实验二 植物组织培养2-愈伤组织的诱导
愈伤组织的诱导和培养
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223愈伤组织的诱导和培养一、实验目的及意义植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。
通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。
二、实验原理植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。
如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。
植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。
三、实验仪器与药品超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗四、实验步骤1.按下表分别配制培养基将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。
洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。
进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。
3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。
取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。
4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况五、实验结果组织长芽，而当生长素含量大于细胞分裂素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定根，也可形成愈伤组织，细胞色素沉淀情况严重；NAA为植物生长素，6-BA为细胞分裂素，促进扦插生根，而当细胞分裂素含量大于生长素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定芽，此次实验由于温度非形成愈伤组织的最适温度，所以未形成完整的愈伤组织细胞团。
植物组织培养实验报告
摘要：以大豆子叶为外植体，在MS 培养基上附加不同浓度、不同种类的植物激素，以研究不同激素组合和不同浓度对大豆子叶愈伤诱导率的影响，并练习无菌操作。
实验结果显示第 2 组即 MS+6-BA〔2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)和第 3 组即 MS+KT〔0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 培养基中愈伤组织诱导率较高，为较佳的愈伤组织诱导组合。
关键词：大豆；植物组织培养；无菌操作；愈伤组织1.1 实验材料：大豆子叶1.2 实验试剂与仪器〔1〕试剂： 75%酒精、MS 干粉、蔗糖、琼脂、植物生长调节剂〔NAA、2，4-D、KT、6-BA〕、无菌水、升汞、 NaOH 溶液〔2〕仪器：超菌净工作台、圆纸片、培养皿、封口膜、称量纸、千分之一天平、不锈钢杯子、移液枪、试管、高压灭菌锅、注射器、酒精灯、镊子、手术刀、搁置架、烧杯、电炉。
1.3 实验方法培养基的配制与灭菌1.3.1.1 配制培养基的准备阶段〔1〕准备 80 个培养试管及封口膜， 2 个小培养皿、 1 个大培养皿，用洗衣粉、自来水洗净，再用蒸馏水把每一个培养试管、润洗一下。
带晾干后将试管编号 1-80；〔2〕在称量纸上用百分之一天平分别称取 1.5g 琼脂 4 份， 7.5g 蔗糖 4 份，在烧杯里用千分之一天平上称取 1.185g MS 干粉 4 份〔烧杯不要清洗〕；〔3〕剪小圆纸片 40，均分在两个小培养皿小能从中自由取出为宜；剪大圆纸片10，均分在两个大培养皿中。
然后分别用报纸包好。
〔4〕把接种工具手术刀、镊子、剪刀等用报纸包好。
1.3.1.2 配制培养基〔1〕在装有 MS 干粉的烧杯中按下表参加植物生长调节剂实验所用的所有激素浓度均为 0.5mg/mL编号培养基配置激素的加样量(ml)6-BA N A A K T2,4-D1 23 4 MS+6-BA〔1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)MS+6-BA〔2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)MS+KT〔0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L)MS+KT〔1.0mg/L)+2,4-D(2.0mg/L)0.51.00.250.50.250.50.51.0〔2〕用量筒量取250ml 〔稍多〕蒸馏水，取一个不锈钢杯子参加150ml 蒸馏水和称量好的琼脂，在电炉子加热沸腾 2min，再参加混合好的 MS 培养基 1 号和蔗糖，混合沸腾 2min，用剩余的蒸馏水定容至 250ml；〔3〕当温度降到 60℃摆布时，将溶液 pH 调至 5.8，普通加 4 滴 NaOH 溶液即可；〔4〕取编号 1-20 的培养试管，用大量注射器以每瓶 12.5ml 摆布培养基分装在培养试管中，用封口膜封口， 4 支一捆捆扎好。
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验报告实验目的：本实验旨在探究水稻愈伤组织的诱导方法，为将来的水稻遗传改造研究提供参考。
实验材料和仪器：1. 材料：水稻种子、MS培养基、植物生长调节剂2,4-D、生长调节剂TDZ、无菌器具、琼脂、无菌操作室。
2. 仪器：无菌操作台、显微镜、实验室平衡器等。
实验步骤：1. 生物材料准备：选取幼苗期生长良好、品种鲜明的水稻种子作为材料。
将水稻种子进行表面消毒，处理方法为分别用70%的酒精和5%的次氯酸钠(1:1)混合消毒3-5分钟，然后充分清洗。
2. 建立组织培养体系：将消毒后的水稻种子在无菌操作台上进行分离培养。
将种子取出后，从胚乳中取出胚轴，用剪刀消毒后放入含有MS培养基的无菌培养瓶中，置于无菌操作室中进行培养。
在35-37°C下连续培养3-5天。
3. 筛选愈伤组织：将培养2-3天的胚轴等植物试管苗等组织放置在含有不同浓度的2,4-D和TDZ的培养基中，培养10-15天。
筛选出生长具有愈伤能力的组织，采用显微镜等方法进行观察，并进行相应的分离和培养。
4. 愈伤组织的维持和复壮：将筛选出的愈伤组织维持在含有2,4-D和TDZ的培养基中，定期进行转移或分离。
当愈伤组织增生至一定程度后，将其转移到不含激素的培养基中，进行复壮。
实验结果：在实验过程中，我们选择了4个不同浓度的2,4-D和TDZ进行培养，筛选出了愈伤组织，并进行了维持、修复工作。
经过5次转移和增殖培养，我们成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
结论：本实验采用的方法可行，成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
本研究为今后的水稻遗传改造和抗性育种提供了良好的基础。
植物的组织_实验报告
一、实验目的1. 熟悉植物组织培养的基本原理和操作技术。
2. 掌握无菌操作技术，学会配制培养基。
3. 学习诱导愈伤组织形成的方法，并观察其生长情况。
4. 了解植物细胞的全能性及其在组织培养中的应用。
二、实验原理植物组织培养是利用植物细胞的全能性，将植物的器官、组织或细胞在人工控制的条件下，诱导分化再生为完整植株的过程。
该实验主要包括以下几个步骤：外植体消毒、接种、愈伤组织诱导、再分化、生根、移栽等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：小麦幼苗、MS培养基、愈伤诱导培养基、生根培养基、消毒剂（如70%酒精、无菌水等）、消毒工具（如解剖刀、镊子等）。
2. 实验仪器：超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、显微镜、天平、烧杯、三角烧瓶、培养皿等。
四、实验步骤1. 外植体消毒：将小麦幼苗洗净，用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次。
用解剖刀将幼苗切成1-2mm的段，用无菌滤纸吸干水分。
2. 配制培养基：按照实验要求，配制MS培养基、愈伤诱导培养基和生根培养基。
将培养基分装到培养皿中，高压灭菌30分钟。
3. 接种：将消毒好的外植体接种到愈伤诱导培养基中，每皿接种3-5段，每个处理重复3次。
4. 愈伤组织诱导：将接种好的培养皿放入培养箱中，在适宜的温度（25-28℃）和光照条件下培养。
观察愈伤组织形成情况。
5. 再分化：当愈伤组织形成后，将愈伤组织转移到再分化培养基中。
在适宜的条件下培养，观察愈伤组织再分化为芽和根。
6. 生根：当芽和根形成后，将植株转移到生根培养基中。
在适宜的条件下培养，观察植株生根情况。
7. 移栽：当植株生根良好后，将其从培养皿中取出，用无菌水冲洗根部，然后移栽到土壤中。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织形成情况：实验结果表明，小麦幼苗在愈伤诱导培养基中能形成愈伤组织，愈伤组织生长旺盛。
2. 再分化情况：愈伤组织在再分化培养基中能分化出芽和根，再分化效果良好。
3. 生根情况：植株在生根培养基中生根良好，根长且粗壮。
愈伤组织实验报告
一、实验目的1. 掌握植物组织培养技术的基本操作流程。
2. 熟悉愈伤组织的诱导方法及再分化过程。
3. 学习植物激素在愈伤组织形成与再分化中的作用。
4. 了解植物细胞的全能性及组织培养技术在植物育种中的应用。
二、实验原理植物组织培养技术是将植物器官、组织或细胞在人工条件下进行无菌培养，使其在适宜的培养环境中生长、分化，最终形成完整植株的过程。
愈伤组织是植物组织培养过程中的一个重要阶段，它是由已经分化的细胞脱分化形成的无定形细胞团。
通过诱导愈伤组织，可以进一步分化为根、茎、叶等器官，实现植物繁殖和育种。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：水稻叶片、玉米叶片、胡萝卜根段。
2. 试剂：无菌水、无菌滤纸、70%乙醇、5%次氯酸钠、琼脂、蔗糖、硝酸钙、硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、生长素、细胞分裂素、琼脂酶、滤纸等。
四、实验步骤1. 材料预处理（1）将水稻叶片、玉米叶片、胡萝卜根段分别用70%乙醇消毒30秒，再用5%次氯酸钠消毒5分钟，最后用无菌水清洗3次。
（2）将消毒后的材料用无菌滤纸吸干水分。
2. 愈伤组织诱导（1）将预处理后的材料切成约1cm×1cm的小块，放入含有不同浓度生长素和细胞分裂素的MS培养基中。
（2）将培养皿放入培养箱中，在适宜的温度和光照条件下培养。
3. 愈伤组织再分化（1）将愈伤组织转移到含有不同浓度生长素和细胞分裂素的MS培养基中。
（2）在适宜的温度和光照条件下培养，观察愈伤组织分化为根、茎、叶等器官的情况。
4. 数据记录与分析（1）观察并记录愈伤组织的生长情况，包括生长速度、愈伤组织颜色、形态等。
（2）观察并记录愈伤组织再分化为根、茎、叶等器官的情况，包括器官形态、生长速度等。
（3）分析不同植物激素浓度对愈伤组织形成与再分化的影响。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织诱导实验结果表明，水稻叶片、玉米叶片、胡萝卜根段在含有不同浓度生长素和细胞分裂素的MS培养基中均能诱导出愈伤组织。
植物组织培养实验(2)
（二）实验原理
在一定的条件下，不同器官（根、茎、叶 等）来源的外植体均可以脱分化形成愈伤 组织。
（三）实验材料和用具
实验材料：黄瓜无菌苗 实验药品： MS、 1mg/ml NAA 、 1mg/ml 6-BA、
1mol/L HCl、1mol/L NaOH、蒸馏水、灯 用酒精、70％酒精、无菌水 。 灭菌培养基：MS1 （MS+1.0mg/LBA+0.5mg/L NAA）
实验用具：
天平、烧杯、玻璃棒、量筒、移液枪、三 角瓶、pH试纸、电炉、高压灭菌锅。
无菌室、无菌滤纸、无菌培养皿、烧杯、 解剖刀、镊子、剪刀、酒精灯、酒精棉花、 滴管、记号实验步骤
1. 配制以下培养基各100ml ： MS2：MS+2.0mg/LBA+0.1mg/L NAA MS3：MS+2.0mg/LBA+0.5mg/L NAA MS4：MS+2.0mg/LBA+2.0mg/L NAA ① 取200ml烧杯3只，标记，各加入4g MS培养基和
4. 接种 ① 进入无菌室，用70％乙醇擦洗双手和工作台面，点燃酒
精灯。 ② 解开三角瓶的绳子，将三角瓶按使用先后顺序排好。 ③ 再次消毒双手和工作台面，取出无菌滤纸，用无菌水润
湿。 ④ 在火焰边打开三角瓶的封口纸，烧灼瓶口和镊子，待镊
子冷却后取出无菌苗，放置在无菌滤纸上。 ⑤ 剪成5～10mm小段（根部去掉部分根尖，叶片去叶缘后
剪成50mm2左右的小片），每平皿接种3～5段（片）。 每组接种8瓶，根、茎段、茎尖、叶各2瓶。 ⑥ 光照培养箱25℃暗培养。
作业
1. 1周后观察培养体系有无污染，计算每一个平皿 内染菌外植体数和外植体外的菌落数，分析染 菌原因。
实验二愈伤组织的诱导与分化
实验二 愈伤组织的诱导与再分化一、目的掌握外植体的消毒方法和接种技术；了解愈伤组织诱导的过程及再分化。
二、原理以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养都能形成愈伤组织。
愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。
外植体如果是带菌的，在接种前都必须消毒。
对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。
三、实验材料水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；四、仪器设备及用具（一） 仪器设备超净工作台 培养室（二） 用具（每组5人用量）量筒：100ml ×2培养皿：￠9cm ×1三角瓶：50ml ×2(无菌)，1000ml ×1枪形镊：×4无菌滤纸：（10cm ×10cm ）×5五、试剂及培养基（一） 试剂75%酒精，2% NaCLO ，无菌水(每组1瓶400ml)(二) 培养基1、诱导培养基：N 6+2,4-D2mg/1+蔗糖30g/l+琼脂8g/l2、分化培养基：N 6+ CuSO 4·5H 2O 1.25mg/l+BA 2mg/l+NAA 1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l六、实验步骤1、接种室、培养基及用具表面消毒用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。
之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。
2、消毒剂的配制（1）、75%酒精：每组配95ml 。
量取95%酒精75ml ，加蒸馏水至95ml 即可.（2）、2%NaCLO ：每组配100ml.x ：应吸取的NaCLO 原液的毫升数；y ：NaCLO 原液的有效氯浓度。
3、种子去壳用自制的脱壳砂纸脱去谷壳，注意保持胚完整。
每人准备30粒去壳种子。
4、外植体消毒（以下工作在超净工作台内进行）将米粒放入50ml 无菌三角瓶→无菌水洗一次→弃水，倒入75%酒精，搅拌，30秒→弃酒精，倒入2% NaCLO ，不时搅拌，30分钟→弃NaCLO ，用无菌水洗3次，每次停留10.5%×100 yX= (ml)分钟→倒去无菌水，种子放在带无菌滤纸的培养皿中吸干。
生物培养植物实验报告
一、实验目的1. 了解植物组织培养的基本原理和操作方法；2. 掌握植物组织培养过程中无菌操作的技术；3. 学习植物愈伤组织的诱导和再分化方法；4. 观察植物细胞的全能性表现。
二、实验原理植物组织培养是将植物器官、组织或细胞在人工条件下，利用培养基提供必需的营养物质和生长因子，使其在无菌条件下生长、发育，甚至分化成完整植株的过程。
植物组织培养主要包括愈伤组织诱导和再分化两个阶段。
1. 愈伤组织诱导：将植物组织在适当的培养基上培养，使其脱分化形成无定形细胞团，即愈伤组织。
2. 再分化：将愈伤组织在特定培养基上培养，使其再分化形成具有特定形态和功能的器官，如根、茎、叶等。
三、实验材料与仪器1. 材料：豌豆种子、无菌水、无菌滤纸、无菌剪刀、无菌镊子、MS培养基、蔗糖、琼脂、2,4-D、6-BA、HgCl2（或次氯酸钠）。
2. 仪器：培养室、高压灭菌锅、水浴锅、解剖刀、三角烧瓶（100mL）、烧杯、量筒、培养皿、超净工作台、分析天平、长镊子、剪刀、橡皮筋等。
四、实验步骤1. 配制培养基（1）愈伤组织诱导培养基：MS培养基（蔗糖含量为10g/L，2,4-D含量为2mg/L，琼脂10g/L）。
（2）试验培养基：在MS培养基基础上，添加适量的蔗糖、2,4-D和6-BA。
2. 植物组织消毒将豌豆种子用无菌水冲洗干净，用70%乙醇浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次。
将消毒后的种子用无菌滤纸吸干水分，用无菌剪刀将种子切成小块。
3. 愈伤组织诱导将消毒后的豌豆种子小块接种到愈伤组织诱导培养基上，置于培养室中培养。
4. 再分化将愈伤组织接种到试验培养基上，置于培养室中培养。
5. 观察与记录定期观察愈伤组织的生长情况，记录愈伤组织的形态、颜色、大小等特征。
待愈伤组织分化出根、茎、叶等器官时，观察其生长状况。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织诱导在愈伤组织诱导培养基上，豌豆种子小块逐渐形成愈伤组织，愈伤组织呈白色、无定形，质地较软。
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中国海洋大学实验报告
2015 年 4 月23 日姓名###云年级BBB专业UUUUUU学号HHHHHHHHHHHH
课程细胞工程学实验题目植物愈伤组织诱导实验
一、实验目的
1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理；
2、掌握植物组织接种培养的整个无菌操作的过程；
3、熟悉超净工作台的使用。
二、实验原理
植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。
植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。
而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。
植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。
超净工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备。
三、实验仪器试剂
1、仪器：镊子、解剖刀、烧杯、酒精灯、试剂瓶、含有培养基的培养瓶、培养皿、金属盘、记号笔
2、用品：胡萝卜、75%酒精、10%次氯酸钠、无菌水
四、实验步骤：
（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。
（2）将植物体用准备好的自来水冲洗后,用酒精棉擦拭取材部位表面, 于70%酒精中浸沾数秒钟。
（3）将材料放入已灭菌的100ml试剂瓶中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。
（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。
（5）弃次氯酸钠浸泡液，用准备的无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。
（6）将已灭菌的植物材料置于平板内，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm 厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散。
（7）将瓶口和瓶盖在酒精灯火焰上方一过，拧紧瓶盖。
（8）在培养瓶下部的培养基高度位置作记号。
（9）将接种后的三角瓶，培养于25℃光照条件下20天左右.
（10）实验结束后用过的仪器等恢复原样，清洁实验台面，一切东西归位。
五、实验现象及结果
（1）
刚开始正常生长，从第二节实验课开始直至实验课结束，持续观察中发现组织块
没有生长，且在组织块边缘呈现浅黑色，倾斜培养瓶可以看到有少量稍浑浊的液体，说明组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败。
杂菌来源有细菌、真菌及其它微生物。
染菌原因可能是是接种材料(外植体)、培养基、接种器具带菌，或是操作人员接种不规范引起。
我认为在操作过程中由于操作不严谨受污染的可能性更大。
注意事项有：①实验开始时，进行常规无菌操作准备，酒精喷洒双手后用酒精棉擦拭桌面和实验器具；②实验过程中注意不交头接耳，避免口中呼出的空气污染实验材料；
③点燃酒精灯，且不要离的太远；④培养瓶瓶口过火焰等。
（2）
成活率为44.44%。
被污染的培养瓶中有的长满了真菌，所有组织块被深色网状菌丝覆盖，随着时间越来越久颜色愈来愈深；倾斜培养瓶发现液体浑浊染菌；且组织块在之后的培养中并没有生长现象。
没有被污染的培养瓶倾斜可以看到有非常澄清的少许液体，在组织块边缘有仿佛被水浸泡后的白色物质，即生长出来的愈伤组织慢慢变大。
六、思考题
你如何认识无菌操作对植物组织培养的重要性？你认为在具体操作时还应注意那些事项？答：无菌操作对植物组织培养视十分重要的。
因为植物组织培养基可以供给植物细胞的生长，同样也可以供给微生物细胞的生长，操作时稍不小心就引起杂菌污染，细菌繁殖能力比植物细胞强，会争夺培养基内的营养使得组织不能正常生长分化，即实验失败。
在具体操作的过程中要注意：
1.实验前熟悉操作流程；
2.在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；
3.接种员先洗净双手，换好专用实验服等；
4.上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，然后搽拭工作台面、接种工具，再将镊子和剪
刀从头至尾过火一遍；
5.接种时，接种员双手不能离开工作台，酒精灯不能离太远，不能说话、走动和咳嗽
等；
6.要避免将植物组织损伤，要保持植物组织特别是分生组织的完整；
7.要将次氯酸钠从组织块表面冲洗干净；
8.接种完毕后要清理干净工作台。