于300ml LB培养基中，在37℃ 220rpm摇床上剧烈振荡培养约1.5-2小时（使细菌处于对数生长期，易于转化，可每半小时测一下OD600值，使其0.3-0.5）；5、制冰。
以下步骤开始注意无菌操作：6．将所有培养好的菌液分装移至离心管中，在冰上冷却10分钟；7．4℃下3000g冷冻离心10分钟；8．弃去上清，加入 30ml预冷0.1Mol/L CaCl2 溶液，轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；9．4℃下3000g冷冻离心10分钟；弃去上清，加入 5ml预冷0.1Mol/L CaCl2 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细菌重新悬浮；4℃下3000g冷冻离心10分钟；弃去上清，加6ml 0.1Mol/L CaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油混匀后，分装成100μl或200ul/EP管（4℃预冷），-80℃冷冻贮存备用。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤载体构建是分子生物学研究中不可或缺的过程，它涉及到将目标基因或蛋白质序列移植到不同的载体中，以便扩大其表达量、纯化和研究。
本文将介绍载体构建的基本步骤，包括质粒的选择、PCR扩增、连接和转化等过程。
质粒的选择质粒是最常用的载体类型之一，具有很多优点，如易于扩增、转化和操纵等。
在选择质粒时，需要考虑以下几个方面：1. 质粒大小和拷贝数质粒的大小和拷贝数会影响其扩增和表达，选择适当大小和拷贝数的质粒可以提高表达效率。
2. 基因水平选择标记质粒中常含有基因水平选择标记，如抗生素耐药基因等。
在构建载体时需要选择合适的标记，以便快速筛选到表达了目标基因的细胞。
3. 表达宿主质粒可以在不同的宿主中表达，选择合适的表达宿主可以提高表达效率和纯度。
常见的表达宿主包括大肠杆菌、酵母等。
PCR扩增PCR扩增是将目标序列扩增为质粒中适当长度的过程。
在进行PCR扩增之前，需要准备以下试剂和设备：•Taq DNA聚合酶•原始模板DNA•引物•正向引物和反向引物•dNTP混合物•PCR缓冲溶液在PCR扩增中，需要设置合适的反应体系和程序。
常见的PCR反应条件为：•94℃，5 min：初始变性•94℃，30 s：变性•50-60℃，30 s：退火•72℃，1 min/kb：延伸•72℃，7 min：最终延伸连接连接是将PCR扩增产物与质粒DNA连接的过程。
连接反应需要用到T4 DNA连接酶和DNA PCR产品凝胶提取试剂盒等试剂，具体操作步骤如下：1.将PCR扩增产物切割至合适长度。
2.提取PCR产物，并使用DNA PCR产品凝胶提取试剂盒纯化。
3.连接酶在37℃下反应数小时。
4.连接反应后，在大肠杆菌中进行转化。
转化转化是将连接成功的PCR产物转化为大肠杆菌的过程。
转化需要用到大肠杆菌、新鲜的LB培养基和适当的抗生素等试剂。
常见的转化条件为：80-90秒高温热冲击，加入细胞后在37℃，250rpm振荡培养1小时后添加适宜浓度的抗生素进行筛选。
质粒扩增、提取、转化和转染
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序60质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB 培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
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质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
一、感受态细菌制备（CaCl2法）
1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，
4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置
1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；
4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
取出后，稍冷却，一个60mm的培养皿中加入约20ml培养基，无菌条件下铺板。
5. 选择性培养基：培养基+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min，取出后放于60OC水浴，保持60oc温度加入100mg/ml的氨苄青霉素（Amp）即100ml
LB加入100μl Amp(Amp终浓度达到50μg/ml），摇匀后铺板（20ml/板）上盖稍打开，37度烘箱/室温下放置干燥1-2天，封口膜包裹后贮4℃保存备用。
三、质粒转化
注意：取两管感受态细胞①：为空白对照，不加质粒②：加入质粒；
每管加入量：体积<10μl，DNA<50ng；
质粒稀释成0.02μg/μl；
200μl感受态细胞中加入2μl浓度为0.02μg/μl质粒。
具体步骤：
1. 取两管感受态细胞冰上放置解冻，同时质粒冰上解冻，开启水浴锅42℃
管①空白对照，不加质粒；
管②加入2μl 0.02μg/μl的质粒，混匀，冰上放置30min
2. 42℃水浴90s，不摇
3. 取出，置冰上2min，加入LB 300μl，37℃，200r/min振荡培养1小时，复苏细胞。
同时将选择性培养基置于室温1小时。
4. 取上述转化菌液150μl涂布在相应的培养板上：
⑴不含Amp的培养板——不含质粒菌液⑵含Amp的培养板—a：不加质粒菌液；b：加质粒菌液
正面培养1h后，倒置培养过夜。
5. 观察菌落生长情况，取含Amp培养板上加入含质粒菌液后生长的菌落，加入到5ml LB液体培养基中（加入Amp 5ul），37℃培养12h。
6. 用含甘油30%的LB保存，-70℃备用（甘油消毒、高压灭菌）。
三、质粒提取
1. 已转化好质粒的细菌加入到含有抗生素的LB培养液总共大概150ml在37℃恒温箱中摇菌过夜。
2. 将细菌分装在4个50ml的离心管中，7000r/min，10分钟离心，倒掉上清。
同时取10mlP1溶液加入10μl的酶抑制剂，备用。
3. 在每个离心管中加入1mlP1：酶抑制剂（1：1），吹打悬浮沉淀，然后将所有菌液集合到同一个离心管中。
4. 加入5ml的P2溶液，轻柔的颠倒20次。
放置4分钟。
一旦加入P2，应立刻盖上盖子，以防酸化。
Genomic DNA裂解物是粘性物，切勿将溶解时间超过5分钟。
5. 加入5ml的P3溶液，轻柔的颠倒20次。
冰上孵育20分钟。
加入P3后，会产生蓬松的白色物质，沉淀物变得不粘，沉淀物包括genomic DNA,Protein,细胞碎屑和SDS
6. 13000r/min,30分钟离心，将上清倒至盖有一层纱布的吸附柱（Qiagen-tip100）中，吸附柱下放置一个装废液的饭盒。
吸附柱使用前应用约4ml的QBT平衡，上清液应快速加入柱中，如果上清放置时间长则会变得混浊，系蛋白沉淀所致，须再次离心。
7. 待滴完之后，加满QC液洗去残液，滴完后再重复一次。
8. 用5mlQF液洗脱柱上的质粒至10ml离心管中。
9. 加入3.5ml异丙醇，颠倒混匀，13000r/min，30分钟。
可见沉淀物，小心弃去上清。
10. 加入1ml70%的乙醇，溶解沉淀后转入1.5ml的appendorf管；再取1ml70%的乙醇，清洗管壁，转入1.5ml的appendorf管。
11. 14600r/min，20分钟，弃上清，待乙醇蒸发后加入100μlTE，再将两管集合（酌量，若质粒量比较多，可加入200μl）。
12. 取2μl质粒液至加有98μl双蒸水的0.5mlappendorf管，在紫外——分光光度计上检测质粒浓度和纯度。
（纯度参照：1.8~2.0）
13. 剩余的质粒标记日期，质粒种类，浓度放在-20℃冰箱保存，备用。
四、细胞转染
1. 细胞计数后按一定数量植入24孔板中，放入培养箱中培养12小时，备用。
2. 根据转染的孔数及每孔加入的质粒量算出所需的pbs量和质粒量
3. 在两个10ml的离心管中均加入pbs液，A管加入质粒，B管加入转染试剂，吹打混匀。
4. 在斡旋的条件下将转染试剂逐滴加入到质粒中，放置20分钟。
5. 将加过转染试剂的质粒均匀加到已培养12小时的孔板中。
再将孔板置于培养箱培养。