菌落总数测定方法作业指导书
水质 细菌总数测定作业指导书
水质细菌总数测定作业指导书1含义及执行标准1.1含义细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，于37℃培养24小时后，所生长细菌菌落的总数。
1.2方法原理平板计数法是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异养菌密度的方法。
因为细菌在水中能以单独个体、成双成对、链状、成簇等形式存在，而且没有任何单独一种培养基或一套物理、化学条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求。
所以，由此法所得的菌落数可能要低于真正存在的活细菌的总数。
1.3水环境质量标准表1-1 细菌总数地下水质量分类指标（GB/T 14848-93）表1-2 细菌总数生活饮用水卫生标准（GB 5749-2006）2分析方法2.1方法名称、方法来源和适用范围方法名称：平板计数法方法来源：《水和废水监测分析方法》(第四版)国家环保总局2002年第五篇第二章四方法适用范围：此法主要作为判定饮用水、水源水、地表水等污染程度的标志。
2.2仪器高压蒸汽灭菌器电热干燥箱恒温培养箱冰箱解剖镜。
采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。
2.3培养基营养琼脂培养基：市售营养琼脂培养基，按说明配制，装于三角烧瓶中，经121℃高压蒸汽灭菌15min，经无菌性检验和标准菌株检验后，贮存于暗处备用。
2.4分析步骤2.4.1 选择稀释度稀释度要选择适宜，以期在平皿上的菌落总数介于30～300之间。
大多数饮用水水样，未经稀释直接接种1mL，所得的菌落总数可适于计数。
2.4.2 水样的稀释方法①将水样用力振摇20～25次，使可能存在的细菌凝团成分散状。
②以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌水的试管中，混匀成1：100稀释液。
按同法依次稀释成1：1000、1：10000稀释液（稀释倍数按水样污浊程度而定）。
注意：吸取不同浓度的稀释液时，必须更换吸管。
2.4.3 操作方法①以无菌操作方法用1mL灭菌吸管吸取充分混匀的水样或2～3个适宜浓度的稀释水样1mL，注入灭菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。
北京饮料公司菌落总数检测作业指导书
北京饮料公司编号：SOP-009 版本号01 页码：1 / 10通过规范性的微生物检测方法来测试样品的微生物状况。
2.适用范围适用于原材料、蛋白或含乳饮料、凉茶植物饮料等成品和调配液、疑似微生物污染的样品的细菌总数的测定，以及净室内空气的微生物测试。
3.职责品控部负责本标准的制定，执行情况的监督及规范执行。
4.依据及参考标准GB 4789.2 食品安全国家标准食品微生物检验菌落总数测定SN/T 1059.3 进出口食品平板菌落计数滤膜法SN/T 1607 出口饮料中菌落总数、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌计算方法、疏水栅格滤膜法5.定义无6.正文6.1总要求6.1.1检验菌落总数的方法常用有平板计数法和薄膜过滤法。
6.1.2薄膜过滤法的微生物检测适用于较容易过滤的样品：原物料（如瓶胚、瓶、盖）、常规水（如RO水、调配水、设备和容器的最后冲洗水）、生产过程用水（如生产线的冲瓶水）、无菌水、无菌空气、棉签擦拭样品级可过滤的半成品、成品（如PET凉茶植物饮料）等，具体操作方法见《薄膜过滤法的微生物检测作业指导书》。
6.1.3 倒平板法适用于不可过滤的原辅料、蛋白或含乳饮料、凉茶植物饮料等成品和调配液、疑似微生物污染的样品的细菌总数的测定以及净室内空气的微生物测试。
6.2 设备及试剂干烤箱高压蒸汽灭菌锅恒温培养箱：36℃±1℃、55℃±1℃、30℃±1℃冰箱：2℃～5℃恒温水浴箱：47℃±1℃天平：感量0.1g无菌锥形瓶：容量为250mL、500mL 无菌培养皿：直径为90mm无菌试管 pH计或pH比色管或精密pH试纸放大镜或/和菌落计数器均质器振荡器无菌洗罐：1mL（具0.01mL刻度）、5mL(具0.1mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及其吸头无菌刀、剪刀、镊子等6.3 培养基和试剂6.3.1 所有培养基（购买型）必须根据制造商的说明进行制备和灭菌。
菌落总数检验作业指导书
A、以无菌操作取检样25ml于225ml灭菌生理盐水中，经充分振摇作成1：10的均匀稀释液。
B、用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇做成1：100的样品稀释液。
C、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释度，注意每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌吸管。
6.2.2生理盐水：(0.9%浓度)定量分装于锥形瓶或试管内。
6.2.3乙醇：（75%）
菌落总数检验作业指导书
6.3操作步骤：
6.3.1样品处理
6.3.1.1成品直接吸取5ml于灭菌平皿中；半成品、水样以无菌操作直接吸取1ml于灭菌平皿中；原材料、成品复检及一些可疑样品可以视污染情况作不同的稀释处理。
7.0相关文件
7.1《食品卫生微生物学检பைடு நூலகம்菌落总数测定》
8.0质量记录表单
无
E、若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。
F、若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
6.3.4菌落数的报告
菌落数在100以内时，按其实有数报告；大于100时用二位有效数字，在二位有效数字后的数字，以四舍五入方法计算。
6.3.2.2待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃生化培养箱内培养48±2h，取出计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得5ml或1ml检样中所含的细菌菌落总数。
6.3.3菌落计数
6.3.3.1平板菌落数的选择
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数计数标准。
6.3.3.2稀释度的选择
A、应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数，报告之。
水质细菌总数测定作业指导书
水质细菌总数测定作业指导书1含义及执行标准1.1含义细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，于37C培养24小时后，所生长细菌菌落的总数。
1.2方法原理平板计数法是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异养菌密度的方法。
因为细菌在水中能以单独个体、成双成对、链状、成簇等形式存在，而且没有任何单独一种培养基或一套物理、化学条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求。
所以，由此法所得的菌落数可能要低于真正存在的活细菌的总数。
1.3水环境质量标准表细菌总数生活饮用水卫生标准（）2分析方法2.1方法名称、方法来源和适用范围方法名称：平板计数法方法来源：《水和废水监测分析方法》（第四版）国家环保总局2002年第五篇第二章四方法适用范围：此法主要作为判定饮用水、水源水、地表水等污染程度的标志。
2.2仪器高压蒸汽灭菌器电热干燥箱恒温培养箱冰箱解剖镜。
采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121 C（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。
O QE 产览 2.3培养基营养琼脂培养基：市售营养琼脂培养基，按说明配制，装于三角烧瓶中，经121 C 高压蒸汽灭菌15min ，经无菌性检验和标准菌株检验后，贮存于暗处备用。
2.4分析步骤2.4.1选择稀释度稀释度要选择适宜，以期在平皿上的菌落总数介于 30〜300之间。
大多数饮用水水样，未经稀释直接接种1mL ,所得的菌落总数可适于计数。
2.4.2水样的稀释方法① 将水样用力振摇 20〜25次，使可能存在的细菌凝团成分散状。
② 以无菌操作方法吸取 1mL 充分混匀的水样，注入盛有 9mL 灭菌水的试管中，混匀 成1: 100稀释液。
按同法依次稀释成 1: 1000、1: 10000稀释液（稀释倍数按水样污浊程 度而定）。
注意：吸取不同浓度的稀释液时，必须更换吸管。
2.4.3操作方法① 以无菌操作方法用 1mL 灭菌吸管吸取充分混匀的水样或 2〜3个适宜浓度的稀释水 样1mL ，注入灭菌平皿中，倾注约 15mL 已融化并冷却到 45C 左右的营养琼脂培养基，并 立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。
菌落总数操作手册
菌落总数操作手册
一、概述
菌落总数是指在一定条件下生长的细菌菌落数，用于评估食品或环境的卫生质量。
本操作手册将详细介绍如何进行菌落总数检测，以确保实验结果的准确性和可靠性。
二、实验材料
1. 培养基：平板计数琼脂（PCA）
2. 试剂：无菌生理盐水
3. 器具：无菌棉签、无菌培养皿、无菌移液管（1mL）、天平、pH计、恒温培养箱、计时器、灭菌锅
三、实验步骤
1. 样品采集：使用无菌棉签采集适量样品，并放入无菌容器中。
对于液体样品，直接使用无菌移液管取样；对于固体或半固体样品，需将样品研磨或搅拌均匀后取样。
2. 样品稀释：将采集的样品进行稀释，使细菌能更好地在培养基上生长。
根据样品性质和预计菌落数，选择适当的稀释倍数。
一般采用10倍稀释法。
3. 制备平板：将PCA培养基加热融化后，冷却至45℃左右，倒入无菌培养皿中，每皿约15mL。
4. 接种样品：将稀释后的样品取1mL加入已制备好的平板中，用无菌玻璃棒均匀涂布在培养基上。
5. 培养：将培养皿倒置放入恒温培养箱中，在37℃下培养24-48小时。
6. 计数：计数平板上的菌落数，并记录结果。
根据实验要求，计算出样品中的菌落总数。
7. 结果报告：根据实验数据，撰写实验报告并向上级汇报检测结果。
四、注意事项
1. 实验前应保证所有器具和试剂的无菌状态，避免交叉污染。
2. 实验过程中要保持清洁卫生，避免人为误差。
菌落总数的测定方法
菌落总数的测定
配药品平板计数琼脂培养基，配0.85%生理盐水，将配好的培养基、生理盐水、培养皿、吸管、吸球，都用报纸包起来，放入灭菌锅中灭菌121℃15分钟，灭菌的同时，开紫外线照射灯20分钟，然后关闭操作之前先点燃酒精灯，用酒精棉擦手3遍，擦超净工作台3遍，最后用酒精棉过一下火，擦超净工作台一遍后，弃去棉球，然后从灭菌锅中取出物品，放在超净工作台中，开始操作，开始在超净工作台中吸取25ml样品，置盛有225ml灭菌生理盐水中，充分混匀，制成1:10的样品匀液，
用1ml无菌吸管吸取1:10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注入盛有9ml 生理盐水的无菌试管中制成1:100的样品匀液。
再用1ml无菌吸管吸取1:100的样品匀液1ml沿管壁缓慢注入盛有9ml生理盐水的无菌试管中制成1:1000的样品匀液。
每个稀释度1:10,1:100,1:1000都取1ml试样放入无菌培养皿然后逐个加入培养基，以铺满培养皿铺匀为止，然后摇匀，每个稀释度做两个平皿，同时做空白，空白只加琼脂，待琼脂凝固后，翻转平板，培养皿放入电热恒温培养箱36℃，培养48h±2h
检验人员：。
菌落总数的测定
菌落总数测定1.原理：菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分，培养温度和时间，PH，需氧性质等），所得1ml (g) 检样中所含菌落的总数。
本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在培养琼脂上生长的嗜中温性需氧的菌落总数。
菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
2.仪器设备与器具：参照大肠菌群的检测方法3.试剂：3.1细菌营养琼脂培养基配置：3.1.1称取31g营养琼脂培养基加入蒸馏水1000ml，摇动均匀。
3.1.2以棉塞或硅胶塞，牛皮纸包封瓶口。
3.1.3置于高压杀菌釜内，以121℃15分钟灭菌。
3.1.4取出培养基自然冷却至不烫手后（约45℃）备用。
3.2稀释液：参照大肠杆菌群测定标准4.测定方法：4.1检样稀释及培养：4.1.1以无菌操作作将检样25ml(g)放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1：10的均匀稀释液。
4．1．2用1ml灭菌吸管1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其它稀释液的试管理体制内，用定量移液器在试管内鼓励气三至四次使其混合均匀，作成1：100的稀释液。
4．1．3另取1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10售递增稀释液，每递增一次，换用一支1ml灭菌吸管。
4．1．4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选取二至三个适宜稀释度，分别在做10倍数递增的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做二个平皿。
4．1．5培养皿上分别注明样品编号，稀释度等。
4．1．6稀释液移入平皿后，注入冷却到46℃营养琼脂约15ml，水平徐徐振振摇，使培养基检液混合均匀后，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。
4．1．7待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃培养箱中培养48±2hr。
菌落总数测定作业指导书
菌落总数测定作业指导书1.0 目的规定菌落总数的测定方法。
2.0 范围适用于产品、原辅材料、流程卫生中菌落总数的检测。
3.0术语3.1菌落总数食品检样经过处理，在肯定条件下〔如培育基、培育温度和培育时间等〕培育后,所得每g 〔mL〕检样中形成的微生物菌落总数。
4.0 作业流程图见附录A5.0内容及要求5.1设备和材料除微生物试验室常规无菌及培育设备外，其他设备和材料如下：5.1.1恒温培育箱：36°C±仁C、30°C±「C5.1.2恒温水浴锅：46C±1C5.1.3天平：感量0.1g5.1.4均质器5.1.5无菌吸管：1mL 具0.01mL 刻度〕、10mL〔具0.1mL 刻度〕或微量移液器及吸头。
5.1.6无菌锥形瓶：容量250ml、500ml5.1.7无菌培育皿：直径90mm5.1.8菌落计数器5.1.9无菌玻璃珠：直径约5mm5.1.10无菌试管：18mrK 180mm5.2培育基和试剂5.2.1平板计数琼脂培育基。
522 75%乙醇溶液。
523 无菌生理盐水：称取8.5g 氯化钠溶于1000ml 蒸馏水中121C 高压灭菌15min。
5.3操作步骤5.3.1样品的稀释5.3.1.1固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min〜2 min，制成1:10 的样品匀液。
5.3.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 生理盐水的无菌锥形瓶〔瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠〕中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
5.3.1.3用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中〔留意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面〕，振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
5.3.1.4按5.3.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。
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N——样品中菌落数；
ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
示例：
稀释度
1:100（第一稀释度）
1:1000（第二稀释度）
菌落数
232，244
33，35
N=∑C/（n1+0.1n2）d
6.2.1 平板计数琼脂培养基。
6.2.2 75%乙醇溶液。
6.2.3 无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中121℃高压灭菌15min。
6.3 操作步骤
6.3.1 样品的稀释
6.3.1.1固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL 生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。
6.3.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
6.3.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.3.4.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
6.3.4.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
6.3.4.2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。
7.0相关文件
无
8.0 质量记录
8.1XXXXXXXXXXX《成品检测记录》
6.3.4.2 菌落总数的报告
6.3.4.2.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
6.3.4.2.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
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1.0目的
规定菌落总数的测定方法。
2.0范围
适用于加多宝凉茶、浓缩汁、原辅材料、流程卫生中菌落总数的检测。
3.0术语
3.1 菌落总数
食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。
6.3.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
6.3.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
6.3.4 结果与报告
4.0职责
质检部：负责按此方法对加多宝凉茶、浓缩汁、原辅材料、流程卫生中菌落总数进行检测。
5.0工作流程图
见附录A
6.0内容及要求
6.1 设备和材料
除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
6.1.1 恒温培养箱：36℃±1℃、55℃±1℃（必要时可选用）
6.1.2 冰箱：2℃—5℃
6.1.3 恒温水浴锅：46℃±1℃
6.3.1.4 按6.3.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。
6.3.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
6.3.3 菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
6.3.3.1选取菌落数在30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
6.3.1.6 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
6.3.2 培养
6.3.2.1 待琼脂凝固后将平板翻转，36℃±1 ℃培养48 h±2 或55℃±1 ℃培养48 h±2 。
6.3.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按6.3.2.1 条件进行培养。
6.3.4.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
6.3.4.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。
6.3.4.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
8.2XXXXXXXXXXX《成品微生物检验报告》
附录A：菌落总数检验程序
6.1.4 天平：感量0.1g
6.1.5 pH 计
6.1.6 无菌吸管：1ml（具0.01刻度）、5ml（具0.05刻度）、10ml（具0.1刻度）。
6.1.7 无菌锥形瓶：容量250ml、500ml
6.1.8 无菌试管：18×200mm
6.1.9无菌培养皿：直径90mm
6.1.10 放大镜
6.2 培养基和试剂
=（232+244+33+35）/（2+0.1×2）×10-2
=544/0.022
=24727
上述数据按6.3.4.2.2 数字修约后，表示为25000或2.5×104。
6.3.4.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
6.3.4.1 菌落总数的计算方法
6.3.4.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。
6.3.4.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：
N=∑C/（n1+0.1n2）d…………………………………（1）