植物组织培养实验报告

院(系、部) 化学与生物工程学院专业生物技术（师范）年级13级学号17130208 姓名组别第二组课程名称植物细胞工程学实验日期2016.3-6指导老师实验名称植物组织培养综合实验一、实验目的1.熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法2.学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法；3.掌握超净工作台上的接种方法与注意事项，了解接种室的灭菌方法；4.了解组织培养的基本程序；5.掌握接种的方法和材料的培养过程；6.掌握无菌操作技术，包括外植体除菌和接种技术；7.观察外植体的生长状况、染菌状况，剔除染菌外植体；8.了解MS培养基和1/2MS培养基的区别二、实验原理1.植物细胞的全能性一切植物都由细胞构成，细胞是构成植物体的基本结构与功能单位。

植物细胞含有全套遗传信息，具有形成完整植物的潜能。

2.植物细胞表现出全能性的条件1.离体状态；2.有一定的营养物质，激素和其他外界条件（无菌、温度、pH）；3.选择性能优良、细胞全能性表达充分的基因型3.无菌条件把植物的组织、器官等，使其在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖。

用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。

在组培中外植体都死带菌的，在接种前必须进行表面消毒，这时取得培养成功的最基本和重要的前体。

组织培养的主要过程都是在无菌条件下进行的，所以所有的器材、植物体、接种室都应是无菌的。

4.脱分化与愈伤组织已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化形态，转变为具有分生能力的胚细胞的过程称为脱分化。

脱分化所用的化学物质与MS培养基的区别是需要激素诱导。

所以脱分化培养需在MS培养基上添加激素进行愈伤组织诱导。

5.培养基植物组织培养常用的培养基为MS培养基。

常用的凝固剂是琼脂,它的主要作用是使液体培养基凝固，琼脂本身并不提供任何营养，它只是一种高分予的碳水物从海藻中提取出来，仅溶解于热水，成为溶胶，冷却后(40℃以下)即凝固为固体状凝胶。

琼脂的用量一般在4—10克／升之间。

琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力，存放时间过久，琼脂变褐，也会逐失去凝固能力。

MS培养基属于富盐平衡培养基，特点是：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，因而在培养的过程中可维持较好的稳定性；营养丰富，在一般培养中无须额外加入复杂的有机成分；微量元素种类全，浓度高。

这类培养基是目前使用最广泛的培养基。

6.生长调节物质包括天然植物激素额人工激素类似物。

植物激素是一类植物自身合成、同时对其生长发育具有重要调节作用的有机化合物。

生长调节物质对于离题培养中的细胞分裂分化、器官形成和个体再生等均起着重要而明显的调节作用。

一般来说，基本培养基只能保证培养物的生存，维持其最低的生理活动，而只有植物激素的配合使用，才能完成离体培养物中按照需要设计的各个调节环节。

常用的植物组培激素种类主要有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素。

1)生长素的生理作用主要是促进细胞分裂和生长，有利于外植体脱分化并启动细胞分裂，有利于形成愈伤组织。

同时生长素和细胞分裂素的协调作用，对于培养物的形态建立十分必要。

在离体培养的分化调节中，生长素促进不定根的形成而抑制不定芽的发生。

在液体培养中，生长素还有利于体细胞胚胎发生。

常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、奈乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2，4-D）和吲哚丁酸（IBA）等。

在使用2，4-D时，必须严格控制使用浓度和培养时期，因为高浓度的2，4-D常常抑制器官的发生，在分化培养时不能使用2，4-D代替其他生长素。

2)细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂，调节器官分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成等。

此外，它还能显着改善其他激素。

离体培养中，细胞分裂素能够促进不定芽的发生，与生长素协调使用能有效调控培养物的生长与分化。

常用的细胞分裂素包括6-卞基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、异戊烯氨基嘌呤（2ip）、玉米素（ZT）等。

3)赤霉素（GA）是一类广泛存在于植物体内的激素，目前已发现的天然赤霉素有20多种。

自然界植物体内的赤霉素具有促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠及诱导单性结实等生理功能。

在离体培养条件下，赤霉素的主要作用时促进细胞伸长生长，与生长素协同作用对形成层的分化具有一定影响，同时还能刺激体细胞胚进一步发育成植株。

三、实验材料、试剂和仪器设备1.植物材料：马齿苋、番茄种子诱导的无菌苗、外植体（盘龙参、波斯菊、金叶女贞、黄花苜蓿、菊花、香樟、杜鹃、月季）2.实验药品（试剂）：甲醛、MS培养基母液（见表1）、蔗糖、琼脂、1%升汞、酒精（75%和90%）、NaOH、HCl、6-BA、NNA、无菌水；3.仪器设备和实验用具：高压灭菌锅、天平、pH计、超净工作台、电炉、酒精灯、镊子、解剖刀、剪刀、烧杯、培养瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、广口试剂瓶、牛皮纸、滤纸、培养皿、药勺、支架、打火机等。

四、实验步骤(一)培养基母液的配制(2016/3/4)表11)每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，定容。

2)贮备液III需加热溶解。

混合后调至pH5.5，定容，保存在棕色玻璃瓶内。

3)6-BA：1 mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。

NAA：1 mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。

4)各种母液配制完成后，分别用玻璃瓶贮存，贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，放入冰箱冷藏室保存。

一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。

2.其他试剂的配置1) 1 mol/L 的NaOH：1瓶2) 1 mol/LHCL ：1瓶3)0.1%的升汞或2%次氯酸钠：每个超净工作台一瓶（用时处理5-30min)4)70~75%酒精：每个超净工作台一瓶5)95%酒精：每个超净工作台一瓶6)75%酒精棉球：每个超净工作台一瓶(二)培养基的配制与灭菌1.培养基配制1)配制培养液（MS培养液）：按每次配制500 mL培养基计，用量筒或者移液管从各种母液中分别取出贮备液I 25 mL、贮备液II、Ⅲ、Ⅳ各5 mL；2)溶化琼脂：用粗天平分别称取5g琼脂、15g蔗糖放入500 mL搪瓷缸中，加入蒸馏水400mL，用用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。

然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至500 mL，搅拌均匀。

3)调pH：用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸（5.4～7.0）测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止（培养基的pH必须严格控制在5.8）。

4)培养基的分装? 溶化的培养基应该趁热分装。

分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入组培瓶（50 mL或100 mL）中。

注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。

组培瓶中培养基的量约50 mL 。

每500 mL培养基，可分装10～15瓶。

5)培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。

最后在组培瓶外壁贴上标签。

2.培养基灭菌（高压灭菌）1)放培养瓶。

将装有培养基的培养瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。

如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。

2)放置其他需要灭菌的物品。

将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶（以上物品都要用牛皮纸封口），用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。

3)待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。

在98 kPa、121.3 ℃下，灭菌20 min。

灭菌后取出培养瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。

最好放置1 d后再使用。

3.其他灭菌1)不耐热的物质将采用过滤灭菌如赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素等。

过滤灭菌的原理：溶液通过滤膜后，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。

2)玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌即利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀灭微生物。

3)用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌(三)接种室和超净工作台的灭菌处理1.接种室熏蒸灭菌长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。

方法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。

甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。

室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。

几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。

高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。

甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作。

甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。

因此，可在使用前用氨进行中和。

取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。

使用氨水应在工作前2小时进行。

对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸2.准备组培室将组培室打扫干净，调至适宜温度3.超净工作台处理1)材料准备用75%酒精擦拭，准备好超净工作台内物品，包括酒精棉球、75%和90%酒精、废液缸、打火机、酒精灯、支架、镊子、解剖刀、解剖剪等2)灭菌处理实验开始前先用75%酒精擦拭工作台面，然后开启紫外灯，紫外照射20min-30min。

关闭紫外灯，开启风机10min后打开日光灯。

用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。

试验用具也应该用酒精消毒。

点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。

注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。

金属器械不能过度灼烧，以防退火。

移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。

(四)无菌苗的培养(2016/3/11)1.培养基配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）种子的萌发采用1/2MS培养基2.马齿苋（番茄）种子处理1)洗去浮尘和上漂的种子，挑选饱满种子，置于培养瓶中流水冲洗30min后倒掉水备用；2)将种子置于培养瓶中，用75%酒精消毒灭菌30~60s，用无菌水冲洗干净；3)用1%升汞处理8~10min，然后用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌接种器械进行分离接种。

3.接种及培养1)用酒精擦洗工作台和手，对接种器具进行灼烧灭菌；2)打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子（90%酒精浸泡并灼烧）将培养材料置于培养基上，灼烧瓶口，盖上瓶塞。

3)培养瓶贴上标签，做好标记，然后放到光照培养箱中或培养室培养架上进行培养，条件为2000-3000LX，26±1℃，培养一周。