第二章 沉淀法
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重量法
减少或消除方法
改变沉淀条件，重结晶或陈化
2．后沉淀（继沉淀）：
溶液中其他本来难以析出沉淀的组分（杂质离子） 在该沉淀表面继续沉积的现象
溶液中被测组分析出沉淀之后在与母液放置过程中，
注：继沉淀经加热、放置后会更加严重
消除方法——缩短沉淀与母液的共置时间
示例
例：草酸盐的沉淀分离中
2 2
例：金属硫化物的沉淀分离中
H2S ( Cu 2 , Zn 2 CuS 长时间 CuS ZnS
长时间放置，CuS表面吸附S 2 [ S 2 ] 当[ Zn 2 ][S 2 ] K SP( ZnS ) ZnS 逐渐沉积
3．提高沉淀纯度措施
重量法的二个关键： 一要完全； 二要纯净 沉淀完全是指被测组分残留在溶液中很少 1. 沉淀的类型 2. 沉淀的形成
1. 沉淀的类型
（1）晶形沉淀：颗粒直径0.1～1μm， 排列整齐，结构紧密， 比表面积小，吸附杂质少 易于过滤、洗涤 例：BaSO4↓（细晶形沉淀） MgNH4PO4↓（粗晶形沉淀） （2）无定形沉淀：颗粒直径﹤0.02μm 结构疏松 比表面积大，吸附杂质多 不易过滤、洗涤 例： Fe2O3•2H2O↓ （3）凝乳状沉淀：颗粒直径界于两种沉淀之间 例：AgCl↓
注：
因为酸度变化，构晶离子会与溶液中的H+或OH-反应， 从而使沉淀溶解度增大。
降低了构晶离子的浓度，使沉淀溶解平衡移向溶解，
4. 配位效应：存在配位剂与构晶离子形成配位体，
使沉淀的溶解度增大的现象称为～
讨论：
1）配位效应促使沉淀-溶解平衡移向溶解一方， 从而增大溶解度 2）当沉淀剂本身又是配位剂时，应避免加入过多; 既有同离子效应，又有配位效应，应视浓度而定
第二章_沉淀法
Hale Waihona Puke 中性盐沉淀蛋白质的基本原理：
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2 和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成 水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水 胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极 性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲 和力越大，因而溶解度也越大。 亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷层和水化膜。 因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加 入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水 区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即 形成沉淀。盐析示意图如下页图 所示。
②
硫酸铵盐析
A．固体法：最常用的是固体硫酸铵加入法。 将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地 加入粗制品溶液中，接近计划饱和度时，加盐 的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度 过大而造成不应有的蛋白质沉淀。在此过程 中，溶液中的硫酸铵的浓度会不断提高，水分 子会不断与硫酸铵结合，当加入的硫酸铵使溶 液浓度达到“盐析点”时，蛋白质就沉淀出来。
二、制备蛋白质 影响蛋白质溶解度的外界因素：
溶液的pH 离子强度 介电常数 温度 主要类型： 1.盐析法 2.有机溶剂沉淀法 3.蛋白质沉淀法 4.聚乙二醇沉淀法 5.选择性沉淀法 6.结晶沉淀法
1．盐析法
盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随 盐浓度的增高而上升，当盐浓度增高到一定数值时， 其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出(盐析)。
B.作盐析曲线
将每个分级沉淀 部分分别重新溶解 于一定体积的适宜 pH缓冲液中， 根据其蛋白质或 酶含量和相对应的 硫酸铵浓度之间的 关系作图， 即可得到如图2-1 所示的典型盐析曲 线。
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2 和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成 水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水 胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极 性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲 和力越大，因而溶解度也越大。 亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷层和水化膜。 因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加 入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水 区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即 形成沉淀。盐析示意图如下页图 所示。
②
硫酸铵盐析
A．固体法：最常用的是固体硫酸铵加入法。 将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地 加入粗制品溶液中，接近计划饱和度时，加盐 的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度 过大而造成不应有的蛋白质沉淀。在此过程 中，溶液中的硫酸铵的浓度会不断提高，水分 子会不断与硫酸铵结合，当加入的硫酸铵使溶 液浓度达到“盐析点”时，蛋白质就沉淀出来。
二、制备蛋白质 影响蛋白质溶解度的外界因素：
溶液的pH 离子强度 介电常数 温度 主要类型： 1.盐析法 2.有机溶剂沉淀法 3.蛋白质沉淀法 4.聚乙二醇沉淀法 5.选择性沉淀法 6.结晶沉淀法
1．盐析法
盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随 盐浓度的增高而上升，当盐浓度增高到一定数值时， 其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出(盐析)。
B.作盐析曲线
将每个分级沉淀 部分分别重新溶解 于一定体积的适宜 pH缓冲液中， 根据其蛋白质或 酶含量和相对应的 硫酸铵浓度之间的 关系作图， 即可得到如图2-1 所示的典型盐析曲 线。
第二章 沉淀法
（六）选择性变性沉淀法
• 选择一定的条件使溶液中存在 的某些杂蛋白变性沉淀而不影 响所需蛋白质的方法
（七）结晶
• 不同晶体沉淀性质＋盐或有机 溶剂使接近结晶物溶解度。 • 饱和度硫酸铵或刚出现混浊， 调节等电点，使温度下降 • 晶种。
常用的沉淀类型
蛋白质: • 盐析法 • 有机溶剂沉淀法 • 蛋白质沉淀法 • 聚乙二醇沉淀法 • 选择性沉淀法 • 结晶沉淀法 核酸步骤: DNP/RNP复合物的解聚→多糖等杂质的 消除→ DNA与RNA的分离→核酸沉淀
（一）盐析法
• 盐浓度增高到一定数值后， 水活性降低，导致蛋白质分子 表面电荷逐渐被中和，水化膜 相继被破坏，最终引起蛋白质 分子间相互聚集并从溶液中析 出。 • 常用盐：硫酸铵 少量多次缓慢加入 • 盐析的影响因子:蛋白质浓度, 离子强度和离子类型,pH,温度.
（四）蛋白质沉淀法
• 所用的试剂仅对一类或一种蛋 白质沉淀起作用。 • 常见试剂：碱性蛋白质,凝集 素和重金属等. • 碱性蛋白质：多价阳离子,除 能有效地沉淀核酸物质外,还 能沉淀某些蛋白质。 • 重金属沉淀法：在低温下进行 • 凝集素：与糖蛋白有明显凝集 作用。
（五）聚乙二醇沉淀法
• PEG和右旋糖苷硫酸钠等水溶 性非离子型聚合物可使蛋白质 发生沉淀作用.沉淀的条件温 和,不会引起蛋白质变性.
第二章
沉淀法
一、基本原理
• 根据各种物质的结构差异性
（蛋白质分子表面疏水和亲水 基团之间比例的差异性）来改
变溶液的某些性质（如pH，极
性，离子强度，金属离子等）
进而导致有效成分的溶解度发
生变化。
二、沉淀的类型
可逆沉淀反应:在温和条件下沉淀的蛋白质 可以重新溶解形成溶液。蛋白质胶体溶液的稳定性被破坏。 又称为非变性沉淀。 如：等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法 不可逆沉淀反应：在剧烈条件下，沉淀的蛋白质不能再 重新溶解形成溶液。又称为变性沉淀。蛋白质胶体溶液 的稳定性不仅被破坏，且蛋白质的结构和性质也被破坏 了。 如：加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀
第二章 沉淀法..
（3）多价阳离子的作用 蛋白质和多价阳离子（如Zn2+和Cu2+等）能 结合形成复合物，使蛋白质在有机溶剂中的 溶解度降低。这对在高浓度溶剂中才能沉淀 的蛋白质特别有益。 例如，在某些蛋白质溶液中只要加入0.0050.02nmol/L Zn2+，就可大大减少有机溶剂的 用量，而将蛋白质沉淀出来。
三、 蛋白质沉淀剂
四、聚乙二醇沉淀作用
水溶性非离子型聚合物，可使蛋白质发生沉淀作用。
沉淀作用较满意的聚合物是分子量在400-6000之间的聚 乙二醇。 优点：条件温和，不易引起蛋白质变性，沉淀较完全， 应用范围广。 缺点：易受各种因子如pH、离子强度、蛋白质浓度及聚 合物分子量的影响。
五、选择性沉淀法
根据各种蛋白质在不同物理化学因子（如温度、 酸碱度和有机溶剂等）作用下稳定性不同的特 点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变 性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中 （或者发生可逆性沉淀），从而达到纯化有效 成分的目的。
原理：等电点、热变性、酸碱变性和特殊 的可逆沉淀作用 优点：选择性较强，方法简单，种类较多
缺点：应用范围较窄 应用范围：各种生物大分子物质的沉淀
六、 结晶
—改变溶解度产生沉淀的方法
蛋白质沉淀：晶体沉淀和无定形沉淀 结晶过程是纯化过程。在提纯阶段，当某一纯蛋白质 溶液的浓度达到较高（5%-30%）水平时，若条件适合， 就能产生一定形状的结晶。当蛋白质溶液中混有杂质 时，即使条件适合，也得不到整齐的结晶，或无结晶 形成。 用显微镜观察结晶的有无及形状，为判断提纯物质纯 化程度的一种方法。
透析时注意：
（1）透析袋的处理
新的透析袋用蒸馏水洗净，无漏洞时，即可使用。 除去透析袋中所含盐类时，处理方法： 将透析袋置500毫升含1mmo1/L EDTA-Na2的2％碳酸氢钠 溶液中煮沸10分钟，用干净镊子或戴橡皮手套取出，蒸 馏水煮沸、漂洗后，可使用。用过的透析袋同样处理后， 能重复使用。 保存：泡在蒸馏水中置低温（4℃）或泡在70％的乙醇中 保存。
第二章 沉淀分离法
常用的无机元素及化合物的挥发形式
表 2-9 无机元素及化合物的挥发形式 挥发形式 元素及化合物 单质 卤素、I2（升华） 氧化物 CO2、SO2、RuO4、OsO4、SeO2、TeO2、 As 2O3 氢化物 NH3、P H3、 As H3、 Sb H3、 H2S、 H2Se、 H2Te、 卤化氢等 氟化物 BF3、SiF4 氯化物 HgCl2、 Ce Cl4、 AsCl3、 SbCl3、 SnCl4、 SeCl2、 SeCl4、 SeCl6、 TeCl2、TeCl4、CrO2Cl2 溴化物 CdBr2、 CeBr4、 AsBr3、SbBr2、 3、SnBr4 酯类 B（ OCH3） 3、 B（OCH2CH3） 3
依据原理:容度积原理.
沉淀分离法：
1. 对沉淀的要求：
（1）沉淀溶解度必须很小 （2）沉淀易于过滤 （3）沉淀力求纯净
2. 常用的沉淀剂
2.1 无机沉淀剂 氢氧化物、氨、硫化物等沉淀剂 2.2 有机沉淀剂 草酸、铜试剂、铜铁试剂
一、 常量组分的富集和沉淀分离
1、无机沉淀剂 1）氢氧化物沉淀 大多数金属离子能形成M(OH)n↓，且溶 解度差别大，可控制pH实现分离 缺点 • 选择性较差 • 共沉淀现象严重 • 故分离效果不理想
2）硫酸盐沉淀 硫酸作沉淀剂，浓度不能太高，因易形成 MHSO4盐加大溶解度, 沉淀碱土金属和Pb2+, CaSO4 溶解度大，加入乙醇降低溶解度。 3）卤化物沉淀 氟化稀土和与Mg(II), Ca(II), Sr(II), Th(IV)氟化物 沉淀，冰晶石法沉淀铝 在pH＝4.5 Al(III)与NaF生成 （NaAlF6)法沉淀分离Al(III),与Fe(III),Cr(III), Ni(II), V(V)Mo(VI)等分离
第二章催化剂的制备-沉淀法
陈化胶凝
溶胶
（加胶溶剂）胶溶
干燥
焙烧
催化剂
金属醇盐胶溶法制备催化剂的Sol-Gel过程
Formation of a hydrogel
Aging of a hydrogel Solvent removal Heat treatment
Four main steps in the sol–gel preparation
浸渍法 离子交换法
催化剂的成型
1、沉淀法
在金属盐溶液中加入沉淀剂，生成 难溶金属盐或金属水合氧化物，从 溶液中沉淀出来，再经老化、过滤、 洗涤、干燥、焙烧、成型、活化等 工序制得催化剂或催化剂载体
—— 广泛用于制备高含量的非贵金属、 （非）金属氧化物催化剂或催化剂载体
沉淀法的生产流程
形成沉淀的条件
关键：瞬间混合—快速搅拌
Ni(NO3)2 + HNO3溶液 = 1.1
NaNO3溶液 = 1.2
Na2SiO3溶液 = 1.3
（防止形成结构或组成不均匀的沉淀） Ni/SiO2制备 （苯选择加氢 催化剂） 形成均匀的水溶胶或胶冻， 再经分离、洗涤、干燥、焙
烧、还原即得催化剂
导晶沉淀法 借助晶化导向剂（晶种）引导非晶型沉淀转化为晶型沉淀 的快速有效方法 — 预加少量晶种引导结晶快速完整形成 例：制备高硅钠型分子筛（丝光沸石、X型、Y型分子筛）
沉淀剂不直接加入待沉淀溶液中，而是首先把待沉淀溶液 与沉淀剂母体混合，形成一个十分均匀的体系，然后调节 温度，使沉淀剂母体逐步转化为沉淀剂，从而使沉淀缓慢 进行，得到均匀纯净的沉淀物
例：制取氢氧化铝沉淀
(NH2)2CO +
3H2O
90～100℃ 2NH4+
第二章 沉淀分离法
Fe3+、Cr3+、Ce4+ 、 Be2+、Cu2+、 Ti4+、Zr4+、Hf4+、 Ag+、 Hg2+、 Bi3+、Sn4+、V (Ⅵ) Pb2+ 、 Sb3+、 U(Ⅳ) 、 Nb(Ⅴ) Sn2+、Mo (Ⅵ) Ta(Ⅴ) 、W(Ⅵ)等 V (Ⅴ) 、 U (Ⅵ) Au (Ⅲ) 、稀土等
化学与材料科学学院
二、沉淀分离法的特点
（characteristic of precipitation method）
三、沉淀的类型与形成条件
（types of precipitation and their formation conditions）
四、无机沉淀剂沉淀法
（inorganic precipitator ）
----使某些高价Mn+沉淀 其它微溶性碳酸盐或氧化物的悬浊液, 如:BaCO3、CaCO3、PbCO3、MgO的悬浊液具 有同样的功效，仅控制的pH范围各不相同而已。 HAc-NaAc也能达到同样的效果.
化学与材料科学学院
第一节 沉淀分离法
原理: ZnO + H2O Zn2+ +2OHZn(OH)2
因此，控制[H+]即可控制[S2-] 。
常见阳离子： 2+ Hg 2+ Pb + 3+ Ag Fe As(Ⅲ,Ⅴ) 3+ Bi 3+ Al Sb ( Ⅲ , Ⅴ ) 2+ Cu 2+ 3+ Hg2 Cr Sn( Ⅱ , Ⅳ ) 2+ Cd Ⅰ Ⅱ Ⅲ
0.3mol/L[H+] l硫化物沉淀
工业催化剂的制备和成型
化工资源有效利用国家重点实验室 18
第二节 浸渍法
3、多次浸渍法
是将浸渍、干燥、焙烧重复进行多次的催化剂制备法。采用多 次浸渍法是基于下列的理由：一是需要浸渍的催化剂的活性组 分的溶解度较小，一次浸渍不能满足符合要求的负载量，需要 多次浸渍；二是为了避免含多组分的浸渍液由于各组分的竞争 吸附而造成的浸渍不均匀。在多次浸渍过程中，每次浸渍后都 需要进行干燥和焙烧，以使浸渍上去的组分转变为不可溶的物 质，避免下一次浸渍时重新溶解到浸渍液中。
第二章 工业催化剂的制备和成型
主要内容：
沉淀法 浸渍法 溶胶－凝胶法 离子交换法 热熔融法 混合法
固体催化剂的成型
催化剂的干燥与焙烧
化工资源有效利用国家重点实验室 1
第一节 沉淀法
沉淀法是以沉淀操作为基本特征的工业催化剂的制备方法， 是固体催化剂最常用的制备方法之一，主要用于制备催化剂
活性组分含量较高且价格相对较低的非贵金属、金属氧化物、
两种溶液分别加入各自的高温槽，然后经过热交换器预热至 50-60℃， 通过活塞开关并流到沉淀槽混合充分，pH值控制在 5-6，在不断搅拌
下形成无定形氢氧化铝沉淀。沉淀浆液送入到过滤器抽滤分离，沉淀
移入洗涤槽打浆洗涤，洗液为 50-60℃的蒸馏水，洗涤至不显 SO42-为 止。洗净的沉淀转入 pH值为 9.5-10.5，温度为 60℃左右的氨水溶液中 静置陈化 4 h，陈化后沉淀物又重复过滤、洗涤，至溶液的比电阻超 过200 Ω/cm，将沉淀物于100-110℃温度下干燥，制得半结晶状的假 -
（2）催化剂的制备 用预定量的铂化合物（如氯铂酸或氯铂酸铵），铼化合物（如高铼酸或 高铼酸铵），盐酸，去离子水混合成浸渍液，浸渍液与载体 γ-Al2O3的体 积比为1.0-2.5，在室温下浸渍12-24 h，然后过滤，60-80℃干燥6-10 h， 100-130℃干燥12-24 h，干空气中450-550℃，气剂比为500-1200的条件系 活化2-12 h，H2中400-500℃还原4 h，即得铂铼重整催化剂制备。
第二节 浸渍法
3、多次浸渍法
是将浸渍、干燥、焙烧重复进行多次的催化剂制备法。采用多 次浸渍法是基于下列的理由：一是需要浸渍的催化剂的活性组 分的溶解度较小，一次浸渍不能满足符合要求的负载量，需要 多次浸渍；二是为了避免含多组分的浸渍液由于各组分的竞争 吸附而造成的浸渍不均匀。在多次浸渍过程中，每次浸渍后都 需要进行干燥和焙烧，以使浸渍上去的组分转变为不可溶的物 质，避免下一次浸渍时重新溶解到浸渍液中。
第二章 工业催化剂的制备和成型
主要内容：
沉淀法 浸渍法 溶胶－凝胶法 离子交换法 热熔融法 混合法
固体催化剂的成型
催化剂的干燥与焙烧
化工资源有效利用国家重点实验室 1
第一节 沉淀法
沉淀法是以沉淀操作为基本特征的工业催化剂的制备方法， 是固体催化剂最常用的制备方法之一，主要用于制备催化剂
活性组分含量较高且价格相对较低的非贵金属、金属氧化物、
两种溶液分别加入各自的高温槽，然后经过热交换器预热至 50-60℃， 通过活塞开关并流到沉淀槽混合充分，pH值控制在 5-6，在不断搅拌
下形成无定形氢氧化铝沉淀。沉淀浆液送入到过滤器抽滤分离，沉淀
移入洗涤槽打浆洗涤，洗液为 50-60℃的蒸馏水，洗涤至不显 SO42-为 止。洗净的沉淀转入 pH值为 9.5-10.5，温度为 60℃左右的氨水溶液中 静置陈化 4 h，陈化后沉淀物又重复过滤、洗涤，至溶液的比电阻超 过200 Ω/cm，将沉淀物于100-110℃温度下干燥，制得半结晶状的假 -
（2）催化剂的制备 用预定量的铂化合物（如氯铂酸或氯铂酸铵），铼化合物（如高铼酸或 高铼酸铵），盐酸，去离子水混合成浸渍液，浸渍液与载体 γ-Al2O3的体 积比为1.0-2.5，在室温下浸渍12-24 h，然后过滤，60-80℃干燥6-10 h， 100-130℃干燥12-24 h，干空气中450-550℃，气剂比为500-1200的条件系 活化2-12 h，H2中400-500℃还原4 h，即得铂铼重整催化剂制备。
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法。
7、沉淀法的优缺点
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高。 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、
选择性不强。
8、沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法；
（4）亲和沉淀法；
（5）选择性沉淀法。 （6）复合盐沉淀法； （7）非离子型聚合物沉淀法； （8）聚电解质沉淀法；
对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫
酸铵饱和度为 58-65％之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始 沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。
11、盐析注意事项
选择适宜饱和度 采用分步盐析 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH 用磷酸
二、蛋白质的溶解特性
蛋白质是由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成的 两性高分子电解质，形成荷电区。 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向 内部折叠的趋势，形成疏水区。疏水性氨基酸含量 高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。
亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面， 形成亲水区。
因此，蛋白质由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区。
三、盐析
Salt induced precipitation
1、定义
概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等 生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉 淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的
早在1859年，中性盐盐析法就用于从血液中分离蛋 白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级 中使用，得到了比较满意的结果。
盐析注意事项
硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有 敏感作用，使用前用H2S处理 高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（pH=5.0左右），使 用前也需要用氨水调节至所需pH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意 固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化 已考虑在表中； 盐析后一般放臵半小时至一小时，待沉淀完全后才过 滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种 情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心 速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较 低浓度硫酸铵溶液。
2、盐析法机理
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量
盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化 力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失， 使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。
（ 2 ）破坏水化膜，暴露出憎水区域， 由于憎水
区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越 易沉淀。 白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力 降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集 而沉淀。
饱和度的概念：
以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和溶解度 是767g/L定义为100%饱和度。
目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸
铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。
对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度
都小于 0.l mg／L，通常为兼顾收率与纯度， 饱和度的操作范围在40%-80%之间。
5、沉淀法的步骤
① 首先加入沉淀剂; ② 沉淀剂的沉化，促进粒子生长； ③ 离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和控制条件对产物的纯度、 收率和沉淀物的形状都有很大影响。
6、沉淀法的应用
沉淀法不仅可以用于实验室中；
也可广泛用于生产的制备过程。
因其不需专门设备，且易于放大，是分离纯化生
物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方
pH值
两种蛋白质的相对溶解 度会随pH而变化很大；
等电点附近有极小值
pH
PH
pH值
在进行盐折时，必 须控制pH 图中直线都相互平 行
Ks β
பைடு நூலகம்
2）温度的影响
在低离子强度或纯水中，蛋白
质溶解度在一定范围内随温度 增加而增加。 但在高盐浓度下，蛋白质、酶 和多肽类物质的溶解度随温度 上升而下降。 在一般情况下，蛋白质对盐析 温度无特殊要求，可在室温下 进行，只有某些对温度比较敏 感的酶要求在0-4℃进行。 β随温度升高减小 Ks不随温度而变
缓冲液 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应 该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶 解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。 盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放臵一段时间。 为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢， 一般可用超滤
则上式成为
（用浓度代替离子强度）
lgS= β－Ｋs m
(
式中m为盐的摩尔浓度.
8、用盐析法分离蛋白质的二种方法
盐析法分为两类， 第一类叫β分段盐析法，在一定离子强度下通过改 变pH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及 温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度 小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化 和结晶； 第二种叫Ks分段盐析法，在一定pH和温度下通过改 变离子强度实现，（固定pH, 温度，改变盐浓 度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感， 易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液。
3）蛋白质浓度
沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度 有关。 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会 发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。 在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作 用比较少，但回收率会降低。 因此需要在两者之间进行适当选择。 分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一 点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。 一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL～30mg/mL。
12、盐析法特点
1. 2.
3.
4.
成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得 到保持生物活性的纯化蛋白质。 分离效果不理想，通常只是作为初步的分离 纯化，还需要结合其它的纯化方法。
四、等电点沉淀法
isoelectric point precipitation
第二章
沉淀法
通过本章学习应掌握以下内容
1. 什么是沉淀法？ 2. 沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？
3. 常用的沉淀方法包括哪些？
4. 何谓盐析？其原理是什么？ 5. 常用的盐是什么？影响盐析的主要因素有哪些？ 6. 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 7. 影响有机溶剂沉淀的主要因素有哪些？
8. 等电点沉淀的原理是什么？
每一段盐析静置之后都要离心获得沉淀，透析并检测活
性。
比如实验中的活性物质主要在60%-80%盐析出来，在以后 的实验中，就可以首先进行0%-60%的硫酸铵沉淀，这段 沉淀物可以抛弃（去除大多数杂质）；然后进行60%80%的硫酸铵沉淀，这段沉淀物含有大量目的蛋白质， 将其收集进行下一步纯化工作。
9、盐析用盐量的确定---饱和度
3、沉淀法的原理
生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些条件就
是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都 会破坏溶液的稳定性。
沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，
控制溶液中各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的
溶解度不同而达到分离的目的。
溶剂组分的改变、改变溶液的pH值、离子强度和极性都会
蛋白质溶解度与盐浓度的关系Cohn经验式
㏒ S=β-ＫsＩ
S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度 I=1/2∑mizi2 ,mi—离子 i的摩尔浓度；Zi—所带电荷 β—常数，与温度、pH和蛋白质种类有关，与盐的种类无 关； Ks—盐析常数，与温度和pH无关，但与蛋白质和盐的种类 有关。
有时为简单计，也可以用浓度代替离子强度，
一、概述
1、沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度 降低而形成无定形固体沉淀的过程。 2、沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成 分，初步纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一 步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前 仍广泛应用在工业上和实验室中。
5、盐析常用的盐
盐析中常用盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂
（1） 价廉 ；
（2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来； （3） 硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好；
（4） 不易引起蛋白质变性。
6、盐析操作(加盐方式）
硫酸铵的加入有以下几种方法： 1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情 况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入， 并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；
4、盐析用盐选择原则
盐析作用要强
盐析用盐需有较大的溶解度
盐析用盐必须是惰性的
来源丰富、经济
在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有 一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作 用较强，半径大的低价离子作用较弱。 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ 阴离子的影响大于阳离子
使溶质的溶解度产生明显的改变。
4、沉淀法的操作
沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不 溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉淀 物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透 析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小 时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤 通常按三步进行：
（ 3 ）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋
7、沉淀法的优缺点
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高。 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、
选择性不强。
8、沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法；
（4）亲和沉淀法；
（5）选择性沉淀法。 （6）复合盐沉淀法； （7）非离子型聚合物沉淀法； （8）聚电解质沉淀法；
对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫
酸铵饱和度为 58-65％之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始 沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。
11、盐析注意事项
选择适宜饱和度 采用分步盐析 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH 用磷酸
二、蛋白质的溶解特性
蛋白质是由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成的 两性高分子电解质，形成荷电区。 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向 内部折叠的趋势，形成疏水区。疏水性氨基酸含量 高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。
亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面， 形成亲水区。
因此，蛋白质由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区。
三、盐析
Salt induced precipitation
1、定义
概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等 生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉 淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的
早在1859年，中性盐盐析法就用于从血液中分离蛋 白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级 中使用，得到了比较满意的结果。
盐析注意事项
硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有 敏感作用，使用前用H2S处理 高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（pH=5.0左右），使 用前也需要用氨水调节至所需pH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意 固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化 已考虑在表中； 盐析后一般放臵半小时至一小时，待沉淀完全后才过 滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种 情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心 速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较 低浓度硫酸铵溶液。
2、盐析法机理
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量
盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化 力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失， 使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。
（ 2 ）破坏水化膜，暴露出憎水区域， 由于憎水
区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越 易沉淀。 白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力 降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集 而沉淀。
饱和度的概念：
以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和溶解度 是767g/L定义为100%饱和度。
目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸
铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。
对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度
都小于 0.l mg／L，通常为兼顾收率与纯度， 饱和度的操作范围在40%-80%之间。
5、沉淀法的步骤
① 首先加入沉淀剂; ② 沉淀剂的沉化，促进粒子生长； ③ 离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和控制条件对产物的纯度、 收率和沉淀物的形状都有很大影响。
6、沉淀法的应用
沉淀法不仅可以用于实验室中；
也可广泛用于生产的制备过程。
因其不需专门设备，且易于放大，是分离纯化生
物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方
pH值
两种蛋白质的相对溶解 度会随pH而变化很大；
等电点附近有极小值
pH
PH
pH值
在进行盐折时，必 须控制pH 图中直线都相互平 行
Ks β
பைடு நூலகம்
2）温度的影响
在低离子强度或纯水中，蛋白
质溶解度在一定范围内随温度 增加而增加。 但在高盐浓度下，蛋白质、酶 和多肽类物质的溶解度随温度 上升而下降。 在一般情况下，蛋白质对盐析 温度无特殊要求，可在室温下 进行，只有某些对温度比较敏 感的酶要求在0-4℃进行。 β随温度升高减小 Ks不随温度而变
缓冲液 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应 该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶 解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。 盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放臵一段时间。 为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢， 一般可用超滤
则上式成为
（用浓度代替离子强度）
lgS= β－Ｋs m
(
式中m为盐的摩尔浓度.
8、用盐析法分离蛋白质的二种方法
盐析法分为两类， 第一类叫β分段盐析法，在一定离子强度下通过改 变pH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及 温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度 小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化 和结晶； 第二种叫Ks分段盐析法，在一定pH和温度下通过改 变离子强度实现，（固定pH, 温度，改变盐浓 度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感， 易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液。
3）蛋白质浓度
沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度 有关。 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会 发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。 在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作 用比较少，但回收率会降低。 因此需要在两者之间进行适当选择。 分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一 点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。 一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL～30mg/mL。
12、盐析法特点
1. 2.
3.
4.
成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得 到保持生物活性的纯化蛋白质。 分离效果不理想，通常只是作为初步的分离 纯化，还需要结合其它的纯化方法。
四、等电点沉淀法
isoelectric point precipitation
第二章
沉淀法
通过本章学习应掌握以下内容
1. 什么是沉淀法？ 2. 沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？
3. 常用的沉淀方法包括哪些？
4. 何谓盐析？其原理是什么？ 5. 常用的盐是什么？影响盐析的主要因素有哪些？ 6. 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 7. 影响有机溶剂沉淀的主要因素有哪些？
8. 等电点沉淀的原理是什么？
每一段盐析静置之后都要离心获得沉淀，透析并检测活
性。
比如实验中的活性物质主要在60%-80%盐析出来，在以后 的实验中，就可以首先进行0%-60%的硫酸铵沉淀，这段 沉淀物可以抛弃（去除大多数杂质）；然后进行60%80%的硫酸铵沉淀，这段沉淀物含有大量目的蛋白质， 将其收集进行下一步纯化工作。
9、盐析用盐量的确定---饱和度
3、沉淀法的原理
生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些条件就
是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都 会破坏溶液的稳定性。
沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，
控制溶液中各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的
溶解度不同而达到分离的目的。
溶剂组分的改变、改变溶液的pH值、离子强度和极性都会
蛋白质溶解度与盐浓度的关系Cohn经验式
㏒ S=β-ＫsＩ
S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度 I=1/2∑mizi2 ,mi—离子 i的摩尔浓度；Zi—所带电荷 β—常数，与温度、pH和蛋白质种类有关，与盐的种类无 关； Ks—盐析常数，与温度和pH无关，但与蛋白质和盐的种类 有关。
有时为简单计，也可以用浓度代替离子强度，
一、概述
1、沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度 降低而形成无定形固体沉淀的过程。 2、沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成 分，初步纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一 步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前 仍广泛应用在工业上和实验室中。
5、盐析常用的盐
盐析中常用盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂
（1） 价廉 ；
（2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来； （3） 硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好；
（4） 不易引起蛋白质变性。
6、盐析操作(加盐方式）
硫酸铵的加入有以下几种方法： 1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情 况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入， 并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；
4、盐析用盐选择原则
盐析作用要强
盐析用盐需有较大的溶解度
盐析用盐必须是惰性的
来源丰富、经济
在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有 一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作 用较强，半径大的低价离子作用较弱。 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ 阴离子的影响大于阳离子
使溶质的溶解度产生明显的改变。
4、沉淀法的操作
沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不 溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉淀 物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透 析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小 时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤 通常按三步进行：
（ 3 ）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋