单克隆抗体和基因工程抗体

接头DNA
VH 基因III或 基因VIII VL
外壳蛋白
VH
VL
噬菌体表面呈现的小分子抗体
噬菌体抗体图示
抗 体 库 的 构 建
抗体库的富集筛选
抗体库技术的应用
● 人源抗体的制备 ● 抗体性能的改良 ● 不经免疫制备抗体
四 抗 体 药 物 的 临 床 应 用
抗血清
破伤风抗血清
Malignant B-cells are destroyed after docking of MabThera
人改型抗体（CDR移植）
鼠单克隆抗体V区的人源化 人源化抗体（humanized antibody） 又称CDR移植抗体（CDR grafting antibody）
改型抗体技术

1975年Kö hler and Milstein等首次利用B淋巴细胞 杂交瘤技术制备出单克隆抗体 (monoclonal antibody, MAb)。 1994年基因工程抗体。


1、多克隆抗体(polyclonal antibody; PcAb)
白蛋白
a1 a2
球蛋白
b

（a）
（b）
（c）
对健康人用疫苗进行主动 免疫，免疫前（a）和免 疫后10天 （b）分别采血 并对血清蛋白进行凝胶电 泳分析。免疫前血清中的 g 球蛋白条带较宽，免疫 之后则相对集中。Bruton 氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带缺失（c）。
VH
-S-S-
VL
disulfide-stabilized Fv, ds-Fv
Fv小分子抗体的制备
III Diabody structure
双特异性抗体
Fab
VH VL
CH1
-S-S-
-S-S-
CH1
抗原A Fv
VH VL VH
抗原B
VL
抗原A
VH
抗原B
VL
CH1
-S-S-
-S-S-
CH1
TUMOR CELL
Production of unlimited quantities of human polyclonal antibodies against any disease agent
used to prevent and/or treat a wide variety of diseases,
实际意义：
（1）抗原的纯化和结构分析； （2）细胞发生、分化及功能的阐明； （3）临床疾病的诊断和治疗， 如：免疫分子检测； 免疫导向药物治疗恶性肿瘤 --- McAb抗癌药物(毒素或 放射核素偶联)。
多克隆抗体与单克隆抗体的比较
多克隆抗体 来源 动物免疫血清、恢复期病人血 清或免疫接种人群 特点 来源广泛、制备容易 组成 针对不同抗原表位的抗体的混 合物 单克隆抗体 多为鼠源性 纯度高、特异性强、效价高、少 或无血清交叉反应、制备成本低 针对单一表位，结构和组成高度 均一，抗原特异性及同种型一致
be changed,
30
基 因 工 程 改 造 的 抗 体
1 小分子抗体
2
3 鼠单抗人源化
(1) 小分子抗体
2 1
3
I Fab antibody molecule
Pr VH CH1 Pr VL CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链表达载体
L链表达载体
共转染细胞
Fab 抗体分子的制备
抗体分泌细胞
antibody
antigen
antigen-antibody complex:
epitope
purple : HV CDR ( in both the ribbon and ball and stick views) green : antigen HV sequences contact the antigen.
第二代：细胞工程抗体 第三代：基因工程抗体

1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素， 并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。

1937年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、 甲种（α）球蛋白、乙种（ β ）球蛋白、丙种（ γ ） 球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白 组分。
嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因而 仍有一定的免疫原性。为降低来自小鼠可变区中 骨架区的免疫原性，Winter等克隆出鼠源抗体中 与抗原结合的三个互补决定区（CDR）基因用以置 换人抗体中相应序列。由于这种抗体绝大部分为 人源性，只有CDR区来自小鼠，因而称为CDR移植 抗体（CDR grafted antibody） 。这种抗体在人 体内免疫性大为降低
一、抗体分子的结构
二、细胞工程抗体和基因工程抗体 三、治疗性单抗研制进展
一 抗体分子结构
免疫球蛋白分的基本结构
免疫球蛋白的水解片段
免疫球蛋白的功能区
complimentarity determining region, CDR
hypervarible region (HVR) (complimentarity determining region, CDR) : formation of the Ag binding site
由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗 原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。 特点：具有高度均一性。 杂交瘤细胞： 骨髓瘤细胞 --- 无限增殖； 免疫B细胞 --- 合成、分泌特异性抗体。 杂交瘤技术 --- HAT培养基：次黄嘌(H), 氨基 蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。
单抗制备的流程图
80% 的人Ig分子的序列，在很大程度上减少
了单克隆抗体的免疫原性，但这种抗体尚存20-
30%的鼠源成分，在实际应用过程中仍可刺激机体
产生较强的抗独特型反应。
嵌合抗体技术

人---鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一部分代 替鼠源性抗体的一部分，使之保留对抗原的特 异性，又具备与补体和细胞结合的功能，并减 少异源性蛋白的抗原性。研究人员设想，用人 源性基因代替鼠源性抗体基因中的Fc区。因为 Fc区的主要功能是激活机体免疫反应，也是产 生人抗鼠反应的部分。研究人员利用编码人抗 体Fc区的DNA片段替换鼠源性的Fc段DNA。
应用 疾病的被动免疫治疗
疾病诊断、特异性抗原或蛋白的 检测和鉴定、疾病的被动免疫治 疗和生物导向药物制备
缺点 特异性不高、易发生交叉反应， 人体应用后可导致人鼠抗体反应 不易大量制备
3、基因工程抗体 （genetic engineering antibody） 通过基因重组改良抗体性能 通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体
单克隆抗体
抗肿瘤 (鼠 , 人-鼠 )
The rise of antibody-based therapeutics further illustrates the substantial change in the paradigms of pharmaceutical development, By utilizing the body's own capabilities as a source for a drug rather than the chemists reagents vessel.
基因工程抗体
抗肿瘤 , 自身免疫病
I 抗血清
人工被动免疫
人工注射人的球蛋白（Байду номын сангаасamma-globulins）或免疫动物的球蛋白。
破伤风抗毒素 (马血清)
同源Homologous
异源 Heterologous
急性感染 (diphtheria, tetanus, measles, rabies, etc.), 中毒 (insects, reptiles, botulism), 预防措施 (hypogammaglobulinemia).
VH CH1
VL CL
-S-S-
Fab 抗体分子的制备
II Fv antibody molecule
(1) ds-Fv
Pr VH Pr VL
分别构建载体
L链表达载体
H链表达载体
共转染细胞
Fv [二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)]小分子抗体的制备
抗体分泌细胞
CTL
CD3
(2) 抗体融合蛋白
抗原结合部位与生物活性蛋白结合 免疫导向 免疫桥连 嵌合受体 含Fc段的抗体融合蛋白—免疫黏附素 Fc的作用：检测、纯化、 延长血清中半寿期 生物学效应功能
Fc的作用：检测、纯化、
thrombin
SPA
protein
Fc
Fc的作用：延长血清中半寿期
DNA ligation G-CSF Fc
噬菌体抗体库技术

将从人或小鼠B淋巴细胞中分离的mRNA逆转录成 cDNA，用PCR扩增编码轻链和重链的cDNA；然后用 限制性内切酶酶解扩增的cDNA片段，克隆到丝状 噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋白Ⅲ基因连 接成融合基因，经辅助噬菌体感染大肠杆菌后， 携带有表达载体的大肠杆菌就会释放外壳上带有 抗体片段的噬菌体；再用ELISA或免疫亲和层析法 即可筛选出特异性抗体。
人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略
Pr 鼠VH
启动子
人 CH
Pr
鼠VL
人 CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
共转染细胞
抗体分泌细胞
鼠VH
鼠VL
人CL 人CH
人-鼠嵌合基因工程抗体
MabThera
for the treatment of non-Hodgkin-lymphomas
Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody