乙肝病毒核酸检测实验操作流程
乙肝病毒核酸定量SOP
1、目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。
2、原理本试剂盒采用乙型肝炎病毒(HBV)-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA,利用针对乙型肝炎病毒(HBV)核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒(HBV) DNA的定量检测。
整个试验过程无须单独提取样本中的DNA，只需将血清或血浆样本直接加入PCR反应管中与乙型肝炎病毒(HBV) -核酸释放剂充分混合即可作为PCR扩增的模板，避免了常规样本核酸提取过程中的环境污染。
PCR检测体系含有UNG酶+dUTP防污染措施，将可能的产物污染充分降解，避免假阳性结果。
PCR检测体系含有阳性内对照（乙型肝炎病毒（HBV）内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。
PCR检测体系含有内参比荧光ROX，用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参比荧光ROX的比值，使定量更准确。
3、试剂保存及有效期试剂应避光密闭保存于-20±5℃。
试剂盒有效期为12个月，避免反复冻融。
采用泡沫加冰运输5天不会影响产品效期。
4、样本要求4.1. 适用样本类型:血清或血浆样本。
4.2. 样本采集:4.2.1 血清样本采集:用无菌注射器抽取受检者静脉血2ml, 注入无菌收集管，室温不超过4小时，待样本自行析出血清，或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血清，转移到1.5ml灭菌离心管中备用；4.2.2血浆样本采集:用无菌注射器抽取受检者静脉血2ml,注入含有EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的无菌收集管，立即轻轻颠倒混匀，室温不超过4小时，待样本自行析出血浆，或直接1600pm离心5分钟分离出血浆，转移到1.5ml灭菌离心管中备用。
HBVDNA核酸扩增及产物分析标准操作程序
HBV-DNA核酸扩增及产物分析标准操作程序一、目的：规范实验室操作，正确使用ABI-5700荧光定量PCR仪进行HBV-DNA扩增分析，以保证实验结果的准确性。
二、适用范围：乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒、ABI-5700荧光定量PCR仪。
三、职责：由临床基因扩增检验实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：1、PCR扩增1）打开稳压器电源，再打开计算机电源。
2）打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
3）将循环条件设定为4）检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
5）将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中设定好反应孔位置。
6）关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。
7）扩增结束后先保存结果，再关闭扩增仪电源，取出PCR 反应管，密封放入垃圾桶。
2、产物分析1）基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。
2）阈值的设定：原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
3）对照标准：阳性对照参控品的Ct值应小于28，标准曲线的拟和度应大于等于0.990，否则视为定量结果无效；阴性、空白对照的扩增曲线应平坦，Ct值等于30或0，否则结果无效。
4）结果判断：检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。
5）填写检验记录，关闭计算机。
此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。
乙肝病毒DNA检测Microsoft Word 文档
乙肝病毒DNA检测乙肝病毒DNA指的是脱氧核糖核酸，病毒的复制是靠DNA的复制来完成的，DNA的浓度越高，病毒的复制越活跃。
合起来，HBV-DNA指的就是乙肝病毒的脱氧核糖核酸。
乙肝病毒DNA检测是判断乙肝病毒复制的常用手段。
一般的，把数值大于10的3次方为阳性，把3-5次方认为是低量复制，5-7为中等量，大于7次方为大量。
乙肝两对半并不能准确的判断病毒复制情况，DNA弥补了这个的不足。
不过由于DNA检测技术要求严格，容易受到干扰，因此，一次结果不足以说明问题，遇到阳性，可以换医院再次检查。
目录1DNA检测2作用3临床意义4复制过程▪第一步：黏附▪第二步:脱壳▪第三步：入核▪第四步：转录▪第五步：翻译▪第六步：逆转录▪第七步：组装5频率6注意事项7检测方法8检测报告9检测费用10检测要空腹吗11乙肝病毒DNA检测的作用1DNA检测以往乙肝患者抗病毒治疗的指征是：乙肝病毒e抗原阳性（大三阳）患者HBVDNA数值要求达到10的5次方拷贝/毫升（20000U/ml），乙肝病毒e抗原阴性（小三阳）患者乙肝病毒DNA数值要求达到10的4次方拷贝/毫升（2000U/ml），但是10的4次方拷贝/毫升以下也不能认为就没有问题了，最新的国际研究资料表明：和肝脏疾病进展相关的病毒DNA水平域值尚不清楚，即使HBVDNA水平持续低于20000U/ml，也可能乙肝病毒情仍在进一步发展，因此HBVDNA数值应该越低越好，目前国际建议的HBVDNA检测正常值应该是：< 50U/ml 。
2作用目前，乙肝病毒DNA检测在乙肝检查化验中使用的越来越普遍，可见乙肝病毒DNA检测在乙肝检查化验中占的分量越来越重，这是因为乙肝病毒DNA检测对确诊乙肝和评估乙肝治疗效果具有十分重要的作用。
主要表现在以下七个方面：1、了解乙肝病毒在体内存在的数量。
2、乙肝病毒是否复制。
3、乙肝是否传染，传染性有多强。
4、是否有必要服药。
5、肝功能异常改变是否由病毒引起。
乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书
乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书-模板1.目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。
2.范围适用于乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）定量检测（PCR-荧光探针法）。
3.职责3.1操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。
3.2专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。
3.3实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。
4.原理采用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样品核酸纯化之后，通过荧光定量PCR对HBV DNA进行扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（CT）实现对未知样品的检测。
另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。
5.样品要求5.1适用样品类型：血清或血浆。
5.2样品采集：5.2.1血清用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2:^，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.2.2血浆用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA （乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂的真空采血管，立即轻轻颠倒混匀5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后分离血浆于无菌的1.5ml 灭菌离心管。
5.3样品保存和运送使用专用样品0c冰壶送检，温度约维持在4℃左右。
分离后的血清或血浆可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
5.4拒收样品：拒绝重度溶血样品、肝素抗凝的血浆。
6.仪器和试剂6.1仪器AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。
乙肝病毒核酸检测实验操作流程
原理图
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个荧光信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
操作流程
一、标本采集
一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入无菌的干燥玻璃管 用一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入含EDTA或枸橼酸钠抗凝 剂的试管
血 清 的 采 集
93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环
结果分析
1.
2.结果读取
3.结果报告
结果的报告必须简单清楚 定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告>多少； 也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可， 不能报告“0”或阴性
乙肝病毒核酸检测 实验操作流程
广西临床检验中心 唐 娟
主要内容
HBV-DNA的检测原理
标本采集
HBV-DNA操作流程
DNA 提取 PCR 扩增
HBV-DNA检测结果分析
临床意义
检测原理
HBV ： 用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一
条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反
应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
室温（22～25ºC）放置 30～60 分钟血标本使用 水平离心机，4000转/分 离心5分钟
血 浆 的 采 集
立即轻轻颠倒玻璃管混合 5～10次，使抗凝剂与静 脉血充分混匀
吸取上层血清，转移至 1.5ml灭菌离心管
5～10分钟后即可分离出 血浆，转移至1.5ml灭菌 离心管
乙肝核心抗原核酸检测原理
乙肝核心抗原核酸检测原理
乙肝核心抗原（HBcAg）是乙型肝炎病毒（HBV）感染时产
生的一种特定抗原。
乙肝核心抗原核酸检测可以用于检测乙肝病毒感染的早期阶段以及病毒血症的监测。
乙肝核心抗原核酸检测原理基于核酸扩增技术。
具体步骤如下：
1. 样本处理：从血液或组织样本中提取乙肝病毒核酸。
2. 逆转录：将病毒RNA转录成对应的DNA，即病毒RNA的
逆转录过程。
3. 嵌合酶链反应（LAMP）或聚合酶链反应（PCR）：使用特
异性引物和酶，在合适的温度下，对乙肝病毒核酸进行多轮扩增，从而产生大量的目标DNA分子。
4. 检测：通过荧光探针或其他荧光染料，对扩增的目标DNA
进行检测。
如果乙肝核心抗原核酸存在，检测结果将显示阳性荧光信号。
该检测方法具有高度的特异性和灵敏性，能够快速准确地检测出乙肝核心抗原核酸的存在，对乙肝病毒感染的早期诊断和监测具有重要意义。
乙肝标志物ELISA实验规范化操作
2.6.2 双波长比色测定具有能排除由微孔 板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、 刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影 响的优点。
由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸 收具有一定程度的不确定性，也就是说每 次测定或同次测定空白孔位置的不同均有 可能得到不同吸光度测定值，故而在 ELISA测定比色时，最好是使用双波长比 色。
复检项目
HBs Anti- HBe Anti- AntiAg HBs Ag HBe HBc
√× × √√
×× × √×
×× × ×√
×× × √√
初检结果
HBsAg
Anti- HBe HBs Ag
AntiHBe
AntiHBc
复检项目
HBs Anti- HBe Anti- AntiAg HBs Ag HBe HBc
-
-+
-
+ √* × √ × √
S/CO <0.5
-
+ S/CO
<0. 3
+ S/CO<
0.3
无须复查
-
+ S/C
O <2
-
+
+
S/CO S/CO
<0.3 <0.3
×
√
××
×
注：“√”表示需要复检；“×” 表示不需要复检；“*”表示除原 倍血清（或血浆）复检外，同时 还需稀释（可使用生理盐水，至 少1:100稀释）复检。
→加样务必在尽量短的时间内完成，以减少不同
孔间的差异。
→使用微量加样器加样吸液和排液速度应适当，
保证微量加样的准确性和均一性。
→要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。
乙肝病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程
乙肝病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程一、引言乙肝病毒核酸检测是一种重要的手段，用于乙肝病毒感染的早期诊断和监测治疗效果。
本文档旨在描述乙肝病毒核酸检测的标本采集、送检和处理流程，以确保流程规范和结果准确性。
二、标本采集1. 标本选择：乙肝病毒核酸检测的标本可使用血清、血浆或乙肝病毒DNA提取物。
根据实验室提供的要求和使用的方法，正确选择合适的标本进行采集。
2. 采集器具：使用无菌器具进行标本采集，如无菌收集管、无菌采血针等。
3. 采集流程：- 患者应事先了解采集流程与注意事项，并保持合作配合。
- 消毒部位：消毒患者采血部位，通常选择肘弯处的静脉。
- 采血：按照相应的方法采集合适数量的血液样本。
注意血液采集的整洁和标本不得受到污染。
4. 采集注意事项：- 采血前需要对采血设备进行消毒处理。
- 采血时要避免对血液标本造成不必要的污染，防止样本交叉感染。
- 采血后进行适当的处理，确保采血点不出现血肿或其他并发症。
三、标本送检1. 样本存放：采集的标本应放入防漏、密封良好的中。
若需要长期保存，应在-80℃低温条件下保存，以防止DNA的降解。
2. 标本信息：在标本上标注清楚患者信息，如姓名、年龄、性别等。
确保标本信息准确，以避免混淆和误诊。
3. 快递选择：选择快递公司进行标本运输，确保安全、快捷的送达实验室。
在包装标记时，应注明标本的特殊性质，以提醒运输人员注意。
四、标本处理1. 样本分装：实验室收到标本后，根据实验要求进行样本分装。
如分装到提取试剂盒、酶解管中，标注清楚样本编号，确保实验过程的可追溯性。
2. 提取和纯化：根据实验方法进行标本的提取和纯化操作。
确保提取和纯化过程的洁净，避免外源性核酸污染。
3. PCR扩增：将提取纯化后的样本进行PCR扩增反应。
注意PCR操作条件的准确性，避免扩增过程中的交叉污染。
4. 结果分析：根据PCR扩增结果，通过相关分析方法，如凝胶电泳、定量PCR等，对乙肝病毒核酸进行检测和分析。
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结果分析
1.
2.结果读取
3.结果报告
结果的报告必须简单清楚
定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告>多少； 也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可， 不能报告“0”或阴性
临床意义
1、诊断早期乙型肝炎，提高HBV检测阳性率。 2、判断HBV的传染性及病毒复制情况，综合血清学指
乙肝病毒核酸检测 实验操作流程
广西临床检验中心 唐 娟
主要内容
HBV-DNA的检测原理
HBV-DNA操作流程
标本采集 DNA 提取
PCR 扩增
HB理
HBV ：
用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一 条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反 应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
（阴、阳性质控品处理方法：各取50ul，分别加入DNA提取液各50ul）
↓↓ 100℃恒温干浴10min ↓↓ 12000rpm离心5min
注意事项
1.加入等体积的浓缩液后请用震荡器剧烈震荡混匀。不 能用移液器混匀
2.标本12000rpm离心时一定要统一离心管摆放方向。离 心后应沿着沉淀存在的对侧缓缓吸去上清，枪头贴管 壁顺着液面下移，防止带走不可见的沉淀物。如沉淀 不明显可以保留少量液体，建议将移液器量程调至 190ul一次性吸取。
三.PCR 扩增步骤
取上清液2ul点样 ↓↓ 8000rpm离心数秒 ↓↓ 按顺序放进扩增仪微孔中
↓↓
编辑软件，设置循环条件
↓↓
保存文件，运行
注意：吸取上清液中上层2ul进行加样， 不要吸取到沉淀。
循环条件
循环次数、温度 93℃ 2分钟 93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环 93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环
吸取上层血清，转移至 1.5ml灭菌离心管
用一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注
血 入含EDTA或枸橼酸钠抗凝 浆 剂的试管 的
立即轻轻颠倒玻璃管混合
采 5～10次，使抗凝剂与静 集 脉血充分混匀
5～10分钟后即可分离出 血浆，转移至1.5ml灭菌 离心管
注意事项
血清血清
尽量吸取血清的上层液，有纤维蛋白的标本应离心去除 脂类浑浊标本拒收 （离心4000rpm，5min）
注意事项
3.浓缩离心后若出现有“絮状悬浮物”，去上清时应一 并把“絮状悬浮物”吸除，不影响实验结果。如不吸 取絮状悬浮物会导致实验结果偏低。
4.加入20ul的DNA提取液（DNA提取液用前充分融解混 匀),并用震荡器剧烈震荡混匀20秒后,瞬时离心。
5.裂解温度要确保有100℃±1，裂解时间10min±1
血浆 不能使用肝素抗凝 因为对PCR扩增有抑制作用，且很难在核酸提取过程中完全去除
二.HBV-DNA的提取
打开HBV-DNA试剂盒 ↓↓ 取出DNA浓缩液、 DNA提取液（置室温融解，充分混匀） ↓↓ 取已灭菌的1.5ml离心管并按样本唯一编号 ↓↓ 加入DNA浓缩液和待测样本各100ul（振荡混匀） ↓↓ 12000rpm，离心10min ↓↓ 去上清，沉淀中加入20ulDNA提取液 （振荡混匀）
原理图
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个荧光信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
操作流程
一、标本采集
一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注
血 入无菌的干燥玻璃管 清 的 室温（22～25ºC）放置
30～60 分钟血标本使用
采 水平离心机，4000转/分 集 离心5分钟
标，为临床提供准确的实验依据。 3、追踪病程，动态观察抗病毒药物治疗效果。 4、研究HBV感染的动态机理及探讨与癌症发生关系。 5、研究HBV分子流行病学。