靶向淋巴系统造影剂的制备及其动物实验_孙玥

中国科学: 化学 2011年第41卷第11期: 1712 ~ 1718 SCIENTIA SINICA Chimica 《中国科学》杂志社SCIENCE CHINA PRESS论文靶向淋巴系统造影剂的制备及其动物实验孙玥①, 吴晶②, 万升标①, 刘世恩③, 冯元勇②, 尚伟②*, 江涛①*①中国海洋大学医药学院, 青岛 266003②青岛大学医学院附属医院口腔颌面外科, 青岛 266003③青岛大学医学院附属医院放射科, 青岛 266003*通讯作者, E-mail: liweishang2004@; jiangtao@收稿日期: 2011-04-14; 接受日期: 2011-05-18; 网络版发表日期: 2011-07-22doi: 10.1360/032011-246摘要采用两种方法, 一种方法是以右旋糖酐(Dextran)和DTPA的二酐为原料, DMAP为催化剂, 另一种是以右旋糖酐和DTPA为原料, 采用DMAP及EDC·HCl为联合催化剂, 合成造影剂Dextran-DTPA-Gd. 通过比较产物的水溶性及Gd含量确定了最佳制备条件, 得到了钆含量为16.1%、水溶性好的高分子造影剂; 通过FTIR、粒度分析表征了Dextran-DTPA-Gd的结构及其分子粒径大小(分布范围为100~150 nm, 平均值为130 nm); 动物实验中, 以钆喷酸葡胺注射液(Magnevist)为阳性对照, 通过对比家兔腿部磁共振成像图, 绘制腿部淋巴系统信号增强率-时间曲线, 证明Dextran-DTPA-Gd具有更高的信号增强效果(最高值为314%)及淋巴系统选择性的特点, 为其进一步应用奠定了基础. 关键词右旋糖酐DTPA钆造影剂磁共振成像1 引言1973年美国科学家Lauterbur首次发表核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)技术, 从此这一技术在生物学和医学等领域得到了迅速发展和广泛应用. 近几十年来, 核磁共振成像(MRI)技术已经成为一种极为常见的医疗手段, 越来越多的性能优越且毒副作用小的造影剂也随之诞生[1~3].位于元素周期表64位的稀土元素钆(Gd), 有7个未成对电子, 易形成水溶性顺磁络合物, 是磁共振造影剂常用的金属离子[4], 如目前上市的钆喷酸葡胺注射液(Magnevist)、钆贝葡胺注射液(Multihance)及钆双胺注射液(Omniscan)等, 它们均为小分子螯合物, 临床应用广泛; 然而使用时需要反复注射以延长有效时间[5], 而且它们易迅速扩散到细胞外或组织间隙, 肾脏代谢快, 选择性(靶向性)较低. 为了克服以上缺点, 近十年来, 人们开始尝试将小分子螯合剂连接到天然或合成的高分子材料上, 如多糖、蛋白质、聚氨基酸和聚乙二醇等, 以延长其旋转相关时间, 增加弛豫效率, 并提高其靶向性和稳定性. 代表性的化合物有阿拉伯半乳聚糖-DTPA-Gd[6], 沙枣胶多糖- DTPA-Gd[7], PEG-DTPA-Gd[8], HMD-DTPA-Gd及CHD-DTPA-Gd[9]. 以上药物分子量从五万到三十万不等, 均不同程度地表现出对组织器官如肝脏、肾脏、肺和脾脏等的选择性, 同时能相对较长时间内在血管中保持一定的浓度, 有利于血管造影. 由此可见, 具有更强的靶向性、溶解性、安全性及体内稳定性这些特点将是未来造影剂的发展趋势[10].靶向淋巴系统造影具有重要的医疗意义, 在临床实践中, 淋巴结转移是恶性肿瘤复发和致死的主要原因, 靶向淋巴造影技术可以作为淋巴结转移的早期鉴定手段, 对肿瘤的及时治疗起到了关键作用. 现阶段已实验于淋巴系统的磁共振造影剂如HSA-中国科学: 化学 2011年 第41卷 第11期1713DTPA-Gd [11, 12], 脂质体包裹的钆布醇[13]等, HSA- DTPA-Gd 是通过赖氨酸上的氨基与DTPA-Gd 缩合, 但是HAS(人血清白蛋白)分子量过大不易控制, 且难以保存. 脂质体包裹的钆布醇[13]可显示三级连续淋巴组织, 但是由于其稳定性较好, 体内不易代谢. 作为顺磁性标记物的常用大分子载体, 右旋糖酐(Dextran)具有较好的生物适应性和溶解性, 而且其分子粒径分布范围窄, 可以很好地控制分子的大小[14]. 以右旋糖酐为载体, 前人也完成了许多工作, Duarte 等[15]通过乙二胺将DTPA 与Dextran 连接, Rebizak 等[16]在合成过程中活化了Dextran, 再用二元胺连接DTPA, 并研究了不同长度的线型二元胺(NH 2(CH 2)n - NH 2, 2 ≤ n ≤ 6)对于弛豫度、代谢速率及毒性的影响, 以上的合成过程均较为复杂; Wang 等[17]使用Dextran-DTPA-Gd 于小鼠尾部静脉注射, 观测小鼠器官如脾脏、肝脏及肾脏的显影信号, 同比DTPA-Gd 具有更长时间的信号强度; Yan 等[18]用DTPA 的活性酯与Dextran 合成了Dextran-DTPA-Gd, 对比了不同取代度的Dextran 衍生物的弛豫性能, 并测定了对于海拉细胞的抑制活性, 证明了Dextran- DTPA-Gd 对于动物正常淋巴结及反应性增生淋巴结都具有比DTPA-Gd 更高的信号增强率.为了简化Dextran-DTPA-Gd 的合成过程, 本实验采用两种Dextran-DTPA-Gd 的合成方法, 通过改变反应条件确定了最佳方案, 最终获得具有较高钆含量和良好水溶性的Dextran-DTPA-Gd 造影剂; 通过粒度分析确定Dextran-DTPA-Gd 的粒径范围; 动物实验发现, 与钆喷酸葡胺注射液(Magnevist)相比较, 该显影剂可以选择性的进入家兔下肢淋巴管及腘窝淋巴结, 且信号强度增强明显, 具有较高的潜在应用价值.2 实验部分2.1 试剂与仪器二乙烯三胺五乙酸酸酐(cDTPAa)根据文献[19]合成, 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(阿拉丁试剂公司), 4-二甲氨基吡啶(DMAP)(阿拉丁试剂公司)二乙烯三胺五乙酸(DTPA)(阿拉丁试剂公司), 右旋糖酐40 (Dextran 40, M w = 32000~42000 Da, 青岛首和金海制药有限公司)均为分析纯试剂, 其中DMSO 使用前经过分子筛干燥处理. 钆喷酸葡胺注射液(Magnevist)由拜耳医药保健有限公司生产. GdCl 3溶液(0.347 mol/L)由Gd 2O 3加入浓HCl 加热搅拌至溶液澄清, 稀释定容以备用.英国Malvern 公司的3000HS 型电位粒度分析仪用于测试样品的分子粒径分布范围. 7500a 型电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)(美国Agilent 公司)测定目标产物Dextran-DTPA-Gd 中钆含量, 红外图谱由美国Thermo Nicolet 公司的Nexus 470型傅里叶变换红外光谱仪测定, 动物实验过程中采用美国GE 公司的超导型核磁共振扫描仪(3.0T Signa HDx)扫描完成动物的MR 图. 实验动物采用健康的成年雌性新西兰家兔(New Zealand white rabbit, 2.7~3.7 kg ).2.2 Dextran-DTPA-Gd 的制备方法一: 取右旋糖酐(Dextran) (1.01 g, 6.2 mmol), 二乙烯三胺五乙酸酸酐(cDTPAa) (3.00 g, 8.4 mmol), DMAP (0.15 g, 1.3 mmol)于250 mL 茄形瓶中, 注入DMSO (50 mL), 超声助溶至溶液呈无色透明, 50 ℃搅拌反应48 h. 滴入GdCl 3溶液(20.6 mL, 0.35 mol/L), 室温搅拌反应24 h, 再向反应液中加入去离子水(150 mL), 产生大量淡黄色絮状物, 用NaOH 溶液(1.0 mol/L)调节溶液pH 至溶液澄清, 使用DM27型透析袋(国药集团化学试剂有限公司)承装样品溶液, 用去离子水透析3 d, 期间每天换水4~6次. 取透析袋内溶液, 旋转蒸发浓缩至10 mL, 以备动物实验, 并通过ICP-MS 测定其Gd 含量.方法二: 将DTPA (0.37 g, 9.3 mmol) 溶于25 mL DMSO 中, 加热超声约1.5 h, 待溶液澄清后, 再加入DMAP (0.01 g, 0.1 mmol), EDC·HCl (0.20 g, 1.0 mmol), 30 ℃搅拌使其完全溶解, 在50 ℃条件下, 将以上反应液向溶解右旋糖酐(Dextran) (0.10 g, 0.6 mmol)的DMSO (6 mL)中逐滴加入, 继续搅拌反应 48 h. 在冰浴条件下, 向以上反应液中加入氯仿与乙醚的混合溶液(v/v 7:8), 直到产生白色絮状沉淀, 并继续搅拌2 h 直至沉淀不再增加, 抽滤后用氯仿乙醚混合溶液洗涤滤饼, 迅速将滤饼重新溶于20 mL 蒸馏水, CHCl 3洗涤1次. 在30 ℃条件下滴入GdCl 3溶液(5 mL, 0.342 mol/L), 搅拌反应24 h, 之后转移入DM27型透析袋, 用去离子水透析3 d, 期间每天换水4~6次. 取透析袋内溶液, 旋转蒸发浓缩至10 mL, 以备动物实验, 并通过ICP-MS 测定其Gd 含量.孙玥等: 靶向淋巴系统造影剂的制备及其动物实验17142.3 动物体内磁共振成像实验将用盐酸氯铵酮溶液(50 mg/kg)麻醉后的新西兰家兔仰卧位固定, 进行MRI 平扫: 3D Fast TOF-SPGRCE-MRA 序列扫描, Flip Angle 30°, TE 1.6 ms, TR4.5 ms, 视野280 × 280 mm, 矩阵360 × 224, 层厚1.0 mm, slah70, NEX2.平扫后于右脚第一、二、三趾蹼处皮内分别穿刺注射合成的高分子造影剂Dextran-DTPA-Gd (0.4 mL,3.96 mmol/L), 按摩30 s 后进行3D 增强扫描. 30 min后同样方法于左脚第一、二、三趾蹼皮内穿刺分别注入对照试剂钆喷酸葡胺注射液(0.4 mL, 0.50 mol/L), 按摩30 s 后行3D 增强扫描, 以获得三维图像. 增强扫描从注射后10 min 开始, 扫描间隔为10、15、20、25、30、40、50、60 min 以及24 h, 扫描序列的相关参数与平扫时一致.3 结果与讨论3.1 Dextran-DTPA-Gd 的制备制备Dextran-DTPA-Gd 的反应式如图1所示, 方法一中DTPA 脱水形成DTPA 酸酐(cDTPAa), 再与右旋糖酐在DMAP 的作用下缩合, 生成右旋糖酐的衍生物后, 加入Gd 3+形成螯合物; 方法二中, 用DTPA 代替DTPA 酸酐(cDTPAa), 使用DMAP 和EDC·HCl 为联合缩合剂, 与右旋糖酐反应, 生成右旋糖酐衍生物后, 再与Gd 3+形成螯合物. 两种方法均通过透析去除过量的小分子化合物, 包括未接合的DTPA 、过量的催化剂以及Gd 3+、Cl –等离子, 以纯化产品.透析结束后, 取透析袋内的溶液, 旋转蒸发浓 缩, 并通过ICP-MS 测定产物中的Gd%含量, 还可根据此值由公式Gd% ＝ 157.25/(162n ＋550.6) × 100%初步计算出平均每n 个糖单元接入一个DTPA-Gd. 由于动物实验证明, 当合成的样品其Gd%过小(约小于10%)时, 淋巴系统显影信号强度过低, 不足以分辨. 所以理想的产物的Gd%应足够高且水中溶解性良好. 通过不断改变反应条件, 得到了不同Gd 含量的样品, 如表1所示, 当Dextran 与DTPA 的反应比例为1:1.5, 反应温度和时间分别为50 ℃及48 h, 得到了Gd%含量高达16.1%的产物, 平均每2.6个糖单元上接有DTPA-Gd. 于前人工作相比，如Yan 等[18]用DTPA 的活性酯与Dextran 通过7 d 反应合成了Dextran-DTPA-Gd, 本实验节省了反应时间和成本.以上反应在操作过程中, 水分子含量的多少对反应结果影响较大, 因此需要选用严格干燥的试剂, 并且快速处理反应的中间产物, 防止其吸潮变粘稠. 方法一在透析之前, 需调节溶液pH 至溶液澄清, 此时溶液pH 与体液pH 相同(pH 7.4), 否则在透析过程图1 Dextran-DTPA-Gd 两种合成方法的路线示意图 表1 不同反应条件下的Dextran-DTPA-Gd 样品中的Gd 含量编号 催化剂Dextran:DTPA 反应温度 反应时间 Gd (%)糖单元数 1 DMAP 1:1.5 50 ℃ 24 h 5.5 14.3 2 DMAP 1:1.5 50 ℃ 48 h 10.5 5.9 3 DMAP 1:1.5 80 ℃ 24 h 9.4 7.0 4 DMAP 1:1.5 50 ℃ 72 h 3.5 24.7 5 DMAP 1:1 50 ℃ 48 h 6.0 12.76 DMAP, EDC ·HCl1:1.5 50 ℃ 48 h 16.1 2.6中国科学: 化学 2011年 第41卷 第11期1715中透析袋内易产生白色沉淀, 无法进行动物实验. 方法二的操作过程中, 是在水溶液中滴加GdCl 3溶液螯合, 之后直接透析, 始终为澄清溶液, 且溶液pH 与体液pH 相同(pH 7.4).在实验过程中, 方法一所得样品当其Gd%超过10%时, 溶液会出现白色絮状沉淀, 调节溶液pH 始终不退去. 由反应机理推论, DMSO 与DTPA 酸酐这样的亲电试剂组合, 可使DMSO 转变为活性锍盐, 这种活性锍盐易氧化右旋糖酐上的部分羟基成醛或酮, DMSO 则最终转化为二甲硫醚. 由此, 右旋糖酐衍生物中不能与水形成氢键的羟基一部分被氧化, 一部分直接与DTPA 形成酯键, 另一部分又参与同Gd 3+的直接吸附作用, 其溶解性随着能与水形成氢键的羟基的减少而减少. 方法二的操作过程中使用的是DTPA, 不易结合DMSO 使其成为锍盐, 因此该右旋糖酐衍生物上的羟基较前者多, 即使样品中Gd%含量高于方法一所得样品, 依然保持良好的溶解性，溶液始终澄清, 且pH 适宜(pH 7.4), 是靶向淋巴造影剂的理想产品.3.2 高分子配合物的FTIR 结构表征DTPA 酸酐与右旋糖酐的羟基形成酯键, 然后与过量Gd 3+螯合, 形成以高分子多糖为载体的DTPA- Gd 配合物. 图2 为DTPA (a), Dextran (b), Dextran- DTPA (c) 和Dextran-DTPA-Gd (d)的红外光谱图. 由图2可见, Dextran-DTPA (c) 及Dextran-DTPA-Gd (d)具有Dextran (b)的特征峰, 即1020 cm –1附近C –OH 伸缩振动吸收峰, 而且由于DTPA 与右旋糖酐的羟基图2 DTPA (a), Dextran (b), Dextran-DTPA (c) 以及Dextran- DTPA-Gd (d)的FTIR 谱图形成酯键, Dextran-DTPA (c)在1743及1153 cm –1处分别出现了C ＝O 及C –O 伸缩振动吸收峰, Dextran- DTPA-Gd (d)在1745cm –1及1154 cm –1处分别出现了C ＝O 及C –O 伸缩振动吸收峰. DTPA (a), Dextran- DTPA (c) 及Dextran-DTA-Gd (d)均具有1600及1400 cm –1附近的COO –反对称伸缩振动吸收峰和对称伸缩振动 峰, 且由于Gd 3+的配位作用对COO –的共振产生抑制, Dextran-DTPA-Gd (d)的COO –对称伸缩振动移到高波数1415 cm –1附近. 从以上分析可得出结论, 该高分子配合物已形成.3.3 高分子配合物的分子粒径表征图3为样品Dextran-DTPA-Gd 分子粒径分布图, 其分子粒径平均为130 nm, 分布范围为100~150 nm. 作为载体物质的右旋糖酐40, 分子量在32000~42000 Da, 通过控制共价结合的小分子螯合物的比例, 可以使其分子量达到50000 Da 左右, 测定其粒径分布正好与毛细淋巴管内皮细胞的开放裂隙(30~120 nm)相符, 而远远大于毛细血管孔径(4~5 nm), 大部分的高分子物质可以通过开放裂隙选择性地进入毛细淋巴管, 并吸收转运至淋巴结, 再被巨噬细胞吞噬及降解[20]. 由此, 该高分子造影剂选择淋巴系统的趋向性大幅度增强. 最终形成的Dextran-DTPA-Gd 具有粒径分布范围窄以及亲淋巴性的特性.3.4 动物体内磁共振成像实验结果使用合成的Dextran-DTPA-Gd (3.96 mmol/L) 及对照试剂钆喷酸葡胺注射液(Magnevist)(0.50 mol/L)分别注射入同一只家兔的右脚和左脚, 注射时间相隔30 min, 对比二者对腘窝淋巴系统靶向强化效果, 结果如图4(a)、(b)和(d)所示. 在另一只家兔的左右图3 Dextran-DTPA-Gd 的分子粒径分布图孙玥等: 靶向淋巴系统造影剂的制备及其动物实验1716脚同时注入合成的Dextran-DTPA-Gd(3.96 mmol/L), 结果如图4(c)所示.图4中, 通过比较图4(a)家兔左腿(右侧)与图4(b)家兔右腿(左侧), 二者均为注射相应的造影剂后30 min 的显影效果图, 图4(a)家兔左腿(右侧)血管显影清晰, 大量显影剂进入血管并代谢入膀胱, 腘窝淋巴结显影轻微; 图4(b)家兔右腿(左侧)中腘窝淋巴结及淋巴管显影清晰, 不存在血管显影. 说明合成的造影剂Dextran-DTPA-Gd 靶向性地进入了淋巴系统. 通过比较图4(a)与图4(c)的家兔双腿显影效果可以看出图4(c)家兔双侧的腘窝淋巴结及淋巴管走向, 进一步证明Dextran-DTPA-Gd 具有淋巴系统选择性, 并显示至第一级淋巴结(腘窝淋巴结), 而小分子的对照试剂钆喷酸葡胺注射液(Magnevist)不仅进入淋巴系统, 而且在血管中持续存在. 最后通过图4(d)表明, 注射后经过24 h, 家兔双腿的淋巴系统及血管显影均完全消失, 双侧趾蹼间显影也已消失. 说明钆喷酸葡胺注射液(Magnevist)及合成的Dextran-DTPA-Gd 在24 h 内均代谢完全. 综上所述，相比于钆喷酸葡胺注射液, 高分子物质Dextran-DTPA-Gd 不易入血管, 其体内代谢方式还有待进一步研究.通过不同时间段内测算淋巴信号强度率评价显影效果, 结果如图5所示. 采用兴趣区法测量[12]样品经皮下注射后, 增强前后不同序列图像上双侧腘窝淋巴结的信号强度(Signal Intensity of Lymph Node,图4 家兔腿部磁共振成像图(MRI) SI )和系统噪声(N ). 计算淋巴结的信噪比(SNR)及信号强度率(Enhancing Rate, E %), 公式为:SNR = SI /N , E % = (SNRpost SNRpre )/SNRpre × 100%上述公式中SNRpre 、SNRpost 分别代表平扫和增强扫描时腘窝淋巴结的信噪比. 用E%表示腘窝淋 巴结的强化程度. 可以看出Dextran-DTPA-Gd(图5(a))在浓度低于对照试剂钆喷酸葡胺注射液(图5(b))的情况下, 注射后34 min 达到最高值314%, 钆喷酸葡胺注射液(Magnevist)注射后20 min 到达最高值98%, 前者对淋巴系统信号强度的增加明显优于后者.4 结论利用两种方法合成了高分子造影剂Dextran- DTPA-Gd, 得出采用方法二能得到水溶性好、Gd 含量高、pH 适宜的产物. 通过不断优化, 最终确定了最佳反应条件为Dextran 与DTPA 的反应比例为1:1.5, 反应时间和温度分别为48 h 和50 ℃, 与前人工作相比, 极大地降低了反应成本, 减少了原材料的浪费. 根据粒径测定所得结果, 可见合成的Dextran-DTPA- Gd 分子粒径分布范围窄(100~150 nm), 粒径大小与毛细淋巴管内皮细胞的开放裂隙(30~120 nm)相符[20], 绝大部分造影剂进入毛细淋巴管, 并吸收转运至淋巴结, 既不会因为分子体积过大堵塞管道, 造成血液或淋巴液流通不畅, 也不会渗漏入组织液, 可以清晰地观察出淋巴液的引流方向. 动物实验表明, 绝大部分Dextran-DTPA-Gd 选择性进入淋巴管, 并转运至第一级淋巴结(腘窝淋巴结), 在Dextran-DTPA-Gd 中的Gd 浓度(3.96 mmol/L)低于对照试剂钆喷酸葡胺注射液(0.50 mol/L)的情况下, 前者依然保持了较高的图5 Dextran-DTPA-Gd(a)以及Magnevist(b)对于家兔腘窝淋巴结的信号增强率-时间图中国科学: 化学 2011年 第41卷 第11期1717信号强度, 然而持续显影时间均未超过24 h, 认为 可以通过加深探索其在淋巴系统的代谢过程, 进一步合成具有更长显影周期和可显影多级淋巴结的造影剂.致谢本工作得到科技部国际合作项目(2009DFA32080)和海洋局公益项目支持(201005024), 特此一并致谢.参考文献1 Lauterbur PC. 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The best reaction conditions were obtained by comparing the weight content of Gd and water-solubility of the products. The product with higher content by weight of Gd (16.1%) and good water-solubility was obtained and characterized by FTIR and particle size analysis (Size distribution ranged from 100 to 150 nm, 130 nm in average). In animal experiments, the MRI of Dextran-DTPA-Gd was evaluated in comparison with the MRI of Magnevist as positive control. The signal intensities of the regional lymphatic system were qualitatively assessed by the Time-Enhancing Rate curve. The results indicated that Dextran-DTPA-Gd obviously had higher signal enhancement (maximum enhancing rate to 314%) than that of Magnevist, and can be taken up selectively by lymphatic system and showed the potential as MRI contrast agents in lymphatic system as well.Keywords: Dextran, DTPA, Gd, macromolecular contrast agent, magnetic resonance imaging1718。