肝炎病毒核酸检测及临床诊疗进展
丙型肝炎病毒核酸荧光定量检测法的性能验证
丙型肝炎病毒核酸荧光定量检测法的性能验证崔燕红;赵一琳;宛传丹【摘要】目的对基于QIGEN cube全自动核酸提取仪与ABI 7500核酸扩增仪的丙型肝炎病毒(HCV)-RNA定量检测系统进行性能评估.方法参照《临床实验室对商品定量试剂盒》WS/T 420-2013的性能验证方案,采用质量控制(质控)血清与临床标本评价所用商品试剂盒的精密度、正确度、线性范围与检测下限;同时参照《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》标准,统计分析实验偏差并与厂家声明的性能指标进行比较.结果精密度验证结果显示,2个浓度水平(level 1、level 2)质控品的批内变异系数(CV批内)分别为0.3％、0.9％,批间变异系数(CV批间)分别为0.4％、1.11％,均小于厂家声明值(5％).线性范围试验显示,在1.0×102～1.0×108 kU/L范围内呈良好线性(R2=0.999,P<0.001),高于厂家声明区间(2.0×101～1.0×109 kU/L).正确度验证结果显示,室间质评中的5个浓度水平质控品的实测值与质控样本理论值间偏倚分别为0.10、0、0、0.26和0.26,均小于0.4对数值(log值).最低定量检测下限为1.0×102 kU/L,高于厂家声明的最低检测限(0.5×102 kU/L),但与定量限(1.0×102 kU/L)一致.结论本实验室建立的HCV-RNA定量检测系统在精密度、正确度、线性范围与检测下限方面的性能指标均满足卫生行业标准与ISO 15189医学实验室质量认可准则的要求,能为临床提供可靠的检验报告.【期刊名称】《实用检验医师杂志》【年(卷),期】2018(010)003【总页数】5页(P168-172)【关键词】丙型肝炎病毒;核酸定量检测;性能验证;精密度;正确度;线性范围【作者】崔燕红;赵一琳;宛传丹【作者单位】215500 江苏常熟,常熟市医学检验所分子生物学实验室;215500 江苏常熟,常熟市医学检验所分子生物学实验室;215500 江苏常熟,常熟市医学检验所分子生物学实验室【正文语种】中文丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是导致慢性肝炎的重要嗜肝病毒之一，全球感染人数很多。
乙型肝炎各项指标实验室检查方法进展
乙型肝炎各项指标实验室检查方法进展乙型肝炎病毒(HBV)感染仍是威胁着人民健康的全球性问题。
目前，全世界受HBV感染者接近20亿，其中有超过3亿的慢性感染者，每年它大约带走120万人的生命，在重组乙肝疫苗问世以前，乙肝病毒和艾滋病毒一样可怕，因为还没有药物能有效清除病人体内的乙肝病毒。
在亚太地区，慢性HBV感染率超过10%，其中25%—40%患者会因合并或不合并肝细胞癌的肝硬化而死亡。
世界卫生组织已将HBV感染列为全球十大死亡原因之一。
我国是乙型肝炎病毒的高发区域，本病在我国广泛流行，人群感染率高，在某些地区感染率达到35%以上。
据有关资料报道，肝炎检测阳性的患者已经达到1.89亿，而应就诊未就诊人数(携带者)将近4亿，是当前危害人民健康最严重的传染病。
随着实验室检查方法进展,对乙型肝炎的早期诊断、预防和治疗水平有很大的提高。
经过几十年不断发展,我国已形成了一套完整的检测系统。
敏感、特异、快速、定量的乙肝病毒血清标志物的检测方法为诊断治疗及研究提供了重要的工具。
用HBsAg采用的免疫沉淀法作为临床检测，开创了我国对乙型肝炎病毒抗原的检测。
先后采用了琼脂免疫扩散和对流免疫电泳法来检测HBsAg、HBsAb和HBeAg、HBeAb,但这些检测方法的特异性及敏感性都较差。
至上个世纪七十年代逐渐被一系列方法取代，这些方法的出现，对于检测乙型肝炎在敏感性和特异性方面有了很大的提高。
1 间接免疫凝集试验包括间接血凝试验、免疫粘附血凝试验和乳胶凝集试验等,使敏感性和特异性有所提高[1]。
在ELISA方法出现之前，在表面抗原检测中占据了重要地位。
反向被动血凝用表面抗体致敏O型红细胞,将病人血清连续二倍稀释与其反应一定时间后肉眼观察凝集现象判断表面抗原滴度。
此法的特别之处在于可对表面抗原作相对定量,但操作繁复是其缺点。
2 酶联免疫试验( ELISA)由于反向被动血凝本身存在很大的缺陷，到20世纪70年代盛树力等开始将双抗体夹心法为代表的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法介绍至国内,其发展迅速,很快覆盖了医学检验的诸多领域。
高灵敏荧光定量检测HCV-RNA在丙肝诊疗中的应用研究
2021年2月第11卷第3期CHINA MEDICINE AND PHARMACY Vol.11 No.3 February 2021175·检验医学·高灵敏荧光定量检测HCV-RNA在丙肝诊疗中的应用研究吴嘉锐 王 军 梁连辉 邓纪望 李淑丽 何 娟 蔡常辉广东省中山市第二人民医院检验中心，广东中山 528447[摘要]目的 观察评价分析高灵敏荧光定量检测丙型病毒性肝炎病毒核酸（HCV-RNA）在丙型病毒性肝炎诊疗中的应用效果。
方法 选择2018年2月至2019年2月中山市第二人民医院肝病门诊及戒毒所体检可疑感染丙肝的患者临床血清样本126例，分别采用HCV 磁珠法试剂和对照试剂检测血清中RNA 水平。
结果 磁珠法试剂检测126例样本中有54例阳性，72例阴性；对照试剂检测126例临床样本中有44例阳性，82例阴性，磁珠法试剂定量检测血清中RNA 水平阳性率42.86%高于对照试剂34.92%（χ2=1.670，P =0.196）；磁珠法试剂和对照试剂的阳性样本具较好的一致性（P =0.0000），磁珠法试剂与对照试剂的定量检测结果具有线性相关(r =0.947，P ＜0.05)。
结论 磁珠法高灵敏荧光定量检测丙型肝炎病毒核酸（HCV-RNA）具有更高的灵敏度，是一种比较理想的HCV-RNA 定量检测试剂，值得临床大力推广应用。
[关键词] 丙型病毒性肝炎；丙型病毒性肝炎病毒核酸；高灵敏荧光定量；磁珠法[中图分类号] R473.71 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2021）03-0175-04Application research of highly sensitive fluorescence quantitativedetection of HCV-RNA in diagnosis and treatment of hepatitis CWU Jiarui WANG Jun LIANG Lianhui DENG Jiwang LI Shuli HE Juan CAI ChanghuiInspection Center, Zhongshan Second People's Hospital, Guangdong, Zhongshan 528447, China[Abstract] Objective To observe, evaluate and analyze the application efficacy of highly sensitive fluorescence quantitative detection of HCV-RNA in diagnosis and treatment of hepatitis C. Methods A total of 126 clinical serum samples of patients suspected to be infected with hepatitis C through physical examination in hepatic disease clinic and drug rehabilitation center of Zhongshan Second People's Hospital from February 2018 to February 2019 were selected. Meanwhile, the RNA level in serum was detected by the HCV magnetic bead method reagent and the control reagent respectively. Results Among 126 samples detected by magnetic bead method, 54 cases were positive, and 72 cases were negative, 44 cases were positive, and 82 cases were negative in 126 clinical samples detected by the control reagent. The positive rate of serum RNA level in serum detected by magnetic bead method was 42.86%, which was higher than 34.92% of the control reagent (χ2= 1.670, P = 0.196). The positive samples of magnetic bead reagent and control reagent had good consistency (P = 0.0000). There was a linear correlation between the results of quantitative detection between magnetic bead reagent and control reagent (r = 0.947, P ＜ 0.05). Conclusion The magnetic bead method is an ideal reagent for quantitative detection of hepatitis C virus nucleic acid (HCV-RNA) with higher sensitivity, and it is worthy of promotion and application in clinic.[Key words] Viral hepatitis C; Hepatitis C virus nucleic acid; Highly sensitive fluorescence quantification; Magnetic bead method丙型病毒性肝炎（hepatitis C virus，HCV 简称“丙肝”）是较常见的一种肝脏疾病传染性疾病，呈全球流行，不同性别、年龄、种族人群均对HCV 易感，HCV 的感染具有隐匿性，丙型肝炎病毒也是导致肝硬化和肝细胞癌的主要危险因素[1-2]。
临床医学检验诊断技术的最新进展
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近年来，随着人工智能和自动化技术 的不断发展，临床医学检验诊断技术 也呈现出智能化和自动化的趋势，提 高了检测效率和准确性。
多学科交叉融合
临床医学检验诊断技术的发展涉及医 学、生物学、化学、物理学等多个学 科的交叉融合，推动了技术的快速发 展。
02
分子生物学诊断技术
基因测序技术及应用
高通量测序技术
当前的临床医学检验技 术仍存在一定的局限性 ，如灵敏度、特异性和 准确性等方面的问题， 可能导致误诊或漏诊。
检验成本高昂
部分高端检验技术成本 较高，使得其在临床应 用中受到一定的限制。
未来发展趋势预测和前沿动态关注
精准医疗与个体化诊断
随着精准医疗的不断发展，未 来临床医学检验诊断技术将更 加注重个体化差异，实现针对 不同人群的精准诊断。
06
血液与体液检验诊断技术
血液分析仪性能提升
高速、高精度检测
最新一代血液分析仪实现了高速、高精度的自动化检测， 大大提高了检测效率和准确性。
多参数分析
现代血液分析仪能够同时检测多个血液参数，包括红细胞 、白细胞、血小板等，为临床提供更全面的诊断信息。
智能化数据处理
通过引入人工智能和机器学习技术，血液分析仪能够自动 识别异常结果，并提供智能化分析和建议，辅助医生做出 更准确的诊断。
代谢组学技术及应用
代谢组学技术
介绍代谢组学技术的基本原理、研究内容以及常用方法。
代谢组学技术的应用
阐述代谢组学技术在临床医学检验中的应用，如疾病诊断、药物 研发、营养学等领域。
甲型肝炎的肝炎病毒核酸检测方法
甲型肝炎的肝炎病毒核酸检测方法甲型肝炎（Hepatitis A）是一种由甲型肝炎病毒（HAV）引起的急性肝炎疾病。
HAV主要通过食物或水源传播，感染者的粪便中含有病毒，当人们摄入被污染的食物或水时，病毒就会进入体内，导致感染。
甲型肝炎的临床表现多样，从无症状感染到轻度疾病，再到重度肝炎，甚至急性肝衰竭。
肝炎病毒核酸检测是甲型肝炎的确诊和病毒携带者的筛查方法之一。
核酸检测通过检测患者体液中的病毒核酸，来确定是否存在病毒感染。
以下是一些常用的甲型肝炎病毒核酸检测方法。
1. 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）实时荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的核酸检测方法，它可以检测到非常低浓度的病毒核酸。
该方法通过特定引物和探针与病毒核酸结合，产生荧光信号来检测病毒的存在。
RT-qPCR可以快速、准确地确定感染者的病毒载量，并监测病情的变化。
2. 反转录PCR（RT-PCR）反转录PCR是一种将RNA转录成DNA，然后进行PCR扩增的方法。
在甲型肝炎的检测中，RT-PCR可以将患者体液中的HAV RNA转录成HAV DNA，并进行扩增和检测。
这种方法对病毒的检测灵敏度高，可以用于早期感染的诊断。
3. 病毒载量测定病毒载量测定是通过定量检测患者体液中的病毒核酸来评估病情和治疗效果的方法。
常用的方法包括实时荧光定量PCR和RT-PCR。
病毒载量测定可以帮助医生判断感染的程度和预测病情的发展，对指导治疗和预后评估具有重要意义。
4. 其他检测方法除了核酸检测，甲型肝炎的诊断还可以通过检测血清中的抗HAV IgM抗体来确定。
这种方法可以检测到早期感染的抗体产生，但相对于核酸检测来说，其敏感度和特异性较低。
总结起来，甲型肝炎的肝炎病毒核酸检测方法包括实时荧光定量PCR、反转录PCR和病毒载量测定。
这些方法可以快速、准确地确定感染者的病毒载量和病情，对指导治疗和预后评估非常重要。
此外，抗HAV IgM抗体检测也可以用于早期感染的诊断，但其敏感度和特异性相对较低。
【公卫继续教育平台】病原体核酸检测技术现状和进展
病原体核酸检测技术现状和进展1.RAP技术和定量PCR技术相比，最大的优势是（)(10分)A通量B灵敏度和速度C定量D成本考生得分：10考生答案：B难易程度：一般2数字PCR技术和定量PCR技术相比，最大的优势是（)(10分)A通量B成本C灵敏度和定量准确D速度考生得分：10考生答案：C难易程度：一般3POCT和定量PCR技术相比，最大的优势是（)(10分)A成本B定量C操作简单D通量考生得分：10考生答案：C难易程度：一般4二代测序技术和一代测序技术相比，最大的优势是（）(10分) A准确B可直接测定原始标本中的所有序列C速度D成本考生得分：10考生答案：B难易程度：一般5下面的技术最适合用于现场检测的是（）(10分)APCRB细胞培养C胶体金法DＥLISA考生得分：10考生答案：C难易程度：一般6RAA是一种等温扩增技术，其扩增产物的检测方式有（）(10分) A电泳B荧光C颜色D浊度答错了考生得分：0考生答案：A,C难易程度：一般7常见的病毒性传染病病原体检测技术有（）(10分)A血清学检测B细胞培养C电镜D分子检测E动物模型考生得分：10考生答案：A,B,C,D难易程度：一般8以下属于核酸等温扩增技术的有（）(10分)AHDABDPOCRCADMDAENASBA考生得分：10考生答案：A,C,D,E难易程度：一般9常见的未知病原体鉴定技术有（）(10分)AARMS-PCRBVIDISCACSISPADNGSEMultiplexPCR答错了考生得分：0考生答案：A,E难易程度：一般10LAMP是一种核酸等温扩增技术，其扩增产物的检测方式有（）(10分) A大小B颜色C浊度D荧光E电泳答错了考生得分：0考生答案：A,C难易程度：一般。
肝病科临床路径
丙型肝炎临床路径（县级医院版）一、丙型肝炎临床路径标准住院流程（一）适用对象。
第一诊断为丙型肝炎（二）诊断依据。
1急性丙型肝炎的诊断①．流行病学史：有输血史、应用血液制品史或明确的HCV暴露史。
输血后急性丙型肝炎的潜伏期为2～16周（平均7周），散发性急性丙型肝炎的潜伏期尚待研究。
②．临床表现：全身乏力、食欲减退、恶心和右季肋部疼痛等，少数伴低热，轻度肝肿大，部分患者可出现脾肿大，少数患者可出现黄疸。
部分患者无明显症状，表现为隐匿性感染。
③．实验室检查：ALT多呈轻度和中度升高，抗-HCV和HCV RNA 阳性。
HCV RNA常在ALT恢复正常前转阴，但也有ALT恢复正常而HCV RNA持续阳性者。
有上述1+2+3或2+3者可诊断。
2慢性丙型肝炎的诊断①．诊断依据：HCV感染超过6个月，或发病日期不明、无肝炎史，但肝脏组织病理学检查符合慢性肝炎，或根据症状、体征、实验室及影像学检查结果综合分析，亦可诊断。
②．病变程度判定：病变程度判断可参考中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的《病毒性肝炎防治方案》（2000年，西安）中关于肝脏炎症和纤维化分级、分期的诊断标准。
HCV单独感染极少引起重型肝炎，HCV重叠HBV 、HIV等病毒感染、过量饮酒或应用肝毒性药物时，可发展为重型肝炎。
HCV感染所致重型肝炎的临床表现与其他嗜肝病毒所致重型肝炎基本相同，可表现为急性、亚急性和慢性经过。
③．慢性丙型肝炎肝外表现：肝外临床表现或综合征可能是机体异常免疫反应所致，包括类风湿性关节炎、眼口干燥综合征（sjogren syndrome）、扁平苔藓、肾小球肾炎、混合型冷球蛋白血症、B细胞淋巴瘤和迟发性皮肤卟啉症等。
④．肝硬化与HCC：慢性HCV感染的最严重结果是进行性肝纤维化所致的肝硬化和HCC。
⑤．混合感染：HCV与其他病毒的重叠、合并感染统称为混合感染。
我国HCV与 HBV或HIV混合感染较为多见。
数字PCR技术在感染性疾病中的应用进展
数字PCR技术在感染性疾病中的应用进展
王国飞;王雪亮(综述);周靖(审校)
【期刊名称】《国际检验医学杂志》
【年(卷),期】2024(45)8
【摘要】数字PCR是一种具有广泛应用前景的、可绝对定量的核酸检测新技术,与实时荧光PCR相比具有高灵敏度和精确度上的优势。
近年来,数字PCR已广泛应
用于临床检测领域,特别是病原微生物的检测中,为相关疾病的早期诊断、监测预警、疗效评估等提供了量化指标依据。
基于此,该文对数字PCR的技术原理、优势及其在感染性疾病中的应用进行综述,以期为数字PCR更好地用于感染性疾病提供参考借鉴。
【总页数】5页(P1006-1010)
【作者】王国飞;王雪亮(综述);周靖(审校)
【作者单位】上海市临床检验中心/上海市实验医学研究院
【正文语种】中文
【中图分类】R446.5
【相关文献】
1.数字PCR技术在临床诊断中的应用进展
2.数字PCR技术在动物疫病诊断中的应用进展
3.数字PCR技术在食品检测中的应用研究进展
4.实时荧光定量及数字PCR 技术在病毒检测中的应用及研究进展
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目录
Part 1 肝病PCR检测国内外需求及现状 Part 2 肝病PCR检测最新解决方案 Part 3 肝病PCR检测的发展趋势
目录
Part 1 肝病PCR检测国内外需求及现状 Part 2 肝病PCR检测最新解决方案 Part 3 肝病PCR检测的发展趋势
国际需求
国际治疗路线
（一） 核苷(酸)类似物治疗慢性乙肝路线图
开始治疗 HBV-DNA基线水平监测
治疗第12周 评估原发性治疗失败 HBV-DNA水平较基线水平下降幅度<1log/ml
治疗第24周 评估抗病毒疗效的早期预测因子
60IU/ml如何检测？
病毒学完全应答 HBV-DNA<60 IU/ml
病毒学部分应答 HBV-DNA:60 ~2000 IU/ml
何去何从
面对当前肝病毒 核酸检测技术的 现状，我们真没 有办法了吗？
解决方案
Part 1 肝病PCR检测国内外需求及现状 Part 2 肝病PCR检测最新解决方案 Part 3 肝病PCR检测的发展趋势
核酸检测发展要求
临床核酸提取技术的发展：
酚氯仿法
煮沸法
旋转离心柱法 玻璃粉吸附法 二氧化硅吸附法
国内行业标准
内标全程参与！ 核酸上样量≥20 ul！
国内现状
陈旧的技术
繁琐的过程
现状
令人揪心的性能
➢ 国内HBV DNA检测方法多为煮沸法，试剂灵敏度 均为500IU/ml或1000IU/ml。
➢ 国内大部分HCV RNA检测方法多为柱提法，试剂 灵敏度≥1000IU/ml。
专家呼吁
专家呼吁：高精度，超敏感的核酸诊断试剂的开 发是目前肝炎诊疗中的关键步骤！
➢ 五种乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒的比较,中华传染病杂志， 2009年 第3期——吴星,黄维金, 周诚 ,庄辉 等(中国药品生物制品检定所, 北京大学医学部)
➢ 国家“十一五”科技重大专项 “乙型和丙型病毒性肝炎诊断及临床监 测的研究” ——鲁凤民教授 北京大学肝炎试剂研究中心
2008年美国肝病协会CHB防治指南：持久消除HBV是乙肝的治疗终点， HBV DNA病毒载量尽可能小于或等于10 IU/ ml。
国际需求
欧洲肝病研究学会EASL2010年指南指出：将HBV DNA病毒载量尽可能控 制在10-15 IU/ ml，能有效防止疾病的复发。 欧洲肝病研究学会EASL2011指南指出：丙肝患者治疗的目标需HCV RNA病 毒载量低于50 IU/ ml。
病毒学不充分应答 HBV-DNA>2000 IU/ml
继续治疗 监测HBV-DNA/6个月
增加药物治疗 监测HBV-DNA/3个月
增加/更换有效的药物治疗 监测HBV-DNA/6个月
* 由美国坦福大学医学中心Keeffe教授（专家组）提供
国内行业指导原则
国家SFDA技术审评中心“863”课题《 HBV DNA定量试剂 技术审评指导原则》中指出： HBV DNA建议最低检测限应≤30 IU/mL。 DNA提取纯化方法不建议采用煮沸法进行DNA提取。
没有经过ROX校正
经过ROX校正
注*：2倍梯度稀释，5个样本各重复3次检测
发展趋势
自动化的要求
不管技术多么复杂或简单， PCR技术逐步向自动化、高通量的方向发展！
谢谢！
发展趋势
Part 1 肝病PCR检测国内外需求及现状 Part 2 肝病PCR检测最新解决方案 Part 3 肝病PCR检测的发展趋势
发展趋势
简单化的要求
（25×33+288÷3）×15=？
发展趋势
➢ 一步法技术：最简便的PCR技术
一步操作即可实现核酸提取。
发展趋势
➢ 一步法技术优势：
快速，处理96个样本仅需 30min。 成本低，仅需一套移液器即可实现病毒检测。 操作步骤少，减少误差发生率，提高准确性。 极易掌握，对操作人员要求低，方便科室的人 员安排。
临床验证和对比
以湖南圣湘乙肝磁珠法为例
➢ 灵敏度可达10IU/ml，是国产主流试剂的50-100倍； ➢ 准确定量线性范围为20IU/ml～2.0×109IU/ml ➢ 可检测HBV A、B、C、D、E、F、G、H共8个基因型。 ➢ 设置了监控内标IC,有效避免假阴性。 ➢ 设置内参比荧光ROX，定量更准确。
临床验证和对比
以湖南圣湘乙肝磁珠法为例
* 9例定值在12 ~50 IU/ml之间
圣湘磁珠法技术在灵敏度方面存在明显优势，与进口试剂具有很好的一致 性，能够很好的胜任临床药物疗效的观察和治疗终点的确定。
Sansure-HBV ：圣湘HBV磁珠法 Roche-HBV ：罗氏 AmpliPrep-Cobas TaqMan HBV Test X-HBV：国内一家上市公司的HBV产品（浓缩煮沸法）
发展趋势
准确化的要求
----内标监测系统， 假阴性的克星。
内标的作用
• 内标参与核酸提取与扩增，通过检测内标是否正常来监 测核酸提取和核酸扩增的有效性，试验结果是否有效， 避免PCR假阴性。
FAM:525nm
目的基因 内标
HEX:555nm
HEX 曲线 FAM曲
线 真阴性
ROX的作用
设置了参比荧光ROX，用于校正枪的误差、耗材质量（如管 盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器孔间 差异，使结果更准确。
磁珠法
国内主流方法
国际主流方法
核酸检测发展要求
高精度 高品质 高科技
磁珠法技术
磁珠（电子显微镜）
磁珠法
----核酸诊断领域新方向。
磁珠分离器
技术原理
原理
DNA
----通过超顺磁性颗粒富集
核酸，实现样品高纯度、高
灵敏度的检测。
磁珠与DNA的结合
技术性能
磁珠法提取核酸效率高，纯度高，特异性好。 采用最新一代的磁珠提取核酸技术，无需加热、无 需高速离心、灵敏度极高，能够很好的满足临床诊疗 的需求。 抗干扰能力强，能胜任高血脂、强溶血以及药物治 疗标本的检测，是临床疾病检测的有力手段。 极易实现自动化。