冰冻切片 免疫荧光组化
切片、免疫组化步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤速冻组织将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。
也可根据需要选择其它的固定方式。
PBS洗，5分钟×3。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×3。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。
石蜡切片免疫组化染色步骤三步法（以SP试剂盒为例）1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。
4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
7. PBS冲洗，2分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
9. PBS冲洗，2分钟×3次。
10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）1. 石蜡切片脱蜡至水。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤一、前言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
本文将详细介绍这些步骤。
二、样品处理1. 采集样品首先需要采集需要检测的样品。
比较常见的样品包括动物或人类组织、细胞培养物等。
2. 固定样品采集好的组织或细胞需要进行固定处理，保证其形态和结构不受损伤。
固定处理一般使用4%多聚甲醛或4%乙醛进行。
3. 脱水处理为了使样品更易于切割，需要对其进行脱水处理。
脱水处理可以通过将固定好的组织或细胞分别浸泡在70%、80%和95%乙醇中进行。
4. 包埋处理最后，将脱水后的样品进行包埋处理，即将其置于石蜡中，并逐渐加热至60℃以上，直到石蜡完全浸透到样品中。
三、切片1. 制备切片将包埋好的样品切成5-10微米厚的切片。
这一步需要使用专业的冰冻切片机进行，确保切片质量。
2. 将切片悬浮在载玻片上将制备好的切片悬浮在载玻片上，并进行干燥处理。
这一步需要注意，避免样品受到外界污染。
四、抗体染色1. 抗原修复为了提高抗体的结合效率，需要对样品进行抗原修复处理。
这一步可以通过加热或酶解等方式实现。
2. 阻断非特异性结合为了避免非特异性结合，需要在抗体染色前对样品进行阻断处理。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白和小鼠IgG等。
3. 抗体染色将已经稀释好的一抗和二抗依次加入到载玻片上，并进行孵育处理。
这一步需要注意控制反应时间和温度等因素。
4. 显色与荧光显微镜观察最后，通过加入显色剂或荧光染料实现蛋白质的可视化。
观察过程需要使用荧光显微镜进行。
五、总结冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
在实验过程中，需要注意控制反应时间和温度等因素，以确保实验结果的准确性。
冰冻切片免疫荧光间接法实验
实验报告3.因为相同种属的一抗具有相同的同种型抗原表位，因此一种与一抗不同种属的二抗可以结合多种一抗。
间接法荧光标记一方面节省标记成本，提高通用性；另一方面提高灵敏性，使信号更强。
但容易出现非特异染色，所以要用用与二抗同种的正常血清或白蛋白与组织孵育，封闭非特异位点。
4.注意：1）一抗和二抗是不同种属来源的抗体。
2）标记二抗与一抗必须是同一类（通常用的是抗人IgG）分、均匀，同时降低非特异结合或吸附）。
3）反应后用PBS洗3次，每次5分钟。
4）在冰浴中预先用0.1MPBS 配制荧光标记二抗。
5）切片甩干，擦去多余PBS。
滴加适量的二抗，盖好湿盒。
于37℃恒温培养箱孵育2小时。
注意加二抗过程及孵育过程中避光。
6）为更好显示细胞结构，一般用蓝色DAPI衬染，以确定所检测抗原的位置。
DAPI分装后，一般用锡纸包裹避光，-20℃保存，用时提前取出解冻。
7）在二抗孵育结束前8分钟，取出湿盒，滴加荧光染料DAPI，吹吸混匀，盖好湿盒。
于37℃继续孵育8分钟。
注意实验过程中避光。
8）二抗孵育结束后取出切片置于染缸中，0.01M pH7.4PBS浸泡。
9）置于37℃摇床中摇洗三次，每次15分钟。
摇床转速一般每分钟100转，摇洗过程注意避光。
4.封片1）免疫荧光技术常用封片剂：缓冲甘油封片剂。
2）将浸洗好的切片甩干，擦去多余水分。
滴加甘油封片剂，轻轻盖上盖玻片，防止出现气泡。
待干燥后在盖玻片周围涂指甲油封边5.镜下观察立即用荧光显微镜观察。
注意：一般标本在高压汞灯下照射超过3分钟，就有荧光减弱现象。
经荧光染色的标本最好在当天观察，随时间延长，荧光强度会逐渐下降。
冰冻切片免疫组化
冰冻切片免疫组化步骤
1.从-20°取出片子平衡到室温
2.PBS洗2min 3遍
3.0.3%H2O2 10min（避光）--用PBS将30% H2O2稀释100倍
4.PBS洗2min 3遍
5.10%FBS封闭30-60min（室温）；可以配置10%FBS约10ml，用PBS稀释
6.一抗（10%FBS配置），60min，室温孵育（注意封闭后不用洗！）
7.PBS洗2min 3遍
8.1‰链霉素（带HRP）30min 室温孵育，同样链霉素用10%FBS稀释；若为二抗则也是
用10%FBS稀释，接着孵育半小时。
9.PBS洗2min 3遍
10.将玻片擦拭干净，带组织部分保持湿润，DAB显色（bufferA 1ml + bufferB 1滴），用1ml
枪加在载玻片后，进行镜下观察，待特异性蛋白显色适当时，用PBS洗去DAB。
11.苏木素2min （待染色效果改变颜色）
12.1‰盐酸乙醇分化（迅速刷三次）
13.PBS水中洗净有机溶剂
14.75%、80%、95%、100%酒精脱水
15.二甲苯2min
16.二甲苯2min
17.中性树脂封片
Ps:盖玻片先用盐酸乙醇刷一下，然后用水洗干净，最后泡在二甲苯里，在封片前用无尘纸头擦干净，再封片。
说明一抗配置，如果一抗为100ug（RD）则可以加入100ul的pbs，使浓度在1ug/ul，同时分装抗体。
冰冻切片的免疫组化染色步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤
1.准备工作：
（1）准备正常组织冰冻切片，使用离心切片机将原有组织材料切成
5-10μm厚的片层，切片后立即放入凝胶剂（如冰冻液中的季铵盐）内，
紧急冷冻到-20℃；
（2）准备石蜡糊，将石蜡熔解并加入一定量的溶剂使其至流体状态；
（3）准备免疫染色的药品，比如羊抗体、抗原标记物（Biotinimidazole）、Streptavidin-HRP（HorseradishPeroxidase）等。
（1）将冰冻切片浸入石蜡糊中进行热融化处理，处理完毕后将其放
置于待用；
（2）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用70％乙醇清洗，然后放
入PBS小规模洗涤，然后用清洗液（清水）浇上，以去除表面的乙醇；
（3）将冰冻切片浸泡在去除组织胶多聚体液中，液体里溶解蛋白质
类多聚体，以防止抗体与冰冻切片上的组织胶多聚体结合；
（4）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用于抗体的定量涂布，将
抗体与切片表面的抗原结合；
（5）在抗体涂布完毕后，将冰冻切片置于含有PBS溶液的室温下供
2小时以上，使抗体能够与冰冻切片上的抗原结合；
（6）将冰冻切片从室温溶液中取出，放入冰冻液中，将表面的多余
抗体冲洗掉；。
冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4C过夜后，OCT 包埋。
-20C保存3月，-80C长期保存。
请勿保存于液氮。
2, 冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后，-20C储存3，切片从-20 取出后，在通风橱放10-30 分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20 C 丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS 清洗玻片, 3X5min 从此请保持玻片湿润5, 有时,抗原修复3 小时会得到更好的结果。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压•微波修复•高压修复•隔水加热•电炉加热）… 关注修复的温度 ,时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间）,抗原修复液必须遵循自然降温规律, 使用足量的抗原修复液… 选择不同PH 值的修复液（A 液枸盐酸缓冲液PH6.0, B 液EDTA-Na缓冲液PH8.0, C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6, 室温封闭1 小时封闭液：5%BSA+1 0%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in IxPBS （细胞因子,无需封闭的蛋白7, 一抗4C过夜请用封闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyelight ）in 封闭液，避光室温1 小时10, Wash,1XPBS, 3x5min11, DAPI 染核5min，12，DDW Rinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14,干片后4C保存石蜡切片的免疫荧光1 ，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤），制成石蜡包块2,组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,切片复水：58 °C 20mi n-xylene 2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-, DDW5min4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润5，抗原修复过夜。
冰冻切片免疫组化流程
冰冻切片免疫组化流程冰冻切片免疫组化听起来就很厉害的样子呢！其实呀，这个流程还挺有趣的哦。
一、切片准备。
咱们先得有冰冻切片呀。
这切片可得小心对待呢。
一般从冰箱里拿出来的时候，要赶紧放到合适的环境下，可不能让它在不合适的温度里待太久啦，不然它可能就会变得不那么听话了。
这个切片的厚度也是有讲究的哦，太薄了可能会丢失一些重要的信息，太厚了又可能会影响后面的操作。
就像我们穿衣服，太薄了冷，太厚了又热得难受呢。
二、固定。
三、通透。
通透这一步也很关键呢。
它就像是给切片开一些小通道，让后面我们加进去的各种试剂能够顺利地进去和切片里的东西打交道。
这就好比是我们要去一个神秘的城堡，得先找到进入城堡的通道一样。
如果通透没做好，那些试剂就只能在外面干着急，进不去，就没办法完成它们的使命啦。
四、封闭。
封闭就像是给切片做一个保护罩，同时又能把那些不需要的干扰因素给排除掉。
就像我们在一个嘈杂的环境里，戴上隔音耳罩，只让我们想听的声音进来。
如果封闭没做好，可能就会有一些乱七八糟的东西来干扰我们的检测，就像在听音乐的时候有很多噪音一样讨厌。
五、一抗孵育。
然后就是一抗孵育啦。
一抗就像是我们派去寻找目标的小侦探。
我们把一抗加到切片上，让它在切片里到处找我们想要检测的东西。
这个过程就像是小侦探在城堡里寻找宝藏一样，得给它足够的时间和合适的环境，这样它才能把宝藏找出来哦。
六、洗涤。
洗涤这一步可不能小看呢。
就像我们每天都要洗脸刷牙一样，切片也需要清洗干净。
把那些没有结合的一抗或者其他杂质都洗掉，这样才能让后面的步骤顺利进行。
要是不洗干净，就像脸没洗干净就出门，总是感觉脏脏的，而且会影响后面的检测结果呢。
七、二抗孵育。
八、再次洗涤。
又要洗涤啦，还是和之前一样，要把多余的东西都洗掉，让切片清清爽爽的。
九、显色。
最后就是显色这一步啦。
这就像是把我们找到的宝藏展现出来一样。
通过显色，我们就能看到我们想要检测的东西在切片上的位置啦。
这个时候就像是我们的努力有了成果，看到那些颜色出现，心里还挺有成就感的呢。
冰冻切片漂片
免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）免疫组化步骤：1.将脑片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；2.吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4.然后，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃；5.然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6.DAB配方为：10mgDAB固体加到20ml0.01MPBS，临用时加100-200微升30%双氧水，注意避光。
7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。
一般3分钟显色就比较明显，如果20分钟仍未显色，则看下面的参考。
8.然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。
干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。
9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。
如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。
免疫荧光步骤及注意事项：1，将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）2，吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3，然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48或72小时；5，然后，PBS洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。
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冰冻切片免疫荧光组化
冰冻切片和免疫荧光组化技术是生命科学中广泛应用的技术。
以
下是两种技术的简介：
1. 冰冻切片技术：冰冻切片是把组织或细胞快速冻结并切成薄
片的技术。
不同于石蜡包埋技术，冰冻切片不需要前期的化学处理和
固定，具有样品保留完整活性、切片速度快、质量高等优点。
冰冻切
片广泛应用于免疫荧光组化、原位杂交、基因组学等技术中。
2. 免疫荧光组化技术：免疫荧光组化技术是一种利用特异性抗
体对目标分子进行标记和检测的技术。
该技术在机体免疫学、病毒学、肿瘤学和神经科学等领域广泛应用，可用于检测病毒、肿瘤标志物、
蛋白质表达、分子相互作用等。
通过将免疫球蛋白标记荧光染料或酶
标记物质后，通过显微镜或荧光显微镜观察样品上的染色，并进行分析。
该技术具有灵敏、特异、可视化等优点，已成为生命科学研究中
必不可少的技术之一。